HS-SPEM-GC-MS分析丹蔞片中的揮發(fā)性化學(xué)成分*

張　娜，李　琳，高　杉，朱　彥，王家明，張　鵬，于春泉

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津　300193；2.天津國(guó)際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院，中藥新藥研發(fā)中心，天津　300457；3.天津科技大學(xué)，生物工程學(xué)院，天津 300457）

·中藥研究·

HS-SPEM-GC-MS分析丹蔞片中的揮發(fā)性化學(xué)成分*

張娜1，2，李琳1，高杉1，朱彥1，王家明3，張鵬1，于春泉1

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300193；2.天津國(guó)際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院，中藥新藥研發(fā)中心，天津300457；3.天津科技大學(xué)，生物工程學(xué)院，天津 300457）

［目的］用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)鑒定丹蔞片揮發(fā)性化學(xué)成分。［方法］采用頂空固相微萃取法（HS-SPEM）提取丹蔞片中的揮發(fā)性成分，利用GC-MS結(jié)合保留指數(shù)法（KI）對(duì)其主要揮發(fā)性成分進(jìn)行分析鑒定。［結(jié)果］從丹蔞片揮發(fā)性成分中鑒定出44個(gè)組分，占總揮發(fā)性組分的72.46%。其中相對(duì)含量超過5%的成分有蒿本內(nèi)酯（17.49%），β-欖香烯（11.07%），（-）斯巴醇（8.95%），3-丁烯基-1（3H）-異苯并呋喃酮（5.50%）等6個(gè)化合物。［結(jié)論］丹蔞片中的揮發(fā)性成分得到全面分析，根據(jù)其相對(duì)含量，丹蔞片中的揮發(fā)性成分主要來(lái)源于川芎、郁金、澤瀉，為丹蔞片的質(zhì)量控制和進(jìn)一步藥效研究提供一定的參考。

丹蔞片；揮發(fā)油；GC-MS分析

丹蔞片是臨床治療冠心病、心絞痛的常用復(fù)方制劑，由川芎、丹參、赤芍、澤瀉、郁金等10味中藥組成，主要用于治療痰瘀互結(jié)所致的胸痹心痛，癥見胸悶胸痛、憋氣、舌質(zhì)紫暗、苔白膩，冠心病心絞痛見上述證候者；具有寬胸通陽(yáng)，化痰散結(jié)，活血化瘀之功效［1-2］。丹蔞片復(fù)方藥味眾多，成分復(fù)雜，董娟等［3］已用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-MS）技術(shù)分析丹蔞片中的非揮發(fā)性成分，但對(duì)丹蔞片中的揮發(fā)性成分尚未有研究報(bào)道。丹蔞片中的郁金［4］、川芎［5］、澤瀉［6］等中藥的揮發(fā)性成分主要包括酚酸、酮類、萜類和酯類等，其中的某些揮發(fā)性成分對(duì)心、腦血管疾病具有一定的預(yù)防和治療作用［7-9］，因此對(duì)丹蔞片中揮發(fā)性成分值得研究。

氣相色譜質(zhì)譜技術(shù)（GC-MS）對(duì)揮發(fā)性成分的定性分析與鑒定常用的是NIST譜庫(kù)檢索的方法、保留指數(shù)法、譜庫(kù)檢索和保留指數(shù)法相結(jié)合的方法［10］，其中保留指數(shù)（KI）是被國(guó)際公認(rèn)的氣相色譜定性指標(biāo)的一種參數(shù)，可以有效地區(qū)分結(jié)構(gòu)上細(xì)微差別的同分異構(gòu)體，將質(zhì)譜檢索和保留指數(shù)相結(jié)合分析可顯著提高鑒定的準(zhǔn)確性［11］。頂空固相微萃取技術(shù)（HS-SPEM）是固相微萃取技術(shù)的一種較常用的萃取模式，克服了水蒸氣蒸餾法、超臨界二氧化碳（CO2）萃取法等傳統(tǒng)方法中操作復(fù)雜，費(fèi)用高等缺點(diǎn)［12-14］。對(duì)于中藥、生物樣本，該方法能夠很好的避免萃取固定相受到樣品中的大分子物質(zhì)和難揮發(fā)性物質(zhì)的污染與干擾［15］，并且在處理一些不穩(wěn)定的化學(xué)成分時(shí)，還可以防止它們出現(xiàn)加熱分解與轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象［16］。該方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品、藥品、環(huán)境以及生物樣品的分析。本文采用HS-SPEM提取丹蔞片中的揮發(fā)性成分，利用GC-MS結(jié)合KI［17］對(duì)其主要成分進(jìn)行分析鑒定。以期為丹蔞片藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1材料、試劑與儀器Agilent7890A-5975CGCMS氣質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent科技公司），色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（MSD ChemStation E.02.01，美國(guó)Agilent科技公司），NIST08.L譜庫(kù)；HJ-3磁力攪拌加熱器（金壇市醫(yī)療儀器廠），100μm聚二甲基硅氧烷涂層固相萃取頭（PDMS，Supelco，Bellefonte，Pa），HP-5MS毛細(xì)管柱（美國(guó)Agilent科技公司），超純水機(jī)（天津市奧佳科技有限公司）。

正構(gòu)烷烴對(duì)照品溶液C8-C20（美國(guó)FLUKA公司），氯化鈉為分析純（天津市化學(xué)試劑一廠）。

丹蔞片（吉林康乃爾藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20140602）。

1.2方法

1.2.1HS-SPEM法提取揮發(fā)油取5片丹蔞片粉碎，將粉碎過的樣品0.6584 g、飽和氯化鈉3.6g及12mL水放入頂空瓶中，在65℃磁力攪拌下萃取40min，取出，立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口，解吸5min。進(jìn)樣口溫度250℃，進(jìn)樣模式為不分流進(jìn)樣。

1.2.2色譜條件色譜柱：HP-5MS（60m×320μm× 0.25μm）；載氣He，流量1mL/min；汽化溫度：250℃；接口溫度：280℃；色譜柱初始溫度60℃（保持1min），以4℃/min升溫速率升至150℃（保持5 min），以4℃/min升溫速率升至240℃（保持3min）；溶劑延遲：0min。

1.2.3質(zhì)譜條件電離方式：EI源，能量70 eV；離子源溫度:230℃；四極桿溫度:150℃；質(zhì)量范圍：（35～800）AMU；電子倍增器電壓:1 400 V。譜圖檢索：采用NIST08.L譜庫(kù)進(jìn)行檢索。

1.2.4KI值測(cè)定取正構(gòu)烷烴混合對(duì)照品，按1.2.2項(xiàng)下條件分析，記錄各正構(gòu)烷烴保留時(shí)間，根據(jù)化合物的保留時(shí)間找到相鄰的兩個(gè)正構(gòu)烷烴后按下式計(jì)算待測(cè)化合物的KI值：KI=100Z+100［TR（x）-TR（z）］/［TR（z+1）-TR（z）］

式中：TR（x），TR（z），TR（z+1）分別代表待測(cè)化合物及碳數(shù)為Z，Z+1正構(gòu)烷的保留時(shí)間。且TR（z）＜TR（x）＜TR（z+1）［18］。

2　結(jié)果

取1.1項(xiàng)下的丹蔞片供試品，按1.2.1項(xiàng)下條件提取供試品中的揮發(fā)性成分，按1.2.2項(xiàng)下條件對(duì)丹蔞片中的揮發(fā)性化學(xué)成分進(jìn)行GC-MS分析，見圖1。

圖1丹蔞片在GC-MS中的TIC圖

采用峰面積歸一化法計(jì)算各組分相對(duì)含量，對(duì)總離子流圖中各色譜峰計(jì)算其KI值，利用各色譜峰對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖進(jìn)行NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索，選取質(zhì)譜匹配度高的10個(gè)可能物質(zhì)，并檢索其理論保留指數(shù)（KI*）值，以質(zhì)譜圖和KI值匹配度都高的化學(xué)結(jié)構(gòu)為最佳鑒定結(jié)果，見表1。

3　討論

通過GC-MS分析丹蔞片中揮發(fā)性成分，經(jīng)NIST08質(zhì)譜庫(kù)檢索與保留指數(shù)雙重定性的方法鑒定出44種主要成分，其相對(duì)含量總和占總揮發(fā)性組分的72.46%。由總離子流圖和揮發(fā)性成分鑒定結(jié)果可知，丹蔞片揮發(fā)性成分十分復(fù)雜，種類較多，且相對(duì)含量差別較大。其中相對(duì)含量高于5%的成分有蒿本內(nèi)酯、β-欖香烯等6個(gè)成分，相對(duì)含量1%～5%的成分有環(huán)氧香橙烯、吉馬酮等4個(gè)成分。

丹蔞片揮發(fā)性成分中含量最高的化合物通過NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)比對(duì)的匹配度只有69%，低于一般標(biāo)準(zhǔn)匹配度80%（匹配度高于一般標(biāo)準(zhǔn)的化合物，可直接定性）。為了確證該化合物的結(jié)構(gòu)，根據(jù)其保留時(shí)間，選取了C8-C20正構(gòu)烷烴，測(cè)定了其KI值，采用NIST匹配與保留指數(shù)法相結(jié)合方法鑒定該化合物，該化合物的實(shí)際KI值與反式蒿本內(nèi)酯KI*值比較，標(biāo)準(zhǔn)偏差閾值小于10%［19］，可確定該化合物為反式蒿本內(nèi)酯，對(duì)于保留時(shí)間在C8-C20正構(gòu)烷烴范圍內(nèi)的揮發(fā)性成分，本文同時(shí)計(jì)算了其KI值，對(duì)其進(jìn)行了雙重定性。

反式蒿本內(nèi)酯是本復(fù)方制劑中川芎的主要活性成分之一，具有改善微循環(huán)［20］、舒張血管［21］、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖［22］等作用。同時(shí)其他揮發(fā)性成分如β-欖香烯［23］等，也具有抗凝血、溶血栓、抗動(dòng)脈粥樣硬化等的功效。由此推測(cè)，丹蔞片復(fù)方制劑中的揮發(fā)性成分也是其發(fā)揮抑制心肌缺血、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降脂等功效的活性成分，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為后期進(jìn)一步研究其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］吳學(xué)芹，董娟，付愛珍，等.丹蔞片HPLC指紋圖譜研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，2014，25（3）:319-322.

［2］李琳，王瑩，高杉，等.丹蔞片抗高脂血癥的研究進(jìn)展［J］.天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，33（1）:61-64.

［3］Dong J，Zhu Y，Gao XM，etal.Qualitative and quantitative analysis of the majorconstituents in Chinese medicinal preparation Dan-lou tablet by ultra high performance liquid chromatography/diode-array detector/quadrupole timeof-flight tandem massspectrometry［J］.Journalofpharmaceuticaland biomedicalanalysis［J］.Journalof Pharmaceuti-caland BiomedicalAnalysis，2013（80）:50-62.

［4］楊昭武，李敏，茍寒陽(yáng)，等.GC/MS內(nèi)標(biāo)法建立黃絲郁金揮發(fā)油特征圖譜研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2013，24（7）: 1652-1655.

［5］劉洪玲，于良生，紀(jì)恒勝，等.川芎揮發(fā)油的GC-MS指紋圖譜研究［J］.中國(guó)藥房，2012，23（43）:4101-4103.

［6］陳建忠，李彧，肖建平，等.藥對(duì)澤瀉-白術(shù)與其單味藥揮發(fā)油成分的比較分析［J］.福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，22（4）:43-46.

［7］岑顯娜.川芎藥理作用研究新進(jìn)展［J］.實(shí)用醫(yī)技雜志，1996，3（2）:27-28.

［8］劉華鋼，劉俊英，賴茂祥，等.郁金化學(xué)成分及藥理作用的研究進(jìn)展［J］.廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，11（2）:81-83.

［9］鞏麗萍.澤瀉質(zhì)量評(píng)價(jià)方法研究［D］.濟(jì)南:山東大學(xué)，2006.［10］趙晨曦，梁逸曾，胡黔楠，等.氣相色譜保留指數(shù)定性方法研究進(jìn)展［J］.分析化學(xué)評(píng)述與進(jìn)展，2005，33（5）:715-721.

［11］尹昌海，魏遠(yuǎn)隆，左海根，等.GC-MS結(jié)合保留指數(shù)分析南豐蜜桔揮發(fā)性成分［J］.分析試驗(yàn)室，2012，31（11）:58-62.

［12］Ma QL，Hamid N，Bekhit AED，et al.Optimization of headspace solid phase microextraction（HS-SPME）forgas chromatography mass spectrometry（GC-MS）analysis of aromacompounds in cooked beef using response surface methodology［J］.Microchemical Journal，2013（111）:16-24.

［13］賈偉娜，王春華，王宏濤，等.HS-SPME-GC/MS法分析連花清瘟膠囊制劑原料中的揮發(fā)性成分［J］.天津中醫(yī)藥，2015，32（2）:110-112.

［14］張義，高蓓，徐玉娟.頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用方法分析龍眼中的揮發(fā)性化合物［J］.食品科學(xué)，2010，31（16）: 156-160.

［15］肖丹.頂空固相微萃取技術(shù)的應(yīng)用與展望［J］.中國(guó)衛(wèi)生工程學(xué)，2015，14（1）:87-92.

［16］余倩，宋雙紅，李翠芹.SPME-GC-MS結(jié)合保留指數(shù)分析黃連木揮發(fā)性成分［J］.中藥材，2014，37（11）:2022-2025.

［17］梁晟，李雅文，趙晨曦，等.GC-MS結(jié)合保留指數(shù)對(duì)中藥揮發(fā)油的定性［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2008，27（1）:84-87.

［18］陳邦杰，郭西見，彭少逸.程序升溫毛細(xì)管氣相色譜保留指數(shù)的計(jì)算［J］.色譜，1987，5（6）:335-338.

［19］楊帥，楊文文，胡金芳，等.GC-MS結(jié)合保留指數(shù)分析白花蛇舌草揮發(fā)性成分［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（9）:93-95.

［20］劉駿，魏玉平，劉永福，等.順式藁本內(nèi)酯的提取方法及藥用用途［P］.中國(guó):CN1552702A，2004-12-08.

［21］錢忠明，杜俊蓉，汪程遠(yuǎn).藁本內(nèi)酯在制備預(yù)防和治療腦缺血性疾病的藥物中的應(yīng)用［P］.中國(guó):CN1732921A，2006-02-12.

［22］Kuang X，Yao Y，Du JR，et al.Neuroprotective role of Z-ligustilide against forebrain ischemic injury in ICRmice［J］. Brain research，2006（1102）:145-153.

［23］段文麗，白仁仁，鐘穎，等.β-欖香烯對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞作用的研究［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，14（31）:6014-6019.

HS-SPEM-GC-MSanalysisof the volatile componentsof Dan-lou tablets

ZHANGNa1，2，LILin1，GAOShan1，ZHUYan1，WANG Jia-ming3，ZHANGPeng1，YUChun-quan1
（1.Tianjin University of TraditionalChineseMedicine，Tianjin State Key Laboratory ofModern Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Tianjin International JointAcademy of Biomedicine，Research and DevelopmentCenter of Traditional Chinese Drug，Tianjin 300457，China；3.Tianjin University ofScienceand Technology，Engineering CollegeofBiology，Tianjin 300457，China）

［Objective］Using gas chromatography-mass spectrometry technology（GC-MS）to identify the chemical composition of volatile oil of Dan-lou tablets.［Method］In this paper，volatile components of Dan-lou tabletswere extracted by headspace solid phasemicroextraction（HS-SPEM）.Their structureswere identified based GC-MS database combined with Retention Index（KI）calculated.［Results］Fourty-four kinds of volatile oil compoundswere identified from Dan-lou tablet，which accounted 72.46%of the total volatile oil components.The ingredients which have content more than 5%were Ligustilide（17.49%），β-Elemenone（11.07%），（-）-Spathulenol（8.95%），3-butenyl-1（3H）-isobenzofuranone（5.502%）et al.［Conclusion］Volatile components of Dan-lou tablet are fully analyzed.The identifiedcompounds havemultiple activities according the prevent reports. Thisarticle providesa scientific basis forquality controland furtherpharmacological research ofDan-lou tablets.

Dan-lou tablet；volatile oil；GC-MS；analysis

R284

A

1673-9043（2016）04-0258-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2016.04.10

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（81303183，81403198）；國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（“973”計(jì)劃）項(xiàng)目（2014CB542902）。作者簡(jiǎn)介：張 娜（1990-）女，碩士研究生，主要從事藥物化學(xué)研究。

張鵬，E-mail:zhp8270@sina.com.cn；于春泉，E-mail:ycq-4@163.com。

2016-04-02）