TNF-a-1 031，-238，-308基因多態(tài)性與卵巢早衰的關(guān)系

王雪金，羅湘閩

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TNF-a-1 031，-238，-308基因多態(tài)性與卵巢早衰的關(guān)系

王雪金，羅湘閩

目的探討腫瘤壞死因子(TNF)-a基因中-238,-1 031,-308位點(diǎn)多態(tài)性與卵巢早衰的關(guān)系。方法選擇200例卵巢早衰婦女和200例對照者作為研究對象，抽取外周血白細(xì)胞中的DNA，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)分析TNF-a基因中-238G/A、-1 031T/C、-308G/A位點(diǎn)多態(tài)性，采用卡方檢驗(yàn)對不同基因型之間的差異進(jìn)行比較。結(jié)果卵巢早衰組和對照組中TNF-a-238位點(diǎn)和TNF-a-1 031位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。卵巢早衰組中TNF-a-308位點(diǎn)的G/G基因型頻率高于對照組(90%vs82.5%，P<0.05),且2組間等位基因頻率差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論TNF-a基因中-308位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性可能與卵巢早衰的發(fā)生存在相關(guān)性。

腫瘤壞死因子類； 腫瘤壞死因子α； 多態(tài)現(xiàn)象，遺傳； 基因； 卵巢

在近代歷史中，普通女性自然絕經(jīng)的平均年齡一直保持在50～52歲，而40歲前的絕經(jīng)，人們將其定義為卵巢早衰或卵巢功能不全[1]。卵巢早衰是不孕癥的原因之一，表現(xiàn)為卵巢功能減退、卵巢對卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)低反應(yīng)性和雌二醇(estradiol，E2)水平降低，臨床表現(xiàn)為初潮正?；蜓舆t、第二性征發(fā)育正常的女性40歲前出現(xiàn)4～6月的閉經(jīng)，且≥2次(間隔至少4周)血清FSH水平升高(>40 IU/L)、雌激素水平降低[2]。因卵巢早衰伴隨生育能力的提早喪失，具有卵巢早衰風(fēng)險(xiǎn)的患者，如>30歲再懷孕，可能在受孕及維持妊娠到足月方面會遇到某些困難[3]。目前卵巢早衰的發(fā)生和發(fā)展沒有任何可早期辨別的癥狀或體征，通常在疾病的終末期才可確診，因此大部分患者在診斷卵巢早衰之前尚未懷孕[4]，故研究卵巢早衰的病因具有重要意義。卵巢早衰的病因涉及遺傳、環(huán)境、精神、感染、代謝、自身免疫以及一些醫(yī)源性因素等[5-6]，但大多數(shù)患者的病因仍不清楚，屬特發(fā)性卵巢早衰。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，卵巢早衰患者血清中的腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)水平低于正常對照組，推測TNF-a基因可能為易感基因[7-8]。本研究旨在探討TNF-a基因中-1 031，-238，-308位點(diǎn)多態(tài)性與卵巢早衰的關(guān)系。

1　對象和方法

1.1對象收集2013年1月-2015年6月就診于筆者科室的特發(fā)性卵巢早衰婦女200例為病例組，年齡(29.31±4.51)歲(18～39歲)，均為中國漢族。入選標(biāo)準(zhǔn)：40歲之前出現(xiàn)繼發(fā)性閉經(jīng)4～6月以上，≥2次血清FSH>40 IU/L，E2<15 pg/mL(2次間隔1月以上)。排除其他原因?qū)е碌穆殉补δ艿拖?，如染色體核型異常，全身免疫系統(tǒng)疾病、盆腔手術(shù)史、放化療史等明顯卵巢損害的因素。

另外收集同期就診的、因輸卵管因素導(dǎo)致不孕的患者200例作為對照組，年齡(28.56±4.12)歲(18～39歲)，月經(jīng)周期正常，女性基礎(chǔ)激素檢查均在正常范圍，無卵巢因素異常及全身免疫性疾病。2組間年齡差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所選患者均無血緣關(guān)系，所有研究對象均簽署知情同意書，該研究得到醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1主要試劑和儀器血液基因組DNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司)，PCR體系試劑(大連寶生物工程有限公司)，引物(上海生工公司合成)。超凈工作臺(蘇州蘇凈集團(tuán))，穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀(北京三恒多用公司)，PCR擴(kuò)增儀(2400或9600型，美國PE公司)，凝膠圖像分析儀(Del Doc1000型，美國PE公司)。

1.2.2血基因組DNA的提取所有研究對象均在清晨空腹抽取靜脈血約3 mL，置于抗凝真空管中，置-70 ℃冰箱保存。采用血基因組DNA提取試劑盒提取外周血白細(xì)胞中的DNA，將離心所得DNA樣本放置于-20 ℃冰箱中保存，備用。

1.2.3PCR擴(kuò)增引物序列由上海生工公司合成。

TNF-a-1 031T/C：擴(kuò)增長度為270 bp[9]。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃，5 min；變性95 ℃，30 s→退火55 ℃，30 s→延伸72 ℃，30 s，共35個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。

上游：5′-GGGGAGAACAAAAGGATAAG-3′

下游：5′-CCCCATACTCGACTTTCATA-3′

TNF-a 238G/A：擴(kuò)增長度為152 bp[10]。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃，4 min；變性94 ℃，30 s→退火60 ℃，30 s→延伸72 ℃，30 s，共35個循環(huán)；72 ℃再延伸2 min。

上游：5′-AGAAGACCCCCCTCGGAACC-3′

下游：5′-ATCTGGAGGAAGCGGTAGTG-3′

TNF-a-308G/A：擴(kuò)增長度為107 bp[9]。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃，5 min；變性95 ℃，1 min→退火56 ℃，30 s→延伸72 ℃，30 s，共35個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。

上游：5′-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT-3′

下游：5′-TCCTCCCTGCTCCGATTCCG-3′

1.2.4聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)分析TNF-a-1 031T/C的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BbsⅠ酶切，置37 ℃恒溫水浴箱過夜；TNF-a-238G/A的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶MspⅠ酶切，置37 ℃恒溫水浴箱1 h；TNF-a-308G/A的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ酶切，置37 ℃恒溫水浴箱16 h。所有酶切產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。采用卡方檢驗(yàn)分析基因型的分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。各種基因型和等位基因頻率用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算，計(jì)數(shù)資料用卡方檢驗(yàn)，對不同基因型之間的差異進(jìn)行分析，并計(jì)算比值比(OR)和95%的可信區(qū)間(95%CI)。P<0.05為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1基因型分析

2.1.1TNF-a-1 031T/C的限制性酶切分析TNF-a-1 031T/C的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BbsⅠ酶切，發(fā)現(xiàn)3種不同的基因型，分別為TT、TC和CC。TT型為野生型純合子，不能被酶切，電泳可見270 bp片段；CC型為突變型純合子，可被酶切，電泳可見159，111 bp片段；TC型為雜合子，可被酶切，電泳可見270，159，111 bp片段(圖1)。

2.1.2TNF-a-238G/A的限制性酶切分析TNF-a-238G/A的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶MspⅠ酶切，發(fā)現(xiàn)3種不同的基因型，分別為GG、GA、AA。GG基因型的擴(kuò)增產(chǎn)物可被酶切，電泳可見133 bp片段，另外1條片段19 bp，因電泳時超出凝膠范圍而不可見；GA基因型為雜合子，可見152，133 bp片段(19 bp不顯影)；AA基因型為純合子，擴(kuò)增產(chǎn)物未被切開，可見152 bp片段(圖2)。

2.1.3TNF-a-308G/A的限制性酶切分析

TNF-a-308G/A的PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶NcoⅠ酶切，發(fā)現(xiàn)3種不同的基因型，分別為GG、AA和GA。GG型為野生型純合子，被切為87和20 bp；AA型為突變型純合子，不能被切開(107 bp)；GA型為雜合子，被切為107，87和20 bp，其中20 bp處的條帶因電泳時超出凝膠范圍而不可見(圖3)。

2.2TNF-a基因型和等位基因分布情況將對照組中2個位點(diǎn)基因型進(jìn)行遺傳平衡檢驗(yàn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得樣本的實(shí)際基因型分布推導(dǎo)群體的理論基因型分布，經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)得出，TNF-a-1 031T/C、TNF-a-238G/A、TNF-a-308G/A位點(diǎn)所對應(yīng)的P值均>0.05，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，結(jié)果見表1。表明研究對象具有一定的人群代表性，無遺傳學(xué)偏差。

表1　對照人群TNF基因3個位點(diǎn)遺傳平衡檢驗(yàn)

表中數(shù)據(jù)為n(%).TNF:腫瘤壞死因子.

TNF-a-1 031T/C、TNF-a-238G/A、TNF-a-308G/A基因在卵巢早衰組和對照組中各基因型及等位基因的頻率分布如表2，TNF-a-1 031T/C基因中，卵巢早衰組TT基因型的頻率低于對照組(68%vs70%，P>0.05)，TC基因型和CC基因型的頻率均高于對照組，分別為(28%vs27.5%，P>0.05)和(4%vs2.5%，P>0.05)。其中T等位基因在卵巢早衰組和對照組的頻率中分別為82%，83.75%，而C等位基因在卵巢早衰組和對照組的頻率中分別為18%，16.25%，二者差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

TNF-a-238G/A基因在卵巢早衰組中GG基因型的頻率低于對照組(83%vs86%,P>0.05)，GA基因型和AA基因型的頻率均高于對照組，分別為(14.5%vs12.5%，P>0.05)和(2.5%vs1.5%，P>0.05)。其中G等位基因在卵巢早衰組和對照組的頻率中分別為90.25%，92.25%，而A等位基因在卵巢早衰組和對照組的頻率中分別為9.75%，7.75%，二者差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

TNF-a-308G/A在卵巢早衰組中GG基因型的頻率高于對照組(90%vs82.5%),且差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.029，OR=1.91，95%CI=1.06～3.44)，GA基因型和AA基因型的頻率均低于對照組，分別為(9.5%vs15.5%，P>0.05)和(0.5 %vs2%，P>0.05)。其中G等位基因在卵巢早衰組和對照組的頻率中分別為94.75%，87.83%，而A等位基因在卵巢早衰組和對照組的頻率中分別為5.25%，12.17%，且二者差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3　討　論

卵巢早衰患者可出現(xiàn)潮熱、出汗、性欲減退等更年期癥狀，可導(dǎo)致不孕，這些癥狀將嚴(yán)重影響患者的生育能力、生活質(zhì)量和家庭穩(wěn)定[11]。國內(nèi)外學(xué)者對卵巢早衰的病理生理進(jìn)行了大量的研究[12]，但其遺傳性機(jī)制仍不清楚[13-14]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，抗苗勒管激素(anti-Mullerian hormone，AMH)對于評估血清FSH輕度升高的仍有正常月經(jīng)來潮的婦女卵巢功能有重要意義，被認(rèn)為可聯(lián)合FSH診斷卵巢早衰[15-16]。所以當(dāng)AMH出現(xiàn)異常的時候，大部分患者已經(jīng)出現(xiàn)生育力的下降。本研究旨在發(fā)現(xiàn)卵巢早衰的易感基因，從而可以更早地發(fā)現(xiàn)卵巢早衰遺傳易感的患者，必要時可為患者提供前期的生育咨詢和健康指導(dǎo)。

表2　卵巢早衰組與對照組中TNF基因型及等位基因的頻率分布

n=200.表中病例組和對照組數(shù)據(jù)為n(%).TNF：腫瘤壞死因子.a：理論值<5，采用確切概率法.

TNF-a主要由內(nèi)毒素激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可殺傷腫瘤細(xì)胞，引起腫瘤壞死，而對正常組織細(xì)胞無毒性作用[17]，編碼TNF-a基因均位于高度多態(tài)的主要組織相容性復(fù)合物MHC3類抗原基因簇，定位于6p21.4。在啟動子區(qū)域有多個多態(tài)性基因位點(diǎn)，如-1 031(T/C)、-863(C/A)、-851(C/T)、-419(G/C)、-376(G/A)、-308(G/A)、-238(G/A)、-162(G/A)及-49(G/A)等。

研究發(fā)現(xiàn)，TNF-a基因啟動子區(qū)的SNP可以從轉(zhuǎn)錄水平上影響TNF的產(chǎn)生，從而引起不同個體之間TNF-a水平出現(xiàn)明顯差異，并參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展[18]。國內(nèi)外有研究發(fā)現(xiàn)，變應(yīng)性鼻炎等疾病與TNF-a-238位點(diǎn)多態(tài)性有相關(guān)性[19]，Gonzalez等發(fā)現(xiàn)，TNF-a-308位點(diǎn)基因多態(tài)性與Crohn’s病患者TNF-a水平升高及患病易感性有關(guān)[20]。Naz及王一峰等均在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，卵巢早衰組中血清TNF-a值低于對照組，且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[7-8]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，TNF-a-1 031(T/C)，-308(G/A)，-238(G/A)位點(diǎn)多態(tài)性與TNF-a水平變化有關(guān)[20-22]。但未見TNF-a基因多態(tài)性與卵巢早衰的關(guān)系的相關(guān)報(bào)道。本研究旨在探討TNF-a基因中-1 031，-238，-308位點(diǎn)多態(tài)性與卵巢早衰的關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示，卵巢早衰組和對照組中TNF-a-238位點(diǎn)和TNF-a-1 031位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。卵巢早衰組中TNF-a-308位點(diǎn)的GG基因型頻率高于對照組(90%vs82.5%，P<0.05)，且2組間等位基因頻率差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，由此得出，TNF-a-308G/A基因多態(tài)性可能與卵巢早衰的發(fā)生存在相關(guān)性，TNF-a-308G/A基因可能是卵巢早衰發(fā)病的易感因素。

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(編輯:何佳鳳)

Association of TNF-a-1 031，-238，-308 Gene Polymorphisms with Premature Ovarian Failure in Chinese Women

WANG Xuejin, LUO Xiangmin

Department of Reproductive Medicine, The Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Quanzhou 362000, China

ObjectiveTo investigate the relationships between tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) gene-1 031，-238，-308 polymorphisms with premature ovarian failure in Chinese women.MethodsTwo hundred with premature ovarian failure and two hundred healthy control women were compared in the study.TNF-a-1 031, -238, -308 gene polymorphisms were assayed by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP)．All statistical analyses were calculated with SPSS for Windows 16.0.ResultsThere were no significant differences in allele or genotype frequency of TNF-a-238 and TNF-a-1 031 between women with premature ovarian failure and control group(P>0.05).The homozygous GG genotype for the SNP-308G/A was significantly higher in patients with premature ovarian failure than in healthy controls (90%vs82.5%,P<0.05).The allele frequency of the TNF-α-308G was significantly higher in patients with premature ovarian failure patients than in healthy controls(P<0.05).ConclusionThe data suggested that the TNF-a-308 gene polymorphisms was associated with premature ovarian failure.

tumor necrosis factors; tumor necrosis factor-alpha; polymorphism, genetic; genes; ovary

2016-04-13

泉州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013Z108)

福建醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，泉州362000

王雪金(1983-)，女，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士

羅湘閩. Email: lxm@wuhansen.com

R339.22； R711.75； R711.6

A

1672-4194(2016)03-0167-05