桑葉總黃酮提取工藝研究

穆建峰（汝南縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南駐馬店463300）

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桑葉總黃酮提取工藝研究

穆建峰
（汝南縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南駐馬店463300）

紫外可見分光光度法測定桑葉總黃酮含量，并采用正交試驗(yàn)對(duì)桑葉中總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定了采用丙酮-水系統(tǒng)溶劑、超聲波提取方式提取桑葉中總黃酮的最佳提取工藝。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：桑葉中總黃酮的含量為2.78%。丙酮-水系統(tǒng)超聲波提取的最佳工藝參數(shù)是丙酮濃度為50%、超聲波溫度70℃、超聲時(shí)間為40min、料液比為1：20。在此工藝條件下，桑葉總黃酮的提取率最高可達(dá)98.6%，RSD為0.22%，其吸光度值在2h內(nèi)基本穩(wěn)定。此方法重復(fù)性好，簡單、易于操作。

桑葉；總黃酮；正交試驗(yàn)；提取工藝

桑葉（Mulberry leaves）系?？浦参铮∕orus albaL.）的葉，是我國傳統(tǒng)的中藥材，性味甘、苦、寒，具有疏散風(fēng)熱、清肺潤燥、清肝明目的功效［1］。桑葉不僅可以食用，還可以藥用。現(xiàn)代中藥已經(jīng)對(duì)桑葉做了大量深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)桑葉具有降血壓、降血糖、抗菌、抗病毒和抑制癌癥等藥理作用［2］。桑葉是植物莖葉中黃酮類化合物含量較高的一種，所含黃酮的種類有蘆丁、桑苷、槲皮素、異槲皮素、槲皮素-3-三葡糖苷、槲皮苦和二氫山茶素等成分［3］。

本文采用正交試驗(yàn)優(yōu)化桑葉中總黃酮化合物的提取方法，確定提取桑葉中總黃酮的最佳提取工藝，為桑葉的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料

桑葉：采集于駐馬店市郊區(qū)，10月采集后粉碎；

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品:中國藥品生物制品檢定所；

丙酮、甲醇、乙醇、石油醚、硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉均為分析純?cè)噭?/p>

1.1.2試驗(yàn)所用儀器

分析天平，購于北京賽多利斯；

超聲波清洗機(jī)，購于天津奧特賽斯；

紫外可見分光光度計(jì)，購于北京譜析通用；

水循環(huán)真空泵，購于鄭州長城科工；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，購于上海申順；

粉碎機(jī)，購于河北中興儀器廠；

恒溫干燥箱，購于天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1原料的預(yù)處理

采摘新鮮的桑葉置于恒溫干燥箱中60℃烘干36h，取出放冷，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過篩備用。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定［4］

準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.38mg，使用50%乙醇溶液定容于50mL棕色容量瓶中，制成濃度為0.2076mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL，置于10mL棕色容量瓶中，分別加入5%的NaNO2溶液0.5mL搖勻，放置5min后加入10%的Al（NO3）3溶液0.5mL，再過5min后再加入1mL1mol/L的NaOH溶液，混勻，用50%乙醇稀釋至刻度。以50%乙醇為空白，用1cm比色皿，在400～760nm范圍內(nèi)掃描，發(fā)現(xiàn)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的最大吸收波長是510nm。在510nm下分別測定不同濃度的蘆丁的吸光度。如表1。

表1　不同濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值

以蘆丁濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，采用Excel做最小乘法的線性回歸［5］，得蘆丁濃度C與吸光度A的線性關(guān)系：A=11.066C-0.0001，相關(guān)系數(shù)r=0.99975。如圖1。

圖1　丙酮濃度對(duì)提取率的影響

1.2.3桑葉中總黃酮的提取及測定［6］

準(zhǔn)確稱取2.0g桑葉粉末，置于磨口三角瓶中，使用50%丙酮溶劑、料液比為1:10，溫度30℃、超聲提取30min。減壓過濾，濾渣用水洗滌，合并過濾液得第一次提取液。同法提取第二次，得第二次提取液。直至得第三次提取液。合并三次提取液減壓蒸餾，回收溶劑至近干，加水約80mL溶解，加入20mL石油醚脫色兩次，吸取石油醚層，用水將其定容至100mL容量瓶中，作為待測液備用。

取待測液5mL于25mL容量瓶中用50%乙醇溶液定容。按照測定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法測定其吸光度A。從桑葉中提取總黃酮的含量可按下式計(jì)算：

桑葉中總黃酮的提取率可按下式計(jì)算：

2　結(jié)果與分析

2.1桑葉中總黃酮的測定結(jié)果

按照1.2.3提取方法和測定方法，測定桑葉中總黃酮的含量為2.78%。此結(jié)果作為桑葉的“真實(shí)”含量，為下文計(jì)算超聲波各因素提取效果作準(zhǔn)備。

2.2丙酮濃度對(duì)超聲提取效果的影響

按照1.2.3前處理方法，分別使用30%、40%、50%、60%、70%的丙酮，料液比為1：10，溫度30℃，超聲提取30min。丙酮濃度對(duì)總黃酮提取率的影響見圖2（見下頁）。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果得出丙酮濃度為50%時(shí)，提取效果最好。

2.3溫度對(duì)超聲提取效果的影響

按照1.2.3前處理方法，分別用30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的提取溫度。以50%的丙酮，料液比為1：10，超聲提取30min。溫度對(duì)總黃酮提取率的影響見圖3。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果得知：溫度在高于40℃時(shí)，其對(duì)總黃酮的提取率影響較小。60℃時(shí)提取效果相對(duì)較好。

圖2　丙酮對(duì)總黃酮提取率的影響

圖3　溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

2.4料液比對(duì)超聲提取率的影響

按照1.2.3前處理方法，分別用1:5、1:10、1:15、1:20、1:25的料液比在60℃下，有50%的丙酮超聲提取30min。料液比對(duì)總黃酮的提取率的影響見圖4。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，當(dāng)料液比為1:20時(shí)，總黃酮的提取率最高。

圖4　料液比對(duì)總黃酮提取率的影響

2.5超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響

按照1.2.3前處理方法，使用50%丙酮溶劑，料液比為1:20，溫度60℃，分別超聲提取10min、20min、30min、40min、50min、60min。超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響見圖5。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可以看出，隨著超聲時(shí)間的延長在30min內(nèi)，提取率有明顯提高。在30min后，提取率升高不明顯。

圖5　超聲提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

2.6正交試驗(yàn)對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化

表2　正交試驗(yàn)因素水平表

表3　總黃酮提取正交試驗(yàn)結(jié)果

為了獲取桑葉中總黃酮的最佳提取條件，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以丙酮濃度、超聲溫度、料液比和超聲時(shí)間四個(gè)因素水平進(jìn)行正交試驗(yàn)［7］。正交試驗(yàn)因素水平見表2。正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。

從表3中極差R值可以看出，四種因素對(duì)桑葉中總黃酮的提取結(jié)果影響大小依次為：A=B＞C＞D。提取桑葉中總黃酮的最佳提取條件為A2B2C3D2，即料液比1: 20，50%丙酮在70℃提取40min。驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果表明，采用最佳提取條件桑葉中總黃酮的提取率可以達(dá)到98.6%。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4　驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照1.2.3提取方法和測定方法，采用最佳提取工藝條件，分別在0min、30min、60min、90min、120min時(shí)間點(diǎn)上進(jìn)行測定。RSD=0.22%，結(jié)果表明，桑葉中總黃酮的吸光度值在2h內(nèi)基本穩(wěn)定。結(jié)果見表5。

表5　穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3　結(jié)論

本文對(duì)超聲波提取方式提取桑葉中總黃酮進(jìn)行了初步研究。以丙酮—水系統(tǒng)作為溶劑，采用四因素三水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)桑葉中總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，最終確定桑葉中總黃酮的最佳提取參數(shù)為：丙酮濃度50%、超聲波溫度70℃、超聲時(shí)間為40min、料液比為1:20。在此工藝條件下，桑葉總黃酮的提取率可高達(dá)98.6%，且在2h內(nèi)吸光度值穩(wěn)定。結(jié)果表明該方法提取率高，穩(wěn)定性好，且超聲波提取方式簡單，易于掌握，為進(jìn)一步研究提供科學(xué)依據(jù)。

［1］國家藥典委員會(huì)中華人民共和國藥典 ［M］.中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

［2］中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所.中藥志（第五冊(cè)）［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1960:98-102.

［3］毛紅騫，高紅林.桑葉的主要成分功能及其在食品中的應(yīng)用［J］.江蘇調(diào)味副食品，2009，26（1）:30-36.

［4］曲中堂，王光利，項(xiàng)昭保，等.青果總黃酮的含量測定及超聲提取工藝研究［J］.食品工業(yè)科技，2012，33（7）:291-294.

［5］李盈蕾，陳建華.蕎麥總黃酮提取工藝研究 ［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（6）:2201-2202.

［6］黃澤元，王海濱，劉志偉，等.芝麻葉中總黃酮的最佳提取工藝研究［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2004，20（6）:201-204.

［7］劉軍海，任惠蘭，裘愛泳.杜仲葉中總黃酮的提取工藝研究［J］.食品與機(jī)械，2007，23（4）:92-94.

Study on the Extraction Technology of Total Flavones from Mulberry Leaves

MU Jian-feng
（Animal Health Inspection in Runan Plain，Zhumadian 463000，China）

Total flavonoids from mulberry leaves were determined in this paper，Optimization of extraction process of total flavonoids in mulberry leaves by orthogonal test.The acetone-water system solvent，ultrasonic extraction to extract the best extraction technology of total flavonoids in mulberry leaves.The test results showed that the content of total flavonoids from mulberry leaves was 2.78%.The optimum process paramenters were acetone concentration of 50%，ultrasonic temperature 70℃，ultrasonic time 40min，ratio of solid to liquid was 1：20.Under these conditons，the recovery rate of total flavonoids from mulberry leaves is 98.6%，RSD 0.22%，the absorbance was stable within 2h.This method good reproducibility，simple，easy to operate.

Mulberry leaves；total flavonoids；orthogonal test；extraction process

Q946

A

1008-1038（2016）08-0012-04

2015-12-19

穆建峰（1980.11—），男，助理畜牧師，主要從事畜牧獸醫(yī)方面工作