閩產(chǎn)鉤吻資源分布及藥用部位的研究

石冬梅， 蘇燕評(píng)， 吳宏霞， 俞昌喜

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閩產(chǎn)鉤吻資源分布及藥用部位的研究

石冬梅1， 蘇燕評(píng)2， 吳宏霞3， 俞昌喜4

目的調(diào)查福建省鉤吻資源的分布情況，并確定鉤吻的最佳藥用部位。方法依據(jù)文獻(xiàn)記載和實(shí)地考察閩產(chǎn)鉤吻的生境與分布；正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化超聲提取鉤吻素子的工藝條件，采用高效液相色譜法測(cè)定鉤吻根、莖和葉中的鉤吻素子含量。結(jié)果閩產(chǎn)鉤吻資源主要集中分布于23°84′N～26°92′N、116°36′E～120°05′E、海拔800 m以下光照良好的山坡、路旁。超聲提取鉤吻素子的最佳條件為超聲功率250 W、時(shí)間20 min、溫度50 ℃、料液比1∶20。閩產(chǎn)鉤吻根和莖的鉤吻素子含量高，葉的含量較低。結(jié)論閩產(chǎn)鉤吻分布較廣，資源豐富；鉤吻的入藥部位以根和莖為佳。

福建； 鉤吻； 分布； 高效液相色譜； 藥用部位

鉤吻(GelsemiumelegansBenth.)為馬錢科胡蔓藤屬常綠木質(zhì)藤本植物，俗稱斷腸草、野葛、毒根、大茶藥，全草入藥[1]。我國(guó)對(duì)鉤吻的使用歷史悠久，《神農(nóng)本草經(jīng)》始有記載。民間一直應(yīng)用鉤吻原植物治療各類疼痛，尤其是慢性神經(jīng)性疼痛與癌性疼痛。生藥鉤吻中的主要成分鉤吻素子有顯著鎮(zhèn)痛和治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的功效，具有良好的成藥性[2-5]。目前鉤吻素子獲取的主要途徑就是從原植物中提取分離。因此，如何獲得鉤吻藥材、合理利用藥材，將其資源價(jià)值最大化，值得廣泛關(guān)注和深入研究。

從鉤吻中提取生物堿多采用煎煮法、熱回流等方法[6-8]。這些方法溶劑用量大、耗時(shí)長(zhǎng)，不利于鉤吻素子含量的快速檢測(cè)。陳志惠等比較了索氏回流、常規(guī)浸提、超聲波3種方法提取鉤吻總堿，以超聲波提取法得率最高[9]。本研究采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，優(yōu)化超聲提取鉤吻素子的工藝條件；采用高效液相色譜法測(cè)定福建省不同產(chǎn)區(qū)鉤吻的根、莖和葉的鉤吻素子含量，以確定鉤吻的最佳藥用部位，為鉤吻素子工業(yè)化生產(chǎn)提供藥材及質(zhì)量保證。

鉤吻在我國(guó)主要分布在浙江、福建、廣東、廣西、湖南、貴州、云南省等地，福建省野生鉤吻資源豐富[10]。為保證閩產(chǎn)鉤吻資源的可持續(xù)性利用，對(duì)閩產(chǎn)鉤吻進(jìn)行分布和生境的調(diào)查，比較人工栽培不同年限鉤吻中鉤吻素子的含量，為鉤吻藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(good agriculturing practice,GAP)的建設(shè)提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1藥材樣品2015年4-10月采于閩侯、永定、云霄和尤溪，并經(jīng)筆者鑒定為馬錢科胡蔓藤屬植物鉤吻。將不同產(chǎn)地的鉤吻藥材根、莖和葉分別收集干燥，粉碎，過(guò)3號(hào)篩，備用。

1.1.2藥品及試劑鉤吻素子對(duì)照品為本課題組前期提取分離精制而成，經(jīng)高效液相色譜法鑒定，純度為99.1%。甲醇(色譜純)及氯仿、95%乙醇、氨水(均為分析純)(中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑)；水為娃哈哈純凈水。

1.1.3儀器超聲波清洗器(KQ-500E型，昆山市超聲儀器有限公司)，高效液相色譜儀(1100LC型，美國(guó)Agilent公司)，電子天平(AR124CN型，奧豪斯儀器有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE5299，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)。

1.2方法

1.2.1鉤吻資源分布調(diào)查方法(1)文獻(xiàn)檢索調(diào)查：收集有關(guān)鉤吻的調(diào)查研究資料，了解閩產(chǎn)鉤吻的分布情況。(2)實(shí)地調(diào)查：咨詢相關(guān)方面專家、當(dāng)?shù)叵驅(qū)?，查看鉤吻標(biāo)本的采集記錄，確定調(diào)查地點(diǎn)和范圍，記錄鉤吻的生境。

1.2.2鉤吻素子含量測(cè)定

1.2.2.1色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)按照高效液相色譜法(《中華人民共和國(guó)藥典一部》2010版附錄ⅥD)測(cè)定。檢測(cè)波長(zhǎng)：256 nm；色譜柱：Phenomenex Kinetex EVO，250 mm×4.6 mm；流動(dòng)相：甲醇-水-氨水(55∶45∶0.05)，流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃。理論板數(shù)按鉤吻素子峰計(jì)算不低于5 000。對(duì)照品、鉤吻樣品及空白溶液的色譜圖見(jiàn)圖1。

1.2.2.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取鉤吻素子對(duì)照品適量，加甲醇制成0.400 0 g/L的溶液，搖勻即得。

1.2.2.3空白溶液的制備取0.8 mL的3% NaOH于表面皿中，過(guò)夜陰干，加20 mL氯仿，置具塞錐形瓶中，超聲提取20 min(功率250 W，頻率50 kHz，溫度50 ℃)，重復(fù)3次，合并提取液，抽濾，濾液旋蒸至干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移到10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得空白溶液。同樣條件下進(jìn)行檢測(cè)，與對(duì)照品比較，無(wú)溶劑干擾峰。

1.2.2.4供試品溶液的制備取藥材粉末(過(guò)3號(hào)篩)，60 ℃干燥4 h，精密稱取0.300 0 g，用0.8 mL 3% NaOH潤(rùn)濕，過(guò)夜陰干，置具塞錐形瓶中，加20 mL氯仿，超聲提取20 min(功率250 W，頻率50 kHz，溫度50 ℃)，重復(fù)3次，合并提取液，抽濾，濾液旋蒸至干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移到10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋到刻度，搖勻，濾過(guò)，即得。

1.2.2.5線性關(guān)系考察精密吸取對(duì)照品溶液0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，分別取10 μL注入高效液相色譜儀測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=10 932X+759，r=0.999 4，線性范圍為0.02～0.32 mg/mL(n=6)。

1.2.3超聲波提取鉤吻素子最佳工藝選擇分別采用甲醇、95%乙醇和氯仿超聲提取，按1.2.2的方法測(cè)定鉤吻素子的含量，比較鉤吻素子提取率，得適宜提取劑。為確定鉤吻素子的最佳提取工藝，以鉤吻素子的含量為考察指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法，以超聲提取時(shí)間、提取溫度、提取功率和料液比設(shè)計(jì)L9(34)4因素3個(gè)水平正交表(表1)。

表1　正交試驗(yàn)因素與水平考察

2　結(jié)　果

2.1閩產(chǎn)鉤吻資源分布文獻(xiàn)資料顯示，閩產(chǎn)鉤吻主要分布在云霄、平和、上杭、永定、連城、永春、仙游、同安、閩侯、霞浦、福安等地。依據(jù)文獻(xiàn)的記載及當(dāng)?shù)叵驅(qū)У闹敢x定9個(gè)地方作為鉤吻生境考察點(diǎn)(表2)。閩產(chǎn)鉤吻野生資源主要集中分布于23°84′N～26°92′N、116°36′E～120°05′E、海拔800 m以下光照充足的山地路邊或山坡灌木叢中，喜生活在腐殖質(zhì)或黃壤地帶。云霄、上杭、永泰、尤溪鉤吻分布較多，長(zhǎng)勢(shì)旺盛，直徑>3 cm的植株較常見(jiàn)，多呈片狀分布。龍巖、寧德一帶有人為采挖的破壞現(xiàn)象，儲(chǔ)量較以前減少。在調(diào)查野生資源過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)有人工栽培鉤吻，種植于大田和山坡，目前人工種植株約7萬(wàn)～8萬(wàn)株。

2.2超聲提取鉤吻素子的工藝優(yōu)化

2.2.1提取溶劑的選擇同一超聲條件下，氯仿對(duì)于鉤吻素子的提取率最高，因此選擇氯仿作為提取劑(圖2)。

2.2.2正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)鉤吻素子最佳提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果顯示，極差R的大小順序?yàn)镃>D>B>A，即影響鉤吻素子超聲提取因素的主次關(guān)系依次為提取功率>提取時(shí)間>提取溫度>料液比。4個(gè)因素中提取功率的影響最大，料液比的影響最小。超聲法從鉤吻中提取鉤吻素子的最佳工藝條件為C2D2B2A2，即提取功率250 W、時(shí)間20 min、溫度50 ℃、料液比1∶20(表3)。

表2　閩產(chǎn)鉤吻野生生境狀況

2.3不同產(chǎn)地鉤吻素子含量的測(cè)定測(cè)量4個(gè)產(chǎn)地鉤吻中鉤吻素子的含量顯示，鉤吻根中的含量最高，平均為0.40%；莖中的含量居中，平均為0.24%；葉子的含量最低，平均為0.03%(表4)。

2.4人工栽培株鉤吻素子含量的測(cè)定人工栽培鉤吻有1年生的種苗和分別種植于大田、山坡的同批3年生植株。1年生鉤吻種苗干燥根質(zhì)量?jī)H為1.605 g，莖為3.747 g，種苗根、莖中鉤吻素子的總量分別為3.691，4.871 mg。經(jīng)過(guò)3年的種植，3年生種植于大田和山坡的鉤吻根、莖的干質(zhì)量和鉤吻素子含量均比1年生增加，山坡種植鉤吻根、莖的干質(zhì)量增加到18.738，51.375 g，莖中鉤吻素子的總量高達(dá)87.338 mg，比1年生的種苗莖中的總量增加了17倍。3年生大田種植株莖的干質(zhì)量為43.470 g，鉤吻素子的含量為0.15%，干質(zhì)量和含量均略低于3年生山坡種植株(表5)。

表3　正交試驗(yàn)結(jié)果

表4　不同產(chǎn)地同一植株根、莖和葉中鉤吻素子的含量

表5　1年生和3年生藥材鉤吻素子的含量

3　討　論

福建省野生鉤吻資源主要集中分布于23°84′N～26°92′N、116°36′E～120°05′E、海拔800 m以下光照良好的山坡、路旁，呈點(diǎn)狀或片狀分布。腐殖質(zhì)土壤土層深厚，有機(jī)營(yíng)養(yǎng)高，有利于鉤吻的生長(zhǎng)。由于鉤吻可用于治療魚(yú)病和豬復(fù)壯[11]，野生鉤吻常被連根采挖，有些地區(qū)如龍巖上杭、永定，資源受到較大的破壞；閩東南地區(qū)在山坡開(kāi)墾種植果園時(shí)常將鉤吻除去，致使閩產(chǎn)鉤吻的分布范圍縮小，產(chǎn)量下降。為滿足日益擴(kuò)大獸藥的需求，閩西地區(qū)有小面積的人工種植鉤吻。

人工種植1年生鉤吻根中鉤吻素子的含量已高于0.2%、莖中的鉤吻素子含量也高于0.1%，但由于植株較小、質(zhì)量輕，鉤吻素子的總量較低；隨著生長(zhǎng)年限的增加，鉤吻根、莖的質(zhì)量增加，3年生山坡種植株莖中鉤吻素子的總量高達(dá)87.338 mg，比1年生植株莖的含量增加了17倍，鉤吻素子的含量呈上升趨勢(shì)。但由于目前人工栽培的年限較短，僅有1年生和3年生的藥材，無(wú)法獲得栽培時(shí)間更長(zhǎng)的樣品，鉤吻素子在鉤吻體內(nèi)的累積趨勢(shì)暫時(shí)無(wú)法獲知，需進(jìn)一步跟蹤研究。比較了同批分別種植于山坡和大田的植株，山坡種植株根、莖的干質(zhì)量以及鉤吻素子的含量均高于大田種植株，原因可能是鉤吻為蔓生性藤本植物，山坡種植株間距較寬，且排水優(yōu)于大田，生境更接近于鉤吻的野生狀態(tài)，因此產(chǎn)量和含量要優(yōu)于大田栽培株。建議鉤吻的人工種植選地為向陽(yáng)山坡、株距稍寬為宜。

超聲提取法相對(duì)于傳統(tǒng)的熱回流等方法具有簡(jiǎn)單、時(shí)間短、提取率高等特點(diǎn)，是天然藥物提取的一個(gè)發(fā)展趨勢(shì)。陳志惠等在超聲提取鉤吻總堿時(shí)設(shè)置提取溫度為70 ℃，由于氯仿的沸點(diǎn)為61 ℃，在實(shí)際操作中，用70 ℃氯仿超聲提取較困難，所以在提取溫度的水平上設(shè)置最高溫度為60 ℃。用超聲提取對(duì)不同產(chǎn)地的鉤吻根、莖和葉的鉤吻素子含量測(cè)定表明，閩產(chǎn)鉤吻的根、莖和葉中均含有鉤吻素子，這與陳衛(wèi)琳等報(bào)道閩產(chǎn)鉤吻葉中不含鉤吻素子不符[12]。鉤吻素子在鉤吻根中的含量最高，莖次之，葉子的含量最低。以云霄產(chǎn)鉤吻為例，根、莖、葉子中的含量分別為0.38%，0.21%，0.03%；根、莖中鉤吻素子的含量均比葉子高出7倍以上。鑒于葉子鉤吻素子含量低、采收困難及含大量葉綠素不利于提純等因素，鉤吻的入藥部位以根和莖為佳。

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(編輯:何佳鳳)

Geographical Distribution of Gelsemium elegans in Fujian Province and the Medicinal Value of the Parts of the Plant

SHI Dongmei1, SU Yanping2, WU Hongxia3, YU Changxi4

1. Department of Natural Medicine; 2. Department of Pharmacochemistry; 3. Experiment Center； 4. Department of Pharmacology,College of Pharmacy, Fujian Medical University, Fuzhou 350108, China

ObjectiveTo investigate the distribution ofGelsemiumelegansin Fujian province and assay the content of koumine from different parts ofGelsemiumelegansto determine the optimal medicinal parts.

MethodsLiterature research and field survey were both done to investigate the distribution; The ultrasonic extraction conditions of koumine were optimized by orthogonal test.HPLC analysis was performed to assay the content of koumine from roots, stems and leaves ofGelsemiumelegans.ResultsIn 23 84′N to 26 92′N and 116 36′E to 120 05′E were the main production areas ofGelsemiumelegansin Fujian province.Vertical level was under 800 m.The optimum ultrasonic extraction conditions were as follows: 250 W ultrasonic power, 20 min ultrasonic time, 50 ℃ temperature and 1∶20 solid-liquid ratio.The contents of koumine from roots and stems were higher than leaves.ConclusionFujian province has widespread distribution and rich amount of resource ofGelsemiumelegans.Medicinal parts ofGelsemiumelegansare roots and stems.

Fujian；Gelsemiumelegans; distribution; high pressure liquid chromatography; medicament portions

2016-01-13

福建省教育廳產(chǎn)學(xué)研項(xiàng)目(JA14132)

福建醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，福州3501081. 天然藥物學(xué)系；2. 藥物化學(xué)系；3. 實(shí)驗(yàn)中心；4. 藥理學(xué)系

石冬梅(1975-)，女，講師，理學(xué)碩士

俞昌喜. Email: changxiyu@fjmu.edu.cn

R931.71; R282.71; R284.1

A

1672-4194(2016)03-0159-05