DACH1對人肺腺癌細胞增殖、侵襲和凋亡的抑制作用*

余俊杰，　王建軍，　翟　偉，　趙　亮，　吳　東

1華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢中心醫(yī)院胸外科，武漢　4300142華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院胸外科，武漢　430022

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論著

DACH1對人肺腺癌細胞增殖、侵襲和凋亡的抑制作用*

余俊杰1，2，王建軍2，翟偉2△，趙亮1，吳東2

1華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢中心醫(yī)院胸外科，武漢4300142華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院胸外科，武漢430022

目的研究DACH1在肺癌組織及配對癌旁組織中的表達情況，以及對人肺腺癌細胞增殖、侵襲和凋亡的作用。方法收集46例經(jīng)病理學診斷為肺癌患者的組織標本，選取腫瘤組織并以配對癌旁組織為對照，應用實時熒光定量PCR檢測腫瘤組織與配對癌旁組織標本中DACH1 mRNA表達情況；采用免疫組織化學法檢測兩組標本中DACH1蛋白的表達情況。使用siRNA干擾技術(shù)抑制人肺腺癌A549細胞系中DACH1的表達，采用MTT法觀察其對腫瘤細胞增殖的影響，Transwell小室法觀察腫瘤細胞侵襲的變化，采用流式細胞術(shù)檢測對細胞系誘導凋亡的作用。結(jié)果實時熒光定量PCR測得DACH1 mRNA在肺癌組織中表達下降，免疫組織化學檢測結(jié)果顯示肺癌組織中DACH1蛋白表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義。siRNA干擾A549細胞DACH1的表達后，MTT法顯示，si-DACH1組細胞增殖能力明顯增強；Transwell小室法顯示si-DACH1組細胞侵襲能力明顯增強，流式細胞術(shù)顯示，si-DACH1組細胞自發(fā)凋亡率明顯降低。結(jié)論DACH1在肺腺癌組織中表達減少，在肺腺癌中起到抑癌基因的作用，并有望成為肺癌治療的新靶點。

肺腺癌；DACH1；增殖；侵襲；凋亡

肺癌是人類常見的惡性腫瘤之一，近年來，其發(fā)病率呈逐步上升趨勢，嚴重威脅人類的健康和生命[1]。盡管目前各種診療手段不斷提高，但約80%臨床確診為肺癌的患者來醫(yī)院就診時就已經(jīng)處于腫瘤晚期，有超過一半的患者已經(jīng)存在遠處轉(zhuǎn)移而無法手術(shù)根治，或合并有不適合手術(shù)的疾病而無法接受手術(shù)[2]。即使接受手術(shù)根治、化療、放療以及個體化治療，其中大部分也將最終發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，遠期生存率普遍較低。近年來，DACH1在腫瘤中的作用越來越受到關(guān)注，已經(jīng)有研究證明在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、前列腺癌、腎透明細胞癌和胃癌中有DACH1表達的改變[3-4]。對于肺癌中是否存在DACH1 mRNA以及蛋白表達的改變值得研究。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

A549細胞(美國ATCC公司)、高糖DMEM培養(yǎng)液(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，美國Hyclone公司)、胎牛血清(FBS，美國Gibco公司)、噻唑藍(MTT，美國Amresco公司)、Transwell小室(美國Corning公司)、基質(zhì)膠(Matrigel，美國BD公司)、Annexin Ⅴ-FITC/PI試劑盒(上海貝博公司)、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(日本TaKaRa公司)、兔抗人DACH1多克隆抗體、HRP標記的二抗(美國Abcam公司)。

1.2標本收集

46例病例均來源于武漢協(xié)和醫(yī)院胸外科2012年3月～2013年6月期間接受外科手術(shù)治療的肺腺癌患者，所有患者術(shù)前均未接受化療和(或)放療等抗腫瘤治療，所有患者術(shù)后均經(jīng)病理證實為原發(fā)性肺腺癌，臨床病理資料完整可靠。病理標本分別取自術(shù)中切除的新鮮肺癌組織和癌旁組織(距腫瘤邊緣3 cm以內(nèi)的肺組織)兩部分配對，所有標本分兩份，其中一份標本快速冰凍保存于-80℃冰箱中，直至用于實時熒光定量PCR檢測mRNA水平；另一份標本經(jīng)10%甲醛溶液固定后制作成蠟塊，標準條件存放，此部分標本用于免疫組織化學法檢測DACH1蛋白的表達。

1.3實時熒光定量PCR檢測腺癌組織及癌旁組織DACH1 mRNA表達

提取RNA后行cDNA的合成，應用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒行熒光定量PCR反應。DACH1上游引物序列：5′-CTTGTCAGAGGGAAGGGTGG-3′，下游引物序列：5′-GCACTGTTTGCCGCTTTACTT-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物序列：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物序列：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。反應體系為：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火50 s，72°C延伸45 s，行40個循環(huán)。系統(tǒng)自動檢測熒光，得出Ct(Cycle Threshold)值。

1.4免疫組織化學法檢測腺癌組織及癌旁組織DACH1蛋白表達

組織固定及石蠟包埋后切片，血清封閉后一抗孵育，DACH1多克隆抗體濃度為1∶100，于4℃冰箱中保存過夜，二抗37℃孵育45 min后行DAB顯色，復染脫水后封片，光學顯微鏡下觀察拍照。

1.5siRNA技術(shù)干擾A549細胞DACH1的表達

DACH1基因siRNA表達載體由上海吉凱公司構(gòu)建，設(shè)計DACH1正義序列鏈：5′-AAGGCCTCCTAAGAGGACTCA-3′，陰性對照正義序列鏈：5′-GACTTCATAAGGCGCATGC-3′。按照Lipofectamine 2000說明書轉(zhuǎn)染細胞72 h后行Western blot及免疫熒光測siRNA干擾效果。

1.6Western blot及免疫熒光測siRNA干擾效果

分別將兩組轉(zhuǎn)染后細胞加入裂解液中進行研磨，超聲后離心取上清進行蛋白定量，每組加樣40 μg蛋白進行凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜。脫脂牛奶封閉后一抗(1∶500)孵育過夜，HRP標記的二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，用ECL化學發(fā)光劑在凝膠成像分析系統(tǒng)進行成像及定量分析。

分別將兩組轉(zhuǎn)染后細胞進行爬片，多聚甲醛固定后，0.01%Triton X-100破膜，室溫下1%胎牛血清封閉30 min，加一抗(1∶500)4℃孵育過夜；PBS洗3遍每次5 min；Cy3-羊抗兔二抗(1∶50)室溫下暗盒中孵育2 h，DAPI染核后封片，熒光顯微鏡成像。

1.7MTT實驗

轉(zhuǎn)染72 h后將A549細胞以1.0×105/mL密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100 μL，分別于接種后1、2、3、4 d進行MTT檢測。每孔加20 μL MTT(5 mg/mL)，混勻，37℃培養(yǎng)4 h，吸棄上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜，振蕩10 min，紫外分光光度計490 nm波長測各孔吸光度(A)值，每孔設(shè)6個復孔。

1.8細胞侵襲實驗

Matrigel稀釋液(5 mg/L)包被Transwell小室的上室面，4℃干燥，PBS漂洗后放入預先加有600 μL含10%FBS的培養(yǎng)液內(nèi)，隨后在小室內(nèi)加入100 μL A549細胞懸液，1.0×104/孔，37℃培養(yǎng)20 h后取出小室，棉簽擦去上室面細胞后固定，0.1%結(jié)晶紫染色后顯微鏡下行細胞計數(shù)。

1.9Annexin Ⅴ-FITC/PI法檢測凋亡率

用不含EDTA的胰酶消化細胞后離心收集細胞，冷PBS洗滌細胞2次，離心后用400μL Annexin Ⅴ結(jié)合液重懸細胞，細胞濃度為1×106/mL。加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC染色液，4℃避光孵育15 min，加入10 mL PI 4℃避光孵育5 min，用流式細胞儀檢測。

1.10統(tǒng)計學分析

應用SPSS 14.0軟件進行統(tǒng)計分析，兩組數(shù)據(jù)均數(shù)的比較采用t檢驗進行分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1DACH1在肺癌組織與在癌旁組織中的表達

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，46例癌組織中DACH1相對于GAPDH的ΔCt值為(6.18±0.42)，癌旁組織中其ΔCt值為(3.00±0.23)，計算2-ΔΔCt為0.43倍，即癌組織中DACH1基因mRNA含量為癌旁組織中的0.43倍，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。免疫組織化學結(jié)果顯示，肺癌組織中IOD/area值為(0.067 1±0.005 8)，癌旁組織中IOD/area值為(0.151 2±0.012 8)，二者之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1)。該結(jié)果顯示癌組織中DACH1 mRNA與蛋白表達均低于癌旁組織。

A：癌旁組織；　B：肺癌組織圖1　肺癌組織與癌旁組織中DACH1的表達(免疫組織化學染色，×100)Fig.1 Expression of DACH1 in lung adenocarcinomas and the matched adjacent normal tissues(IHC Staining，×100)

2.2肺腺癌患者臨床參數(shù)與DACH1 mRNA的關(guān)系

根據(jù)46例肺腺癌標本的mRNA檢測結(jié)果，將患者以mRNA的中位數(shù)進行分類，23例為高表達，23例為低表達。分組結(jié)果顯示DACH1與腫瘤大小及疾病分期存在關(guān)聯(lián)，與吸煙狀態(tài)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)性(表1)。

表1　肺腺癌患者臨床參數(shù)與DACH1 mRNA的關(guān)系

2.3siRNA干擾A549細胞DACH1表達

轉(zhuǎn)染A549細胞72 h后，行免疫熒光檢測DACH1的表達，結(jié)果顯示si-DACH1組細胞的DACH1表達明顯較對照組減少(圖2A)；RT-PCR及Western bolt檢測也顯示si-DACH1組細胞的DACH1表達明顯較對照組減少(圖2B)。Western blot檢測結(jié)果顯示，對照組相對灰度值為(1.00±0.11)，si-DACH1組灰度值為(0.34±0.09)，si-DACH1組的DACH1表達明顯較對照組減少。值得注意的是，在A549細胞中，DACH1在胞質(zhì)及核內(nèi)均有表達，胞質(zhì)表達較核內(nèi)明顯，我們考慮與細胞系的差異性有關(guān)。

A：免疫熒光檢測DACH1表達(×400);B：左RT-PCR檢測DACH1 mRNA表達，右Western blot檢測DACH1蛋白表達圖2　si-DACH1抑制A549細胞DACH1的表達Fig.2 Inhibited DACH1 expression in A549 cells transfected with si-DACH1

2.4DACH1沉默對肺腺癌細胞增殖的影響

MTT結(jié)果顯示，si-DACH1組A549細胞的增殖能力明顯增強(圖3)。在1、2、3、4 d，對照組的吸光度值分別為(0.34±0.04)、(0.47±0.05)、(0.78±0.07)、(1.33±0.06)，si-DACH1組的吸光度值分別為(0.35±0.06)、(0.62±0.05)、(1.07±0.07)、(1.84±0.06)，差異均具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

2.5DACH1沉默對肺腺癌細胞侵襲能力的影響

A549細胞轉(zhuǎn)染DACH1 siRNA 72 h后，通過Transwell小室侵襲實驗比較兩組細胞侵襲能力，結(jié)果顯示si-DACH1組的侵襲細胞率為(65.2±1.5)%，明顯高于對照組(28.2±1.1)%(P<0.05，圖4)，提示DACH1 siRNA具有增強A549細胞侵襲的作用。

圖3　兩組細胞增殖能力的比較Fig.3 Comparison of the proliferation of A549 cells between the two groups

A：對照組；B：si-DACH1組圖4　兩組細胞侵襲能力的比較(×100)Fig.4 Comparison of the invasion of A549 cells between the two groups(×100)

2.6DACH1沉默對肺腺癌細胞凋亡的影響

兩組細胞用Annexin Ⅴ-FITC/PI染色，經(jīng)流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，對照組細胞凋亡率為(3.84±0.52)%，si-DACH1組細胞凋亡率為(1.42±0.61)%，兩組凋亡率差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖5)。表明DACH1的沉默可明顯降低肺腺癌細胞的自發(fā)凋亡。

A：對照組B：si-DACH1組圖5　兩組細胞自發(fā)凋亡的比較Fig.5 Comparison of the spontaneous apoptosis of A549 cells between the two groups

3　討論

DACH1是近年來發(fā)現(xiàn)的與多種腫瘤密切相關(guān)的抑癌基因之一，DACH1通過DS域參與相關(guān)信號通路，從而調(diào)節(jié)細胞的增殖和分化，其低表達提示預后不良。目前研究結(jié)果顯示，DACH1在人乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌等腫瘤中表達降低，并與腫瘤類型、病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[5-6]。

DACH1通過直接結(jié)合到細胞周期蛋白D1啟動子區(qū)域并減少癌基因誘導的細胞周期蛋白D1的表達。在乳腺癌中，DACH1通過調(diào)節(jié)細胞周期和干細胞重組因子，起到抑制腫瘤的作用[7]。DACH1通過DS域直接作用于DACH1靶基因的啟動子區(qū)域抑制Klf4、Nanog和Sox2的表達，阻礙乳腺腫瘤的生長并抑制干細胞增殖。DACH1也可抑制IL-8的表達和分泌從而抑制乳腺癌細胞的浸潤和全身轉(zhuǎn)移[7]。在前列腺癌中同樣觀察到DACH1水平的降低，DACH1增加AR活性而參與調(diào)控前列腺腫瘤的進展[8]。這些研究顯示出DACH1的多種調(diào)控作用以及對細胞活性及腫瘤發(fā)生的影響。

通過全基因組測序顯示，DACH1在非小細胞肺癌中表達明顯降低，提示其在肺癌中同樣存在抑癌作用的可能[9]。我們首先進行實時熒光定量PCR及免疫組化實驗，檢測結(jié)果顯示DACH1在肺腺癌組織中表達水平明顯降低，說明其可能參與肺癌的發(fā)生發(fā)展，其表達水平下降可能會失去對其他轉(zhuǎn)錄因子和靶基因的調(diào)控，從而失去對癌基因的轉(zhuǎn)錄抑制，肺癌細胞得以生長，也可能通過一個特定的細胞通路調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因。我們應用siRNA干擾技術(shù)沉默A549細胞DACH1的表達后，觀察到細胞增殖、侵襲明顯增強，細胞自發(fā)凋亡率明顯降低，說明DACH1的缺失可能導致細胞正常分化的失調(diào)，在肺癌的浸潤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮一定作用。以上結(jié)果表明，DACH1基因在肺腺癌發(fā)生發(fā)展過程中可能具有重要的作用，并有望成為肺腺癌治療的有效靶點，但具體調(diào)控機制還有待進一步研究。Han等[10]的研究顯示，DACH1的表達與CXCL5呈負相關(guān)，并證明DACH1對腫瘤的抑制作用是通過抑制CXCL5信號通路來完成，這對我們今后的研究方向具有一定借鑒作用。

DACH1表達缺失的肺癌患者是否也存在較差的預后還需要繼續(xù)臨床隨訪觀察。此外，在非小細胞肺癌中常常伴隨著極度活躍的EGFR突變基因，果蠅中與DACH1同源的DAC基因有抑制EGFR的作用[11-12]，DACH1能否通過抑制EGFR的功能而阻止腫瘤的進展，目前未見文獻報道，我們將在后續(xù)工作中進行深入研究。

[1]Ferro A，Peleteiro B，Malvezzi M，et al.Worldwide trends in gastric cancer mortality(1980-2011)，with predictions to 2015，and incidence by subtype[J].Eur J Cancer，2014，50(7)：1330-1344.

[2]Lyons G，Quadrelli S，Jordan P，et al.Clinical impact of the use of the revised International Association for the Study of Lung Cancer staging system to operable non-small-cell lung cancers[J].Lung Cancer，2011，74(2)：244-247.

[3]Popov V M，Wu K，Zhou J，et al.The Dachshund gene in development and hormone-responsive tumorigenesis[J].Trends Endocrinol Metab，2010，21(1)：41-49.

[4]Yan W，Wu K，Herman J G，et al.Epigenetic silencing of DACH1 induces the invasion and metastasis of gastric cancer by activating TGF-beta signalling[J].J Cell Mol Med，2014，18(12)：2499-2511.

[5]Wu K，Katiyar S，Li A，et al.Dachshund inhibits oncogene-induced breast cancer cellular migration and invasion through suppression of interleukin-8[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105(19)：6924-6929.

[6]Wu K，Jiao X，Li Z，et al.Cell fate determination factor Dachshund reprograms breast cancer stem cell function[J].J Biol Chem，2011，286(3)：2132-2142.

[7]Wu K，Li A，Rao M，et al.DACH1 is a cell fate determination factor that inhibits cyclin D1 and breast tumor growth[J].Mol Cell Biol，2006，26(19)：7116-7129.

[8]Popov V M，Zhou J，Shirley L A，et al.The cell fate determination factor DACH1 is expressed in estrogen receptor-alpha-positive breast cancer and represses estrogen receptor-alpha signaling[J].Cancer Res，2009，69(14)：5752-5760.

[9]Govindan R，Ding L，Griffith M，et al.Genomic landscape of non-small cell lung cancer in smokers and never-smokers[J].Cell，2012，150(6)：1121-1134.

[10]Han N，Yuan X，Wu H，et al.DACH1 inhibits lung adenocarcinoma invasion and tumor growth by repressing CXCL5 signaling[J].Oncotarget，2015，6(8)：5877-5888.

[11]段楚驍，付圣靈，付向?qū)?CK516、P63、TTF-1和CK8/18在NSCLC組織中的表達及意義[J].華中科技大學學報：醫(yī)學版，2015，44(2)：147-151,175.

[12]Mardon G，Solomon N M，Rubin G M.Dachshund encodes a nuclear protein required for normal eye and leg development in drosophila[J].Development，1994，120(12)：3473-3486.

(2016-03-11收稿)

DACH1 Suppresses the Proliferation，Invasion and Apoptosis of Human Lung Adenocarcinoma Cells

Yu Junjie1，2，Wang Jianjun2，Zhai Wei2△etal

1DepartmentofThoracicSurgery，WuhanCentralHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430014，China2DepartmentofThoracicSurgery，UnionHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430022，China

ObjectiveTo examine the expression of DACH1 mRNA and protein in lung tumor tissues and their adjacent normal tissues and the role of DACH1 in the proliferation，invasion and apoptosis of lung adenocarcinoma cells.MethodsThe expression of DACH1 mRNA was detected by real-time fluorescent quantitative PCR in lung adenocarcinomas(n=46)and the matched adjacent normal tissues(n=46).Immunohistochemistry was used to detect the expression of DACH1 protein.Small-interfering(si)RNA was used to inhibit the expression of DACH1 in A549 cells.After down-regulation of DACH1 with siRNA，the proliferation of A549 cells was evaluated by MTT assay，the invasive ability of cells by using Transwell chamber assay，and the cell apoptosis by flow cytometry.ResultsReal-time fluorescent quantitative PCR and immunohistochemistry showed that the levels of DACH1 mRNA and protein were significantly decreased in lung adenocarcinomas as compared with those in normal tissues.Down-regulation of DACH1 by siRNA resulted in a significant increase in the proliferation and invasion of A549 cells.Flow cytometry revealed that the spontaneous apoptosis was significantly decreased in A549 cells with down-regulation of DACH1.ConclusionThe expression of DACH1 was profoundly decreased in lung adenocarcinomas，indicating that DACH1 may serve as a tumor suppressor gene in lung adenocarcinomas and it is expected to become a new therapeutic target for lung cancer.

lung adenocarcinoma；DACH1；proliferation；invasion；apoptosis

，Corresponding author，E-mail:zw111@aliyun.com

R734.2

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.04.001

*湖北省自然科學基金資助項目(No.2013CF088)

余俊杰，男，1988年生，住院醫(yī)師，醫(yī)學碩士，E-mail:hbsyyjj@163.com