具有優(yōu)良拮抗沙門氏菌能力的乳酸桿菌的研究

張卉，錢國強(qiáng)，*，李賓（.黃淮學(xué)院護(hù)理學(xué)系，河南駐馬店463000；.黃淮學(xué)院生物工程系，河南駐馬店463000）

具有優(yōu)良拮抗沙門氏菌能力的乳酸桿菌的研究

張卉1，錢國強(qiáng)1，*，李賓2
（1.黃淮學(xué)院護(hù)理學(xué)系，河南駐馬店463000；2.黃淮學(xué)院生物工程系，河南駐馬店463000）

沙門氏菌是常見的食源性致病菌之一，有研究報(bào)道乳酸桿菌可以有效的抑制某些致病菌，然而對于能夠拮抗沙門氏菌的乳酸桿菌的報(bào)道并不常見。篩選出了一株具有優(yōu)良拮抗沙門氏菌能力的乳酸桿菌，并對其抑菌物質(zhì)的特性進(jìn)行研究；結(jié)果表明3號(hào)植物乳桿菌（L.plantarum）對沙門氏菌具有較強(qiáng)的抑制能力，其抑菌物質(zhì)中包含了細(xì)菌素、有機(jī)酸和過氧化氫。此外，乳酸桿菌的抑菌物質(zhì)也具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。

沙門氏菌；乳酸桿菌；拮抗；抑菌物質(zhì)

沙門氏菌（Salmonella）屬于腸桿科，無芽胞革蘭氏陰性桿菌，能夠感染人導(dǎo)致嚴(yán)重的食物中毒和敗血癥，嚴(yán)重的危害著消費(fèi)者的身體健康［1-2］。該病原菌主要通過污染豬肉、雞蛋、新鮮果蔬和牛奶等食品侵染人體，由于上述原因引起的食物中毒占每年我國食源性疾病的70%～80%［3-6］。目前，防治沙門氏菌疾病的主要方法是使用抗生素藥物，然而，抗生素的長期使用會(huì)導(dǎo)致日益嚴(yán)重的耐藥性和抗生素藥物殘留的問題［7］。因此，一種不依賴于抗生素的沙門氏菌抑制方法顯得十分必要。乳酸桿菌是一種能夠定植于人體腸道，并對人體的腸道疾病有一定的治療作用，其中則包含了由于沙門氏菌感染造成的腹瀉，這也說明了乳酸桿菌對沙門氏菌具有一定的拮抗能力［8-9］。

本試驗(yàn)選取經(jīng)過初步篩選已經(jīng)確定具有拮抗沙門氏菌的8株乳酸桿菌，對其進(jìn)行耐人工胃液和腸液實(shí)驗(yàn)，并將其與沙門氏菌進(jìn)行共培養(yǎng)，篩選出了具有優(yōu)良拮抗沙門氏菌能力的乳酸桿菌，初步確定了乳酸桿菌的抑菌物質(zhì)，分析了pH及熱對乳酸桿菌抑菌成分的影響，為食源性沙門氏菌的防控和治療提供了理論依據(jù)。

1　材料與儀器

1.1主要材料

1.1.1供試菌株

鼠傷寒沙門氏菌（S.typhimurium ATCC 14028），本試驗(yàn)中的8株乳酸桿菌已經(jīng)利用牛津杯法進(jìn)行了初步的篩選，且其來源，菌屬等信息如表1所示，上述供試菌株均來自本實(shí)驗(yàn)室菌種庫。

表1　乳酸桿菌菌株信息Table 1　Lactobacillus strain information

1.1.2試劑

溶菌肉湯（Lysogeny Broth，LB）、緩沖蛋白胨水（Buffered Peptone Water，BPW）、DHL瓊脂培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基、XLD培養(yǎng)基：上述培養(yǎng)基均購買自青島海博生物有限公司；胰蛋白酶（15.23 U/mg）：北京綠源大德生物科技有限公司；牛膽鹽、過氧化氫酶（70.5U/mg）：上海至鑫化工有限公司；蛋白酶K（14.88 U/mg）：上海士鋒生物科技有限公司。

1.2試驗(yàn)儀器

BANTE930型精密pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SII立式高壓蒸汽滅菌鍋：濟(jì)南思卓醫(yī)療器械有限公司；DNP-9272A恒溫培養(yǎng)箱：常州諾基儀器有限公司；A1301049低溫高速離心機(jī)：上海艾測電子科技有限公司；生物潔凈工作臺(tái)：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司。

2　方法

2.1乳酸桿菌人工胃腸液耐受性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Huang等［10］的方法配置人工胃液和人工腸液，人工胃液中含有3 g/L的胃蛋白酶、5 g/L生理鹽水，調(diào)整pH為2.0，人工腸液中含有1 g/L的胰蛋白酶、0.3 g/L牛膽鹽、5 g/L生理鹽水，調(diào)整pH為8.0。乳酸桿菌在MRS液體培養(yǎng)基37℃條件下過夜培養(yǎng)，離心（6 000 r/min，8 min，4℃）得到菌體，用PBS緩沖液清洗菌體兩次，將菌體分別重懸在人工胃液和腸液中，37℃保持2 h，最后利用MRS培養(yǎng)基進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

2.2具有優(yōu)良拮抗沙門氏菌的乳酸桿菌的復(fù)篩

2016年全旗共抽檢產(chǎn)地蔬菜1293個(gè)樣品、食用菌樣品39個(gè)、畜產(chǎn)品樣品129個(gè)，合格率均為100%。2017年共抽檢產(chǎn)地蔬菜2516個(gè)樣品、畜產(chǎn)品42個(gè)樣品，合格率均為100%，瘦肉精共抽檢340個(gè)活畜尿樣，檢測結(jié)果未發(fā)現(xiàn)疑似陽性案例，飼料共抽檢57個(gè)樣品，合格率為98.2%。群眾一日三餐擔(dān)憂和害怕農(nóng)畜產(chǎn)品不能吃、不敢吃的心理已基本化解和消除。

將100 μL的沙門氏菌菌液接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18 h，然后在瓊脂培養(yǎng)基中三區(qū)劃線。挑取上述微生物的單菌落，在LB培養(yǎng)基中活化，離心取懸浮液，調(diào)節(jié)濃度在107CFU/mL。利用相同的方法，利用MRS培養(yǎng)基調(diào)節(jié)乳酸桿菌的濃度為107CFU/mL，并加入10%（體積比）的上述濃度的乳酸桿菌在沙門氏菌中，上述的混合菌液在37℃下培養(yǎng)48 h，分別在0、24 h和48 h時(shí)在XLD培養(yǎng)基上對沙門氏菌進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

2.3乳酸桿菌抑菌物質(zhì)的初步分析

根據(jù)王剛等［11］的報(bào)道配置乳酸桿菌上清液，在上清液中分別加入蛋白酶K（200 μg/mL）、胰蛋白酶（200 μg/mL）和過氧化氫酶（1 mg/mL），均在37℃下保持1 h，采用牛津杯法，吸取250 μL108 CFU/mL的沙門氏菌懸浮液涂布在瓊脂培養(yǎng)基中，菌液干燥后加入100 μL乳酸桿菌上清液，在37℃下培養(yǎng)48 h，測量抑菌圈的直徑。

2.4pH對抑菌效果的影響

調(diào)整乳酸桿菌上清液pH至6.5，并以原始乳酸桿菌上清液為對照，8株乳酸桿菌上清液pH范圍為3.0～3.8。分別測定上述上清液的抑菌能力，方法如2.3所示。

2.5抑菌物質(zhì)熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將供試乳酸桿菌上清液在100℃條件中保持30min，測定上清液的抑菌能力，測定方法如2.3。

所有測定試驗(yàn)都重復(fù)3次，利用SPSS17.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，選擇Tukey's檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)可視為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上差異顯著。

3　結(jié)果與分析

3.1乳酸桿菌對人工胃液和人工腸液的耐受能力為了分析8株乳酸桿菌對胃液和腸液的耐受能力，本試驗(yàn)利用人工胃液和人工腸液模擬了人體的胃腸環(huán)境，并記錄8株乳酸桿菌的變化，結(jié)果如表2所示。

表2　乳酸桿菌在人工胃液和人工腸液中的耐受性分析Table 2　Tolerance analysis of Lactobacillus strains in simulated gastric and simulated small intestinal juices

由表2可知，8株乳酸桿菌在人工胃液（pH=2.0）中2 h后平均下降了2.07個(gè)數(shù)量級（P＜0.05），除了L. rhamnosus和L.bulgaricus以外，其他的6株乳酸桿菌經(jīng)過人工胃液的作用菌落總數(shù)均能達(dá)到107CFU/mL；在人工腸液（pH=8.0）中保持2 h后，L.rhamnosus和L. bulgaricus的數(shù)量發(fā)生了顯著的減少（P＜0.05），分別降低了0.8和0.81個(gè)數(shù)量級，其他6株乳酸桿菌在人工腸液的作用下沒有發(fā)生明顯的變化。一般情況下乳酸桿菌在腸道中發(fā)揮作用，且107CFU/mL以上的活菌數(shù)才能發(fā)揮其益生作用。因此，在8株乳酸桿菌中L. rhamnosus和L.bulgaricus對人工胃液和人工腸液的耐受能力較弱，不宜進(jìn)行進(jìn)一步的篩選。

3.2具有優(yōu)良拮抗沙門氏菌能力的乳酸桿菌的復(fù)篩

將10%（體積比）107CFU/mL的經(jīng)過人工胃腸液處理的乳酸桿菌與相同濃度的沙門氏菌共同培養(yǎng)，并以添加相同體積LB培養(yǎng)基的沙門氏菌做為對照，復(fù)篩出具有優(yōu)良拮抗沙門氏菌能力的乳酸桿菌，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，與對照組相比，6株乳酸桿菌都對沙門氏菌起到了抑制作用，并且這種拮抗作用隨著時(shí)間的延長而加強(qiáng)，其中編號(hào)為3的L.plantarum對沙門氏菌的拮抗作用最強(qiáng)，且3株植物乳桿菌的抑菌能力也都高于其他3株乳酸桿菌，這說明植物乳桿菌對沙門氏菌的拮抗能力總體較強(qiáng)。

3.3乳酸桿菌抑菌物質(zhì)的初步分析

利用蛋白酶K、胰蛋白酶和過氧化氫酶處理乳酸桿菌的上清液，之后利用牛津杯法測定乳酸桿菌的抑菌能力，結(jié)果如表3所示。

圖1　乳酸桿菌活菌與S.typhimurium共培養(yǎng)下S.typhimurium的活菌數(shù)Fig.1 The live cell counts of S.typhimurium in the co-culture with Lactobacillus

由表3可知，經(jīng)過上述3種酶處理后的乳酸桿菌上清液和未處理的上清液相比，沙門氏菌抑菌圈的直徑都有所的減小，其中編號(hào)為1、2和3的植物乳桿菌的抑菌圈直徑顯著減少（P＜0.05），其他乳酸桿菌作用的沙門氏菌抑菌圈減小不顯著（P＞0.05）。結(jié)合3.2中的結(jié)果，植物乳桿菌對沙門氏菌的抑菌活力較強(qiáng)，然而酶作用后上清液的抑菌能力顯著下降，這說明蛋白酶K、胰蛋白酶和過氧化氫酶破壞了上清液中的抑菌物質(zhì)，因此這種抑菌物質(zhì)中應(yīng)該包含細(xì)菌素和過氧化氫。此外經(jīng)過酶左右后抑菌能力雖然降低但是并沒有完全消失，這說明應(yīng)該還存在其他的抑菌物質(zhì)。

3.4pH值和熱處理對抑菌效果的影響

通過調(diào)節(jié)乳酸桿菌上清液pH值和在100℃中保持30 min的方式，分析pH值和熱處理對乳酸桿菌抑菌能力的影響，結(jié)果如表4所示。由表4可知，未處理的乳酸桿菌上清液的pH在3.0～3.8，當(dāng)調(diào)節(jié)pH為6.5后，乳酸桿菌的抑菌能力明顯下降（P＜0.05），上述結(jié)果與之前的報(bào)道相似，分析其原因，是因?yàn)檩^低的pH下上清液中的有機(jī)酸處于一個(gè)未解離的狀態(tài)更有利于進(jìn)入沙門氏菌細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抑菌作用［12］。這也說明在6株乳酸桿菌中的抑菌物質(zhì)中都含有有機(jī)酸。同時(shí)，熱穩(wěn)定試驗(yàn)結(jié)果表明，在6株乳酸桿菌中1、2、3號(hào)植物桿菌的抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性較好，其他3株乳酸桿菌在100℃，30 min條件下抑菌物質(zhì)的抑菌活性顯著降低（P＜0.05）。

表3　蛋白酶K、胰蛋白酶和過氧化氫酶對乳酸桿菌抑菌效果的影響Table 3　Effects of proteinase K，trypsin and catalase on antibacterial effect of Lactobacillus

表4pH值和熱處理對乳酸桿菌抑菌效果的影響Table 4　Effects of pH value and heat treatment on antibacterial effect of Lactobacillus

4　結(jié)論

8株乳酸桿菌中，3號(hào)植物乳桿菌對沙門氏菌的拮抗能力最強(qiáng)，且具有耐受人工胃液和人工腸液的能力。3號(hào)植物乳桿菌上清液中的抑菌物質(zhì)包含了細(xì)菌素、有機(jī)酸和過氧化氫，且上述抑菌物質(zhì)的混合物具有一定的熱穩(wěn)定性。

［1］夏瑪麗，王復(fù)元，孟煒，等.一起腸炎沙門氏菌引起食物中毒的調(diào)查［J］.中國公共衛(wèi)生管理，2008，24（4）：443-444

［2］周文華，吳惠，李永杰.小兒鼠傷寒沙門氏菌病流行病學(xué)分析［J］.河南預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2000（2）：85-86

［3］侯小剛，劉書亮，韓新鋒，等.四川部分地區(qū)豬肉產(chǎn)業(yè)鏈中沙門氏菌的分離及其鑒定［J］.食品科學(xué)，2013，34（11）：250-253

［4］王晶鈺，董睿，王利勤，等.市售鮮雞蛋中沙門氏菌的分離鑒定及毒力島基因檢測［J］.食品科學(xué)，2012（16）：154-158

［5］馬晨，李建國，程景.沙門氏菌在鮮切蔬菜中生長行為及其預(yù)測模型構(gòu)建［J］.食品工業(yè)科技，2016，37（4）：123-127

［6］覃海元，潘嫣麗.奶粉中沙門氏菌的風(fēng)險(xiǎn)評估［J］.中國乳品工業(yè)，2009，37（10）：50-52

［7］楊保偉.食源性沙門氏菌特性及耐藥機(jī)制研究［D］.咸陽：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2010

［8］Higgins S E，Higgins J P，Wolfenden A D，et al.Evaluation of a Lactobacillus-based probiotic culture for the reduction of Salmonella enteritidis in neonata l broiler chicks［J］.Poultry Science，2008，87（1）：27-31

［9］Tellez A，Corredig M，Turner P V，et al.A peptidic fraction from milk fermented with Lactobacillus helveticus，protects mice against Salmonella infection［J］.International Dairy Journal，2011，21（9）：607-614

［10］Huang Y，Adams M C.In vitro assessment of the upper gastrointestinal tolerance of potential probiotic dairy propionibacteria.［J］.International Journal of Food Microbiology，2004，91（3）：253-260

［11］王剛，金星，印伯星，等.1株具有拮抗空腸彎曲桿菌作用的唾液乳桿菌的研究［J］.中國食品學(xué)報(bào)，2014，14（12）：6-12

［12］Li R，F(xiàn)ei P，Man C X，et al.Tea polyphenols inactivate Cronobacter sakazakii isolated from powdered infant formula［J］.Journal of Dairy Science，2015，99（2）：1019-1028

Study of Lactobacillus Strains with Antagonistic Activity against Salmonella

ZHANG Hui1，QIAN Guo-qiang1，*，LI Bin2
（1.Department of Nursing，Huanghuai College，Zhumadian 463000，Henan，China；2.Department of Biological Engineering，Huanghuai College，Zhumadian 463000，Henan，China）

Salmonella is one of the common foodborne pathogenic bacteria.Some studies had reported that Lactobacillus could effectively inhibit some pathogenic bacteria，however，the reports of Lactobacillus strains with antagonistic activity against Salmonella were not common.A Lactobacillus strain with good antagonistic activity against Salmonella was selected，and the characteristics of antibacterial substance was revealed.Results showed that the No.3 L.plantarum had a stronger inhibition to Salmonella.The antibacterial substances contained bacteriocins，organic acid and hydrogen peroxide.In addition，the antibacterial substances of Lactobacillus also had strong thermal stability.

Salmonella；Lactobacillus；antagonistic activity；antibacterial substance

2016-05-12

2014河南省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（14B180006）；2012年河南省科技發(fā)展項(xiàng)目（122102310264）；黃淮學(xué)院青年骨干教師資助計(jì)劃（0700.16.01.1140）

張卉（1981—），女（漢），講師，碩士研究生，研究方向：生物學(xué)及應(yīng)用、微生物學(xué)。