高效液相色譜法測定葡萄中甜蜜素的殘留量

張曉燕，崔晨，夏光輝

（通化師范學(xué)院，吉林通化134002）

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高效液相色譜法測定葡萄中甜蜜素的殘留量

張曉燕，崔晨，夏光輝

（通化師范學(xué)院，吉林通化134002）

建立了高效液相色譜法測定葡萄中甜蜜素殘留量的方法。采用InertsilC18（4.6×250mm）色譜柱，柱溫25℃，乙腈：水=60：40作流動相，檢測波長為313nm，流速0.8mL/min的條件測定。甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)品以不同體積進(jìn)樣，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線y=360.86x-106.89，其相關(guān)系數(shù)R2=0.9999，在2～50μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。實驗建立的甜蜜素測定方法穩(wěn)定可靠，可快速檢測葡萄中的甜蜜素殘留量。

甜蜜素；高效液相色譜；葡萄；殘留量

甜蜜素，別名環(huán)己基氨基磺酸鈉，化學(xué)分子式C6H11NHSO3Na，白色，粉末狀結(jié)晶，主要由環(huán)己胺和氨基磺酸等化學(xué)物質(zhì)經(jīng)過一系列反應(yīng)后通過氫氧化鈉處理，重結(jié)晶產(chǎn)生的物質(zhì)［1，2］。它是一種人工合成食品添加劑，無味，無營養(yǎng)［3］。因其可以增加食品口感，價格低廉，具有低熱，易溶于冷水、熱水，無異味，對熱、酸、堿穩(wěn)定以及不易變質(zhì)和不吸潮等特點而被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)中，其中不乏飲料、西瓜、糕點、罐頭、醬菜、蜜餞、葡萄、香瓜、菠蘿等多種食品［4］。但甜蜜素的致癌作用一直存在爭議，早在1960年就有人報告其代謝產(chǎn)物環(huán)己胺對心腦血管系統(tǒng)和睪丸有毒理作用而被美國食品與藥品管理局（FDA）禁用［5］。后來經(jīng)過多方研究證實，攝入過量甜蜜素確實有損害腎臟功能甚至致畸、致癌等副作用，因此很多食品生產(chǎn)大國，例如美國、日本、加拿大等發(fā)達(dá)國家，都明令禁止食品生產(chǎn)商在食品中添加甜蜜素，從根本上阻止甜蜜素流入市場［6］。但仍有許多國家允許甜蜜素作為食品添加劑活躍在市場中，例如中國、澳大利亞等國家和地區(qū)，只是針對甜蜜素的使用范圍和使用量做出了相應(yīng)的控制，因此大量的含有甜蜜素的食品在市場上流通［7］。但是甜蜜素的食用量過多，甚至達(dá)到一定量的時候，就會對人體產(chǎn)生一定的危害，尤其是人體的肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)這些敏感部位，特別是針對敏感的孕婦和小孩以及抵抗力較差的老人這些特定人群，更容易受到甜蜜素的傷害［8］。因此我國控制甜蜜素的使用劑量，并納入到《食品中添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》，但其中不包括對水果中甜蜜素殘留量的要求。查閱文獻(xiàn)可知，澳大利亞和新西蘭規(guī)定甜蜜素在低熱量果蔬汁制品中的最大使用限量為400mg/kg，歐盟規(guī)定在低熱量的水果和蔬菜制品中甜蜜素的使用量不得超過250mg/kg［9］。

葡萄作為一種人們喜愛的水果，不僅味道好，而且還具有一定的預(yù)防疾病的功效。近年來人們越來越關(guān)注食品安全問題，所以對葡萄是否噴灑甜蜜素的問題有所質(zhì)疑。目前在國標(biāo)GB/T5009.97-2003里已經(jīng)有關(guān)于甜蜜素檢測方法的介紹，其中比較常見的有氣相色譜法、薄層層析法和比色法［10］。另外也有人研究了分光光度法、離子色譜法等來測定甜蜜素的殘留量［11］。但都存在著干擾性大、操作繁瑣、靈敏度低和穩(wěn)定性差等方面的問題［12］。本實驗建立高效液相色譜法對葡萄中甜蜜素的殘留量進(jìn)行定量檢測，操作簡單、快速、靈敏。

1　材料與方法

1.1材料、試劑和儀器

1.1.1材料和試劑

材料：巨峰葡萄（超市購買）；

試劑：乙腈（色譜純）；硫酸（分析純）；正己烷（色譜純）；次氯酸鈉（分析純）；碳酸氫鈉（分析純）；甲醇（色譜純）；

甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)品（250mg，中國食品藥品檢定研究院，純度：99.0%，產(chǎn)品編號：C11830800，Lot：30426）。

1.1.2儀器

UV-2600紫外分光光度計、HHS型電熱恒溫水浴鍋、FA1104電子天平（感量：0.1mg）、BT125D電子天平（感量：0.01mg）、LC-20A高效液相色譜儀。

1.2方法

1.2.1樣品溶液的制備

將葡萄去除籽粒，放入研缽中搗碎研磨成汁，將研磨后樣品放入80℃恒溫水浴鍋中加熱20min。首先精確秤取5.0g樣品，確保樣品精準(zhǔn)度，并將稱量的樣品全部放置100mL容量瓶中，隨后加入蒸餾水，定容至刻度，反復(fù)搖勻，過濾。精密量取續(xù)濾液10mL，全部放入125mL分液漏斗中，隨后先加入2mL（1:1）硫酸，再放入5mL正己烷，最后放入2mL（1:1）次氯酸鈉溶液，反復(fù)搖晃震動10min。待乳化現(xiàn)象消失后棄去下層水相，保留正己烷層。精確量取25mL碳酸氫鈉溶液加入分液漏斗中，充分震蕩5min。待乳化現(xiàn)象消失后棄去水層，取正己烷層。用0.45μm的濾膜過濾，作為樣品溶液，待測。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精確稱取10mg甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)品，置于10mL容量瓶中，加適量蒸餾水溶解，然后用蒸餾水定容至刻度，配制成1.0mg/mL的甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。將標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.2.1處理，作為甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.3色譜條件

色譜柱為Inertsil4.6nm×250nm，流動相乙腈:水=60:40，檢測波長為313nm，流速為0.8mL/min，柱溫為40℃。

2　結(jié)果與分析

2.1高效液相色譜法色譜條件的選擇

2.1.1檢測波長的選擇

利用紫外分光光度計對衍生反應(yīng)生成的N，N-二氯環(huán)己胺在200～700nm范圍內(nèi)進(jìn)行波長掃描，發(fā)現(xiàn)在210nm和313nm處都出現(xiàn)了比較明顯的色譜峰，但210nm周圍產(chǎn)生的雜峰多，分離度較差。而313nm處出現(xiàn)的干擾峰較少，基線相對穩(wěn)定，所以采用313nm作為甜蜜素的檢測波長。

2.1.2流動相的選擇

分別以20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20的不同比例的乙腈:水作為流動相進(jìn)行洗脫，發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙腈: 水=60:40時，分離度和色譜峰形都比較好，且能有效的排除干擾峰的影響，故選擇乙腈:水=60:40作為流動相。

2.1.3柱溫和流速的選擇

根據(jù)不同的柱溫條件進(jìn)行選擇，分別在20℃、25℃、30℃、35℃、溫度下進(jìn)行檢測。結(jié)果在25℃時出現(xiàn)的色譜峰形較好，雜峰和干擾峰較少，所以選用25℃作為柱溫條件。

在本實驗中，分別選擇以下：0.6mL/min、0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min作為甜蜜素檢測時的流速，最終確定流速為0.8mL/min。

2.2定性分析

首先進(jìn)樣甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液10μL，再進(jìn)樣品溶液10μL，根據(jù)甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液出峰時間做定性分析，判斷葡萄中含有甜蜜素。結(jié)果如圖1和圖2所示。

由圖1可知，甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液在5.873min處出現(xiàn)明顯的色譜峰。由圖2可知，樣品溶液在5.870min處同樣出現(xiàn)明顯的色譜峰，可以確定樣品中有甜蜜素殘留。

圖1　甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖2　樣品溶液的色譜圖

2.3精密度試驗

取標(biāo)準(zhǔn)溶液10μL注入色譜儀，進(jìn)行檢測，并且平行進(jìn)樣6次分別檢測，得到6組峰面積數(shù)據(jù)，分別為33677、33604、33728、33714、33670、33664，計算測得值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=1.18%，說明本方法測得結(jié)果的精密度良好。

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)溶液以不同體積進(jìn)樣分析，分別為2μL，5μL，10μL，20μL，50μL，以峰面積y作為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣體積x作橫坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=360.86x-106.89，相關(guān)系數(shù)R2=0.9999，甜蜜素在2～50μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖3　甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

結(jié)果的計算：按樣品的峰面積根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析，按以下公式計算結(jié)果：

其中，X—樣品中甜蜜素含量（g/kg）；M1—樣品中甜蜜素的質(zhì)量（μg）；m—樣品質(zhì)量（g）；v—進(jìn)樣體積（μL）；5—正己烷加入量（mL）.

計算可得，樣品中甜蜜素的質(zhì)量為14.45μg，樣品中甜蜜素的含量為1.31mg/kg。

2.5重現(xiàn)性試驗

將同一樣品進(jìn)行三次平行實驗，按1.2.1處理后進(jìn)行測量，三次測量的峰面積分別為10575、10562、10571，計算得到樣品中含有甜蜜素的質(zhì)量分別為 29.60μg、29.57μg、29.59μg，RSD=1.58%，說明本實驗所采用的方法準(zhǔn)確度較高。

2.6穩(wěn)定性試驗

標(biāo)準(zhǔn)溶液分別在0h、2h、4h、6h、8h、10h進(jìn)行測定，結(jié)果在8h峰形開始發(fā)生變化，10h峰形完全變化，衍生物分解成其他物質(zhì)，說明N，N-二氯環(huán)己胺在8h內(nèi)穩(wěn)定存在，其穩(wěn)定性滿足測定的要求。

2.7回收試驗

將樣品分別秤取10g放置1號、2號、3號容量瓶，1號加入5μg/mL甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)品，2號加入10μg/mL甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)品，3號加入20μg/mL的甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)品，按照1.2.1方法進(jìn)行處理，測得值分別為0.0435μg、0.0894μg、0.1721μg。計算回收率分別為87%、87%、86%，RSD=1.54%。其數(shù)值介于國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T27404-2008實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測規(guī)定的回收率（80%～110%）之間，符合規(guī)定。由此可以看出本方法測量準(zhǔn)確可靠，滿足分析要求。

3　結(jié)論

建立的高效液相色譜法測定葡萄中甜蜜素含量的方法，其精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=1.18%，該方法的精密度較好。標(biāo)準(zhǔn)曲線y=360.86x-106.89，其相關(guān)系數(shù)R2=0.9999，在2～50μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。甜蜜素在8h內(nèi)穩(wěn)定存在，滿足甜蜜素的檢測時間要求。甜蜜素的回收率在86%～87%，符合規(guī)定。通過檢測得到樣品中甜蜜素的殘留量為1.31mg/kg，沒有超過歐盟甜蜜素含量標(biāo)準(zhǔn)250mg/kg，實驗樣品葡萄中的甜蜜素殘留量是合格的。綜上所述，高效液相色譜法測定甜蜜素的殘留量的方法，其靈敏度以及精密度相對與其他測定甜蜜素方法更加精準(zhǔn)、快速，能夠滿足國家標(biāo)準(zhǔn)對甜蜜素測定的要求，為日后檢驗人員研究甜蜜素的測定方法提供了參考，在水果的質(zhì)量檢驗中具有實際應(yīng)用價值。

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Determination of Sodium Cyclamate Residues in Grapes by High Performance Liquid Chromatography

ZHANG Xiao-yan，CUI Chen，XIA Guang-hui
（Tonghua Normal University，Tonghua 134002，China）

A high performance liquid chromatography（HPLC）method for the determination of sodium cyclamate residues in grapes was established.The chromatographic separation was performed on an Inertsil C18column（4.6×250mm）kept at 25℃using acetonitrile and water（60：40）as the mobile phase at a flow rate of 0.8mL/min and the detection wavelength was set at 313 nm.Different volume of sodium cyclamate standard were injected，the standard curve wasy=360.86x-106.89，with a correlation coefficient of 0.9999，it showed good linearity over the concentration range of 2 to 50μg.This method was stable and reliable for the rapid determination of sodium cyclamate residues in grapes.

Sodium cyclamate；HPLC；grapes；residues

TS255.7

A

1008-1038（2016）08-0026-04

2015-10-29

張曉燕，女，助教，主要從事食品有害成分研究