類蘆根系抗氧化酶和植物螯合肽對(duì)Cd、Pb脅迫的應(yīng)答

羅潔文，李瑩，蘇爍爍，黃曉敏，周垂帆*. 福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350002，2. 海峽兩岸紅壤區(qū)水土保持協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 福州 350002

類蘆根系抗氧化酶和植物螯合肽對(duì)Cd、Pb脅迫的應(yīng)答

羅潔文1， 2，李瑩1， 2，蘇爍爍1， 2，黃曉敏1，周垂帆1， 2*
1. 福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350002，2. 海峽兩岸紅壤區(qū)水土保持協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 福州 350002

類蘆（Neyraudiarey naudiana）是中國(guó)南方金屬礦區(qū)最為常見(jiàn)的耐性植物，且能大量富集重金屬，是修復(fù)重金屬污染的潛能植物。為研究其對(duì)重金屬脅迫的應(yīng)答機(jī)制，采用營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)的方法研究了不同濃度（0、25、50、100 μmol·L-1）Cd、Pb處理24 h后，類蘆根系氧化損傷、抗氧化酶活性和非蛋白巰基化合物含量的變化。結(jié)果表明，在Cd、Pb脅迫下，類蘆根系H2O2和O2·-含量顯著增加，且伴隨有MDA含量的升高，當(dāng)Cd、Pb濃度為100 μmol·L-1時(shí)，MDA分別達(dá)到6.72和16.12 nmol·g-1，發(fā)生膜脂質(zhì)過(guò)氧化，造成植物氧化損傷。Pb脅迫下，SOD，POD活性隨著處理濃度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；Cd脅迫下SOD活性變化趨勢(shì)與Pb脅迫的相似，而POD活性呈下降趨勢(shì)。根系非蛋白巰基化合物含量檢測(cè)顯示，Cd、Pb處理下，GSH和PCs均呈先增加后下降的趨勢(shì)。綜合分析得出，類蘆根系對(duì)不同重金屬的不同濃度脅迫響應(yīng)不一，其能通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化酶活性和植物螯合肽等的合成水平，降低重金屬的毒性及其對(duì)植物的傷害，從而維持自身的穩(wěn)態(tài)。

鎘、鉛；類蘆；質(zhì)膜完整性；抗氧化酶；植物螯合肽

引用格式：羅潔文， 李瑩， 蘇爍爍， 黃曉敏， 周垂帆. 類蘆根系抗氧化酶和植物螯合肽對(duì)Cd、Pb脅迫的應(yīng)答［J］. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)， 2016， 25（6）: 1047-1053.

LUO Jiewen， LI Ying， SU Shuoshuo， HUANG Xiaomin， ZHUO Chuifan. Response of Antioxidant Enzymes and PCs in Root of Neyraudia reynaudiana to Cd， Pb Stress ［J］. Ecology and Environmental Sciences， 2016， 25（6）: 1047-1053.

植物修復(fù)技術(shù)具有不破壞土壤生態(tài)環(huán)境的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于清除土壤重金屬污染與實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。近年來(lái)，在植物修復(fù)中一些生物量大、生長(zhǎng)速度快、對(duì)污染物吸收能力較強(qiáng)但還達(dá)不到超富集植物標(biāo)準(zhǔn)的耐性植物備受關(guān)注。其中，類蘆（Neyraudiarey naudiana）是中國(guó)南方優(yōu)良的防風(fēng)固土綠化植物（蔡麗平等，2012），不僅可在重金屬礦廢棄地上較好生長(zhǎng)，且保持有較高的生物量，在重金屬?gòu)U棄地的惡劣環(huán)境下表現(xiàn)出較強(qiáng)的適應(yīng)性（楊期和等，2012）。有研究發(fā)現(xiàn)類蘆對(duì)重金屬Cd、Pb具有較強(qiáng)的富集能力（Deng et al.，2004），野外生長(zhǎng)的類蘆地上部分Pb含量可達(dá)773.5 mg·kg-1，生物富集系數(shù)的范圍為 0.34～1.51，高于普通植物富集系數(shù)（戴文嬌等，2008），說(shuō)明類蘆可用于Cd、Pb污染土壤的修復(fù)，但是目前有關(guān)類蘆對(duì)重金屬Cd、Pb的耐性機(jī)制研究并不多。

植物受到重金屬脅迫時(shí)，植物細(xì)胞產(chǎn)生多種活性氧（ROS），如超氧陰離子自由基（O2·-）、羥基自由基（OH·-）、過(guò)氧化氫（H2O2）等，其中H2O2若不能及時(shí)清除，就會(huì)轉(zhuǎn)化為毒性更大的分子，過(guò)量的活性氧能導(dǎo)致膜脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)和 DNA分子的氧化修飾與損傷等（王曉蓉，2013）。因此，研究自由基的產(chǎn)生、積累和代謝，能夠反映植物體在逆境條件下的氧化脅迫和應(yīng)激響應(yīng)狀態(tài)。植物可以通過(guò)提高或降低抗氧化酶系統(tǒng)以及合成谷胱甘肽（GSH）和植物螯合肽（PCs）等一類多肽對(duì)脅迫環(huán)境作出響應(yīng)，以消除 ROS或與重金屬離子螯合，在重金屬積累和解毒過(guò)程中發(fā)揮重要作用（宋相帝等，2011）。但是，植物不同部位的抗氧化酶活性以及非蛋白巰基化合物作用對(duì)不同重金屬的響應(yīng)不同，而根系是直接與土壤接觸，在土壤逆境條件下，它是植物最先感受逆境的器官，相較于植物地上部，根系是否擁有一套可增強(qiáng)對(duì)重金屬耐性的機(jī)制顯得更為重要。因此，研究根系對(duì)重金屬脅迫的響應(yīng)對(duì)于揭示植物抵抗重金屬脅迫的機(jī)理具有重要意義（Li et al.，2009）。鑒于此，為了更好地弄清類蘆對(duì)Pb、Cd的早期響應(yīng)，進(jìn)一步探討Cd、Pb脅迫對(duì)類蘆根系的毒害及解毒機(jī)理，本試驗(yàn)以南方水土保持先鋒植物——類蘆作為試驗(yàn)材料，研究不同濃度的Cd、Pb脅迫對(duì)類蘆根系的活性氧活力、質(zhì)膜完整性、抗氧化酶活性以及非蛋白巰基化合物等的影響，旨在明確類蘆根系對(duì)不同重金屬脅迫的應(yīng)答策略，試圖揭示植物對(duì)重金屬的耐受機(jī)制和解毒機(jī)理，以期為類蘆應(yīng)用于南方土壤重金屬污染修復(fù)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

類蘆種子購(gòu)自云南省昆明市某種子公司。2015 年9月種植于溫室大棚中，同年12月中旬選擇長(zhǎng)勢(shì)均一的類蘆幼株轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中，移植在泡沫板上并放置于500 mL超純水中培養(yǎng)2 d，并依次用1/2和完全Hoagland培養(yǎng)液在塑料盆中各培養(yǎng)4 d。培養(yǎng)期間晝、夜溫度分別為25 ℃、22 ℃，光照時(shí)間為16 h。

1.2試驗(yàn)方法

預(yù)培養(yǎng)10 d后，分別添加不同Cd、Pb，Cd以CdCl2，Pb以Pb（NO3）2的形式添加，處理濃度為0、25、50、100 μmol·L-1，每處理3次重復(fù)，處理24 h后取樣分析。處理期間營(yíng)養(yǎng)液pH維持在5.5左右，營(yíng)養(yǎng)液中KH2PO4的濃度設(shè)置為0.025 mmol·L-1以避免產(chǎn)生磷酸鉛沉淀（Huang et al.，2012）。

1.3分析測(cè)定項(xiàng)目

1.3.1H2O2和O2·-含量測(cè)定

H2O2含量測(cè)定參考Jasinski et al.（2008）的方法，用羥胺氧化反應(yīng)測(cè)定 O2·-含量（王愛(ài)國(guó)等，1990）。

1.3.2測(cè)定質(zhì)膜完整性

質(zhì)膜完整性檢驗(yàn)采用 Evans blue染色的方法（Wang et al.，2005），將Pb、Cd處理后的植物根系（2 cm）在0.5 mmol·L-1冷凍的CaCl2（pH 4.5）溶液中浸泡5 min 后，洗凈吸干，將根浸泡在4 mL伊文思藍(lán)溶液（0.025%伊文斯藍(lán)溶于100 μmol·L-1pH=5.6的 CaCl2溶液中）中30 min，取出后反復(fù)用蒸餾水沖洗，在蒸餾水中浸泡15 min，然后在光學(xué)顯微鏡下觀察拍照，以測(cè)定原生質(zhì)膜的完整性。

1.3.3抗氧化酶以及MDA含量測(cè)定

參考李合生等（2000）的方法測(cè)定，丙二醛（MDA）測(cè)定采用硫代巴比妥酸法，超氧化物歧化酶（SOD）采用氮藍(lán)四唑法，過(guò)氧化物酶（POD）采用愈創(chuàng)木酚法。

1.3.4非蛋白質(zhì)態(tài)巰基總量、谷胱甘肽以及植物螯合肽含量的測(cè)定

非蛋白質(zhì)態(tài)巰基總量（TNP-SH）參照De Vos et al.（1992）的方法測(cè)定；谷胱甘肽（GSH）含量參照張宗申等（2001）的方法測(cè)定，植物螯合肽（PCs）含量等于非蛋白巰基含量與 GSH含量的差值，即用差減法計(jì)算（Alfadul et al.，2013）。

1.4數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)為3次重復(fù)樣品測(cè)定結(jié)果的平均值（含標(biāo)準(zhǔn)差）。運(yùn)用Excel 2007和SPSS 18進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和多重比較，用 SNK法對(duì)不同處理間數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，以P＜0.05表示不同處理間數(shù)據(jù)差異顯著，并用Origin 9.2作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1Cd、Pb脅迫對(duì)類蘆的氧化脅迫作用

圖1　不同濃度Cd、Pb處理下類蘆根系的H2O2和O2·-含量Fig. 1　The content of H2O2and O2·—in roots of Neyraudia reynaudiana at different concentrations of Cd， Pb

植物受到重金屬脅迫時(shí)，體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧將大大增加，當(dāng)超出機(jī)體抗氧化防御能力時(shí)，會(huì)在機(jī)體內(nèi)積累并導(dǎo)致植物的氧化損傷（王曉蓉，2013）。由圖1（A）可見(jiàn)，類蘆根系的H2O2含量隨著Cd、Pb濃度的增加呈顯著上升的趨勢(shì)（P＜0.05），表明溶液中的Cd、Pb對(duì)H2O2具有明顯的誘導(dǎo)效應(yīng)，類蘆根系受到了Cd、Pb的脅迫。其中，Pb脅迫下類蘆根系的 H2O2含量明顯高于 Cd脅迫下的，說(shuō)明Pb對(duì)類蘆的毒性更強(qiáng)，也有可能是因?yàn)轭愄J體內(nèi)富集了更多的Pb。由圖1（B）可知，Cd、Pb脅迫下類蘆根系的 O2·-含量均高于對(duì)照，但是不同濃度處理間并無(wú)顯著差異。隨著Cd濃度的增加，O2·-含量也隨之增加，不同濃度處理下 O2·-含量與對(duì)照相比呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì)（P＜0.05）。當(dāng) Pb的濃度繼續(xù)升高，O2·-含量沒(méi)有保持增長(zhǎng)的趨勢(shì)，而是保持在穩(wěn)定的水平上。

2.2Cd、Pb脅迫對(duì)類蘆根系質(zhì)膜完整性的影響

伊文斯藍(lán)染色主要是用來(lái)檢測(cè)質(zhì)膜完整性，可以通過(guò)著色深淺來(lái)評(píng)價(jià)質(zhì)膜的完整性。如圖2所示，在沒(méi)有重金屬污染的情況下，根尖無(wú)明顯著色，但是隨著Cd、Pb濃度的增加，根尖著色加深，濃度為100 μmol·L-1的Cd、Pb處理下，根尖顏色最深，說(shuō)明此時(shí)根尖質(zhì)膜受到明顯的破壞。

圖2　Cd、Pb脅迫下類蘆根系質(zhì)膜完整性Fig. 2　Cd or Pb-induced loss of plasma membrane integrity in the root tips of Neyraudia reynaudiana

圖3　不同濃度Cd、Pb處理下類蘆根系的MDA含量Fig. 3　The content of MDA in roots of Neyraudia reynaudiana at different concentrations of Cd， Pb

2.3Cd、Pb脅迫對(duì)類蘆的膜脂質(zhì)過(guò)氧化作用

MDA是植物體膜脂質(zhì)過(guò)氧化物的代謝產(chǎn)物，可以通過(guò)MDA含量的測(cè)定來(lái)確定細(xì)胞的氧化損傷程度。由圖3可見(jiàn)，隨著Cd、Pb濃度增加，類蘆根系體內(nèi)MDA含量的積累量呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。Cd脅迫下，類蘆根系的 MDA含量與處理濃度顯著相關(guān)（P＜0.05），隨著濃度的增加而增長(zhǎng)。Cd濃度為100 μmol·L-1時(shí)，MDA含量達(dá)到最高，為6.72 nmol·g-1。而 Pb濃度為100 μmol·L-1時(shí)，MDA含量為16.12 nmol·g-1，是對(duì)照的2.99倍。結(jié)果表明，不同濃度的Cd、Pb處理使類蘆根系產(chǎn)生不同程度的氧化傷害。

2.4Cd、Pb脅迫對(duì)類蘆根系抗氧化酶活性的影響

Cd、Pb脅迫下，類蘆根系體內(nèi)的抗氧化酶SOD、POD的活性發(fā)生不同變化，如圖4所示。由圖4（A）可知，SOD活性隨著重金屬濃度的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，脅迫下的 SOD活性均高于對(duì)照。Pb脅迫下，當(dāng)濃度為25 μmol·L-1時(shí)，SOD活性達(dá)到最大值，是對(duì)照的2.53倍；而在Cd脅迫下，當(dāng)濃度為50 μmol·L-1時(shí)，SOD活性達(dá)到最大值，是對(duì)照的2.07倍。當(dāng)Pb和Cd濃度分別為25 和50 μmol·L-1時(shí)，Pb處理的類蘆根系SOD活性高于Cd處理，但在濃度為100 μmol·L-1時(shí)SOD活性降至與Cd處理相近的水平，Cd、Pb的SOD活性分別為425.96 U·g-1和400.85 U·g-1。這說(shuō)明作為清除ROS的第一道防線的SOD，其活性的提高可能是由于 ROS的大量積累使其被激活，并隨濃度的增加發(fā)生不同的變化。類蘆根系的 POD活性變化與SOD活性變化趨勢(shì)不同，如圖4（B），POD活性對(duì)不同重金屬脅迫的響應(yīng)表現(xiàn)不一。無(wú)重金屬脅迫時(shí)，類蘆根系POD活性為99.61 U·g-1·min-1（FW），隨著重金屬濃度的升高，Cd處理的類蘆根系POD活性隨 Cd濃度的增加呈下降趨勢(shì)，50和 100 μmol·L-1脅迫下的 Cd含量與對(duì)照相比顯著下降（P＜0.05），當(dāng)濃度為100 μmol·L-1時(shí)，POD活性降至44 U·g-1·min-1（FW）；而Pb處理下的POD活性則是先下降后上升，濃度25 μmol·L-1時(shí)，其活性僅為對(duì)照的 58.9%，濃度為 100 μmol·L-1時(shí)則達(dá)到237.33 U·g-1·min-1（FW），是對(duì)照的2.38倍。這說(shuō)明 POD的提高是對(duì) H2O2的積累增多的響應(yīng)，而POD活性下降可能是因?yàn)楦邼舛鹊腃d抑制了POD的合成功能，當(dāng)這種抑制超過(guò)類蘆根系的耐受能力時(shí)，就會(huì)使POD的活性不升反降。

圖4　不同濃度Cd、Pb處理下的抗氧化酶活性Fig. 4　Activities of antioxidative enzymes in roots of Neyraudia reynaudiana at different concentrations of Cd， Pb

2.5Cd、Pb脅迫對(duì)類蘆根系TNP-SH、GSH和PCs含量的影響

不同處理下類蘆根系TNP-SH、GSH和PCs含量如圖4。Cd、Pb處理下，TNP-SH、GSH和PCs含量都隨著重金屬濃度的增高而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，并且，在不同濃度處理下均高于對(duì)照的含量。如圖5（A）所示，無(wú)Cd、Pb脅迫時(shí)，類蘆根系的TNP-SH含量為78.96 μmol·g-1，當(dāng)Cd濃度為50 μmol·L-1時(shí)TNP-SH含量顯著上升并達(dá)到最大值，為126.41 μmol·g-1；當(dāng)Pb濃度為25 μmol·L-1時(shí)，TNP-SH含量達(dá)到最大值，為126.58 μmol·g-1，無(wú)論是Cd或Pb脅迫，二者TNP-SH含量的最大值相近，而當(dāng)重金屬濃度為100 μmol·L-1時(shí)，TNP-SH含量也下降到相近的水平。由此可以看出，Cd、Pb脅迫對(duì)類蘆根系TNP-SH含量有顯著的影響，并且其TNP-SH含量與重金屬種類和濃度密切相關(guān)。而類蘆根系GSH含量（圖5（B））在Pb、Cd處理下，分別在25和50 μmol·L-1時(shí)達(dá)到最大值，為83.01 和79.27 μmol·g-1，并且在濃度為100 μmol·L-1時(shí)，兩種脅迫下的GSH含量幾乎相等。但是，GSH含量除在Pb濃度為25 μmol·L-1處理下顯著上升外，在其他濃度處理下與對(duì)照相比并無(wú)顯著差異。PCs含量的變化規(guī)律與TNP-SH基本一致，如圖5（C）所示，在無(wú)Cd、Pb脅迫時(shí)，類蘆根系的PCs含量為5.73 μmol·g-1，Cd不同濃度處理下，其PCs含量依次為7.15、47.14、20.83 μmol·g-1，Pb不同濃度處理下，其 PCs含量依次為 42.36、30.18、19.72 μmol·g-1，除Cd濃度為25 μmol·L-1的處理外，其他處理下的PCs含量均與對(duì)照相比呈顯著上升趨勢(shì)。這說(shuō)明在一定的重金屬離子濃度下，類蘆根系可能通過(guò)合成非蛋白巰基化合物來(lái)對(duì)重金屬的脅迫作出響應(yīng)。

圖5　不同濃度Cd、Pb處理下的TNP-SH，GSH和PCs含量的變化（n=3）Fig. 5　The change in TNP-SH， GSH and PCs contents in roots of Neyraudia reynaudiana at different concentrations of Cd， Pb

3　討論

Cd、Pb影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，高濃度的Cd、Pb抑制植物根細(xì)胞分化，阻礙水分吸收，從而導(dǎo)致植株矮小，葉片泛黃等，對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用。但是在本研究中，盡管Cd、Pb毒害對(duì)類蘆造成了氧化脅迫和質(zhì)膜損傷，類蘆在Cd、Pb脅迫24 h后未受到明顯的影響，植株均未出現(xiàn)明顯中毒癥狀，這可能與脅迫的時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)，同時(shí)也顯示了類蘆在短時(shí)間內(nèi)具有較強(qiáng)的應(yīng)對(duì)外界環(huán)境劇變的能力，能夠通過(guò)自身一系列的應(yīng)激反應(yīng)來(lái)降低重金屬對(duì)其產(chǎn)生的毒害作用。

植物在正常條件下，能夠有效地清除體內(nèi)的ROS使細(xì)胞免受傷害，但在重金屬毒害脅迫下，植物體內(nèi)ROS產(chǎn)生速度超過(guò)植物清除ROS的速度，造成 ROS在細(xì)胞中積累，從而造成氧化損傷。本研究表明，類蘆根系在Cd、Pb處理24 h后，H2O2含量與重金屬濃度呈劑量-效應(yīng)的關(guān)系，Pb處理下的類蘆H2O2含量高于Cd的處理，可能是Pb更多地積累在根尖，誘導(dǎo) H2O2含量的顯著增加。然而Cd處理下O2·-含量均高于Pb處理，可能是Cd誘導(dǎo)O2·-含量增加的作用更強(qiáng)，說(shuō)明植物啟動(dòng)了體內(nèi)清除O2·-的機(jī)制，有效清除了多余的O2·-。ROS的產(chǎn)生使蛋白質(zhì)和生物大分子變性及細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化加劇，以往的研究也發(fā)現(xiàn)，ROS的積累可以誘導(dǎo)紫穗槐Amorpha fruticosa（Bankaji et al.，2015）、東南景天Sedum alfredii（Huang et al.，2012）等葉片和根系的MDA含量升高。而在本試驗(yàn)中，被脅迫的類蘆根尖MDA含量明顯上升，說(shuō)明類蘆根系在重金屬脅迫下受到的明顯的氧化傷害，其中 Pb對(duì)類蘆根系的氧化損傷程度更大。并且，隨著處理濃度的增加，不斷積累的 ROS使植物受到的氧化傷害程度增大，其細(xì)胞膜組成發(fā)生變化，結(jié)構(gòu)遭到破壞。而重金屬對(duì)植物的氧化損傷效應(yīng)在組織化學(xué)反應(yīng)的結(jié)果中得到了進(jìn)一步證明（圖2），半定量的組織化學(xué)結(jié)果提供了類蘆根系受到Cd、Pb毒害的直觀證據(jù)，由此可見(jiàn)，Cd、Pb脅迫能夠影響類蘆根系細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和功能的完整性，揭示了重金屬脅迫對(duì)類蘆根系細(xì)胞膜系統(tǒng)傷害的機(jī)制。

在重金屬脅迫，細(xì)胞膜等受到損傷的同時(shí)，植物自身具有抗氧化的保護(hù)酶系統(tǒng)，能夠維持自由基在植物體內(nèi)產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡。一般認(rèn)為，POD、SOD、CAT活性的維持和提高是植物耐受重金屬脅迫的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。本研究中，不同濃度Cd、Pb處理下，類蘆根尖SOD活性均高于對(duì)照，表明類蘆體內(nèi) SOD作為類蘆根系抵御重金屬毒性的第一道屏障，可清除有害的O2·-并將其轉(zhuǎn)化為H2O2，SOD酶的作用在眾多學(xué)者的研究中均被驗(yàn)證（Thounaojam et al.，2012；Li et al.，2016）。而POD活性則出現(xiàn)不同的變化。Pb處理下隨處理濃度增加POD活性表現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(shì)，高活性的POD酶能夠有效地清除多余的H2O2，但是Cd處理下隨處理濃度增加 POD活性出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。相似地，田向榮等（2015）的研究同樣發(fā)現(xiàn) Cd、Pb復(fù)合脅迫下，匍燈蘚Plagiomnium POD活性隨Pb濃度增加而持續(xù)降低。此外，POD活性的下降可能與植物的測(cè)定部位、重金屬的種類以及濃度、脅迫時(shí)間等有關(guān)（Gupta et al.，2009；史沛麗等，2013）。因此可以認(rèn)為，植物抗氧化物酶活性的增加是植物的一種保護(hù)機(jī)制，表明植物已受到環(huán)境的迫害，但是高濃度的重金屬脅迫，能導(dǎo)致植物抗氧化酶系統(tǒng)遭到破壞，酶活性降低，影響植物正常生長(zhǎng)。綜合分析可得出，類蘆在應(yīng)對(duì)不同重金屬脅迫時(shí)，既存在提高 SOD酶活性的生理代謝響應(yīng)，又存在抑制POD酶活性的特異性反應(yīng)，類蘆通過(guò)及時(shí)調(diào)節(jié)SOD、POD活性，以保持細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的平衡，減少植物受到的傷害。本研究中未測(cè)得 CAT活性，可能由于 CAT活性生成量低，或是因?yàn)榻到馑俣瓤臁?/p>

除抗氧化酶外，植物另一個(gè)應(yīng)對(duì)重金屬脅迫的策略是在細(xì)胞內(nèi)合成巰基化合物，金屬離子對(duì)—SH具有很強(qiáng)的親和力，其中與重金屬解毒關(guān)系最為密切的有GSH和PCs等多肽物質(zhì)。GSH承擔(dān)著抵御ROS和保護(hù)質(zhì)膜的作用，可以通過(guò)與重金屬離子發(fā)生絡(luò)合作用實(shí)現(xiàn)其解毒功能，并且GSH是合成PCs的底物。以往的研究發(fā)現(xiàn)（孫琴等，2008），小麥根系GSH隨Cd濃度增加而上升，對(duì)Cd污染響應(yīng)敏感，可以作為Cd污染的生物標(biāo)記物。Zhao et al. （2015）的研究也發(fā)現(xiàn)在Pb脅迫下，礦區(qū)生態(tài)型華中蓋蹄蕨Athyrium wardii根和葉中的GSH含量均有顯著的升高。但是有研究認(rèn)為（Neyi et al.，2012），GSH和 PCs在植物不同部位承擔(dān)著重金屬解毒功能，PCs主要在根部，而GSH則在葉片的解毒上有更顯著的作用。在本研究中，類蘆根系 TNP-SH、GSH和PCs含量均隨著Cd、Pb的濃度增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，但是GSH含量除在Pb濃度為25 μmol·L-1的處理下有顯著上升外，其它處理均與對(duì)照無(wú)顯著差異，可能是因?yàn)?GSH通過(guò)其它方式參與重金屬解毒，如合成PCs、金屬螯合物、抗氧化劑等（宋相帝等，2011），這方面的探索還有待進(jìn)一步的深入。類蘆根系PCs與重金屬螯合可能是其解除重金屬毒害的重要機(jī)制，PCs能與重金屬直接結(jié)合并在液泡內(nèi)形成區(qū)室化，以減少重金屬對(duì)細(xì)胞的損害。大量的試驗(yàn)結(jié)果（Zhang et al.，2013；Zhou et al.，2015）證明，PCs在植物對(duì)重金屬抗性中有重要的作用，并且PCs的合成水平與重金屬污染程度密切相關(guān)。在本研究中，Cd、Pb對(duì)類蘆根系內(nèi)的PCs的合成隨處理濃度的增加表現(xiàn)出先促進(jìn)后抑制的作用，并且PCs的合成對(duì)重金屬的種類及其濃度的響應(yīng)不同。低濃度下進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的少量Cd 或Pb激活了PCs合成酶，進(jìn)而促進(jìn)了PCs的合成。

但是隨著濃度的增加，PCs含量有所下降，其原因可能有以下3個(gè)方面：（1）PCs解除了重金屬離子毒性（馮保民等，2003）；（2）或由于Cd、Pb與金屬硫蛋白（MT）等其他配體結(jié)合（馮倩等，2010）；（3）重金屬使得類蘆某些功能受損。結(jié)果導(dǎo)致PCs合成酶不再被激活，PCs合成能力下降（孫琴等，2004）。由此推測(cè)，類蘆根系遭受到中低濃度的Cd、Pb脅迫時(shí)能有效的合成PCs，從而降低重金屬的毒性和對(duì)植物的傷害，維持自身的穩(wěn)態(tài)。但有關(guān)Cd、Pb脅迫對(duì)類蘆根系GSH、PCs的合成與降解及調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。而目前已有相關(guān)研究（原海燕等，2013）發(fā)現(xiàn)，通過(guò)添加外源GSH不僅可起著緩解重金屬對(duì)植物的毒害作用，還可能具有促進(jìn)重金屬往地上部分運(yùn)轉(zhuǎn)的作用，因此需要通過(guò)更進(jìn)一步的研究來(lái)分析其在類蘆中的作用。

4　結(jié)論

（1）Cd、Pb脅迫使類蘆根系受到顯著的氧化損傷，ROS積累導(dǎo)致細(xì)胞膜遭受破壞，但是類蘆并沒(méi)有出現(xiàn)明顯的毒害癥狀，說(shuō)明類蘆對(duì)重金屬Cd、Pb有一定的耐受性。

（2）重金屬脅迫對(duì)類蘆根系抗氧化酶和非蛋白巰基化合物有一定的影響，類蘆通過(guò)調(diào)節(jié)二者在其體內(nèi)的水平以增強(qiáng)植物對(duì)重金屬的抗性，降低重金屬脅迫對(duì)其產(chǎn)生的毒害程度，但是高濃度的 Cd、Pb抑制了類蘆抗氧化酶的活性以及非蛋白巰基化合物的合成。

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Response of Antioxidant Enzymes and PCs in Root of Neyraudia reynaudiana to Cd， Pb Stress

LUO Jiewen1， 2， LI Ying1， 2， SU Shuoshuo1， 2， HUANG Xiaomin， ZHUO Chuifan1， 2*
1. College of Forestry， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002， China；
2. Co-innovation center for soil and water conservation in red soil region of the Cross-straits， Fuzhou 350002， China

Neyraudia reynaudiana is one of the most common heavy-metal tolerant plants surrounding mines. Because N. reynaudiana can accumulate large amounts of heavy metals， it could be an effective plant for phytoremediation. In order to study its response to heavy metal stress， a solution culture experiment was carried out at different lead （Pb） and cadmium （Cd） concentrations （0， 25， 50， and 100 μmol·L-1）. After 24 hours， oxidative damage， antioxidant enzyme activity， and non-protein thiol compound content or root tissue were assessed. Under Cd and Pb stress， increases in H2O2and O2·-content were accompanied by malondialdehyde （MDA） content increases. At Pb and Cd concentrations of 100 μmol·L-1， the MDA contents respectively reached 6.72 and 16.12 nmol·g-1， and both lipid peroxidation and oxidative damage had increased. Additionally， enzymatic function was effected， with superoxide dismutase （SOD） and peroxidase （POD） activity initially increasing with metal concentration and then declining under higher Pb stress. SOD activity under Cd stress was similar to that under Pb stress， but POD activity was lower. The non-protein thiol content of roots showed that glutathione and phytochelatins initially increased and then decreased with Cd and Pb concentrations. Comprehensive analysis thus revealed that these two heavy metals at different concentrations have different effects on N. reynaudiana root tissue. Overall， N. reynaudiana can adjust its antioxidant enzyme activity and non-protein thiol synthesis levels in order to reduce heavy metal toxicity and damage.

Cd/Pb； Neyraudia reynaudiana； plasma membrane integrity； antioxidant enzyme； phytochelatins （PCs）

10.16258/j.cnki.1674-5906.2016.06.019

X53

A

1674-5906（2016）06-1047-07

國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2014BAD15B02）；農(nóng)業(yè)高校產(chǎn)學(xué)合作科技重大項(xiàng)目（2013N5002）；福建省高校杰出青年科研人才培育計(jì)劃（2015）；福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2013J01073）

羅潔文（1991年生），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯鷳B(tài)修復(fù)。E-mail ellenlll@163.com

2016-05-13