不同氮處理茶樹(shù)實(shí)時(shí)定量PCR內(nèi)參基因篩選和驗(yàn)證

劉圓，王麗鴛，韋康，成浩，張芬，吳立赟，胡娟

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不同氮處理茶樹(shù)實(shí)時(shí)定量PCR內(nèi)參基因篩選和驗(yàn)證

劉圓，王麗鴛*，韋康，成浩*，張芬，吳立赟，胡娟

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所 國(guó)家茶樹(shù)改良中心，浙江 杭州 310008

為篩選不同氮處理下茶樹(shù)（）實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）試驗(yàn)體系中最佳內(nèi)參基因，以茶樹(shù)幼葉、成熟葉和幼根為材料，應(yīng)用qRT-PCR分析、、、、-tubulin、等6個(gè)內(nèi)參基因在不同氮濃度和氮源處理下的表達(dá)變化，借助GeNorm和NormFinder程序?qū)蜻x內(nèi)參基因穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，在不同氮濃度和氮源處理下，、-actin和表達(dá)穩(wěn)定性較好，+組合穩(wěn)定性最佳，可用作茶樹(shù)基因表達(dá)研究的內(nèi)參基因；而-tubulin和表達(dá)穩(wěn)定性較差，不適合做內(nèi)參基因。為進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)果，分別以、-tubulin 、+組合為內(nèi)參基因，分析茶樹(shù)幼葉中硝酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（）和銨根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（）的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)以和+組合為內(nèi)參基因時(shí)，目的基因的相對(duì)表達(dá)量隨處理時(shí)間延長(zhǎng)變化規(guī)律基本一致；而以-tubulin為內(nèi)參基因時(shí)，目的基因的變化規(guī)律與前兩者存在明顯差別。因此，根據(jù)特定試驗(yàn)體系選擇合適的內(nèi)參基因?qū)τ趒RT-PCR定量結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性具有重要意義。

茶樹(shù)；內(nèi)參基因；氮處理；qRT-PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative real-time reverse-transcriptase PCR, qRT-PCR）因其定量準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好、高通量等特點(diǎn)已廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)水平檢測(cè)[1-3]。在qRT-PCR相對(duì)定量檢測(cè)中，為避免不同樣品在RNA質(zhì)量、逆轉(zhuǎn)錄效率和PCR反應(yīng)條件上可能存在的差異，通常選擇相應(yīng)的內(nèi)參基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化[4-5]。然而，近年來(lái)的研究表明，在不同組織、器官、發(fā)育時(shí)期和不同試驗(yàn)條件下都穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因并不存在[6-7]，因此，根據(jù)特定試驗(yàn)體系選擇穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，已成為qRT-PCR結(jié)果準(zhǔn)確可靠的重要前提。

目前，不同氮處理下內(nèi)參基因的篩選及定量表達(dá)研究在黃瓜[8]、玉米[9]、番茄[10]、咖啡[11]和鹽角草[12]上已有報(bào)道，而茶樹(shù)中則主要集中在病害、蟲(chóng)害、冷害、干旱和鹽脅迫等方面[13-17]，不同氮素濃度和氮源處理下內(nèi)參基因篩選研究未見(jiàn)報(bào)道。氮素作為茶樹(shù)生長(zhǎng)的必需元素，與茶樹(shù)新梢產(chǎn)量及品質(zhì)密切相關(guān)[18]。不同氮素處理下，植物生理功能會(huì)受到不同程度的影響，同時(shí)mRNA和蛋白質(zhì)水平也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的改變[19-20]。因此，篩選不同氮處理下穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因?qū)Σ铇?shù)功能基因研究具有重要意義。

本研究選取6個(gè)候選內(nèi)參基因，包括核糖體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因、肌動(dòng)蛋白基因-actin、微管蛋白基因、1,5-二磷酸核酮糖脫羧酶/加氧酶基因、核糖體蛋白基因，采用qRT-PCR技術(shù)，結(jié)合GeNorm和NormFinder程序?qū)λ鼈冊(cè)诓煌幚硐虏铇?shù)不同組織間的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期篩選出不同氮處理下穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，為后續(xù)茶樹(shù)氮吸收和代謝相關(guān)的功能基因研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

供試茶樹(shù)為生長(zhǎng)在自然光照溫室下的龍井43半年生實(shí)生苗。選取生長(zhǎng)良好、大小一致的茶苗，用蒸餾水清洗后轉(zhuǎn)移至不透光藍(lán)色周轉(zhuǎn)箱（長(zhǎng)45?cm，寬30?cm，高12?cm），每箱28株。營(yíng)養(yǎng)液參照Ruan等[21-22]的配方，氮源為1?mmol·L-1NH4NO3，調(diào)節(jié)pH 6.0，每3?d更換營(yíng)養(yǎng)液并持續(xù)通氣，預(yù)培養(yǎng)30?d。預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)部分茶苗進(jìn)行氮饑餓7?d，然后轉(zhuǎn)至不同氮處理的營(yíng)養(yǎng)液中。

不同氮濃度處理：設(shè)置高氮（5?mmol·L-1NH4NO3）、正常氮（1?mmol·L-1NH4NO3）和缺氮3個(gè)梯度。

不同氮源處理：設(shè)置混合態(tài)氮（1?mmol·L-1NH4NO3）、硝態(tài)氮（2?mmol·L-1NaNO3）和銨態(tài)氮[1?mmol·L-1(NH4)2SO4]3種氮源。

處理期間，每2?d更換一次營(yíng)養(yǎng)液。樣品處理后7?d和15?d，分別取一芽二葉、成熟葉和幼根，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，液氮速凍后－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA的提取和cDNA合成

取50~100?mg茶樹(shù)樣品，TissuelyzerⅡ（QIAGEN）充分研磨，使用RNeasy?Plant Mini Kit提取總RNA，利用NanoDrop 2000c（USA）和1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)核酸質(zhì)量。每個(gè)樣品取1mg總RNA，使用FastQuant RT Super Mix試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)和qRT-PCR分析

本研究選取等6個(gè)基因?yàn)楹蜻x內(nèi)參基因，其中、、引物參照孫美蓮等[13]的方法，其余基因利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并利用Primer-BLAST（http://ncbi.nlm.nih.gov./tools/primer-BlAST）檢測(cè)引物序列的特異性。所有引物由英俊生物技術(shù)有限公司合成（表1）。

qRT-PCR反應(yīng)體系為：SYBR?Premix Ex TaqTM（2×）10.0mL，上、下游引物（10mmol·L-1）各0.8mL，ROX DyeⅡ(50×) 0.4mL，cDNA模板2.0mL，加ddH2O至終體積20.0mL，每個(gè)樣品3次技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)在ABI PRISM?7500 PCR儀（USA）上進(jìn)行，PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30?s；95℃變性5?s，60℃退火延伸34?s，40個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增完畢后，溫度提升至95℃獲取樣品熔解曲線，以確定擴(kuò)增產(chǎn)物特異性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)公式QEΔCt及擴(kuò)增樣品的Ct值，計(jì)算內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)量。其中E為基因擴(kuò)增效率，ΔCt=Ctmin－Ct樣品（Ctmin為樣品中最低Ct值；Ct樣品為每個(gè)樣品Ct值）[23]。采用ΔCt法[24]分析內(nèi)參基因的表達(dá)豐度，使用GeNorm[25]和NormFinder[26]程序?qū)蜻x基因表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對(duì)變異系數(shù)Vn/n+1值確定最佳內(nèi)參基因數(shù)目。一般認(rèn)為當(dāng)Vn/n+1值小于0.15時(shí)，無(wú)需引入新的內(nèi)參基因；反之，則需引入第n+1個(gè)基因[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品總RNA質(zhì)量檢測(cè)

茶樹(shù)各組織樣品的總RNA經(jīng)NanoDrop 2000c和1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，A260/280均在1.8~2.1，A230/260在2.0左右，RNA電泳圖譜帶型清晰，28?S亮度約為18?S的兩倍，表明RNA樣品純度較高，完整性較好，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 內(nèi)參基因引物特異性

以幼葉總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，各個(gè)樣品擴(kuò)增片段大小與預(yù)測(cè)的結(jié)果一致。進(jìn)一步以茶樹(shù)不同組織樣品cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)（圖1），結(jié)果顯示所有基因的熔解曲線均為明顯單一峰，且樣品的PCR擴(kuò)增曲線重復(fù)性較好，表明所設(shè)計(jì)的引物均能特異性擴(kuò)增各個(gè)基因的相應(yīng)產(chǎn)物，不存在引物二聚體，因此可證實(shí)qRT-PCR的分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.3 內(nèi)參基因的表達(dá)分析

qRT-PCR分析了6個(gè)內(nèi)參基因在所有處理樣品中的表達(dá)豐度（圖2），結(jié)果顯示，所有內(nèi)參基因Ct值處于15（，SD±0.92）至33（-tubulin，SD±2.0）之間，大部分內(nèi)參基因的Ct值分布在20~26之間；其中的平均Ct值最高，達(dá)33.4，相對(duì)于其他內(nèi)參基因在所有處理樣品中表達(dá)豐度最低。的平均Ct值最低，為15.4，相對(duì)于其他內(nèi)參基因在所有處理樣品中表達(dá)豐度最高；6個(gè)內(nèi)參基因在所有處理樣品中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)均存在一定變化，其中、和的Ct值標(biāo)準(zhǔn)差較小，表達(dá)豐度相對(duì)穩(wěn)定。而的Ct值標(biāo)準(zhǔn)差最大，表達(dá)穩(wěn)定性最差。

2.4 內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

2.4.1 GeNorm軟件分析

GeNorm通過(guò)分析內(nèi)參基因在不同樣品中表達(dá)穩(wěn)定性值（Expression stability value，M）并進(jìn)行排序，以確定最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。M值越大，穩(wěn)定性越差；反之，則越高。逐步排除高M(jìn)值的基因，直至剩下M值最低的一對(duì)基因。將每次排除高M(jìn)值基因后所剩候選基因重新計(jì)算M值，最后按每次計(jì)算后的M值的平均值進(jìn)行排序即可得到基因穩(wěn)定性趨勢(shì)圖[20,25]。本研究將處理時(shí)間7?d和15?d樣品分成兩組，分別計(jì)算它們?cè)谒刑幚順悠分谢虻谋磉_(dá)穩(wěn)定性（圖3）。從GeNorm分析后的數(shù)據(jù)看，相較7?d處理，15?d處理后所有基因的M值都呈下降趨勢(shì)，這表明可能隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，植物體內(nèi)代謝和生理活動(dòng)變化減弱，整體基因表達(dá)趨于穩(wěn)定。

GeNorm分析表明，6個(gè)內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性各異。在不同氮濃度處理下，幼葉中和-actin穩(wěn)定性最好（圖4-A），成熟葉中和表達(dá)最穩(wěn)定（圖4-B），幼根中-actin和穩(wěn)定性最好（圖4-C）；不同氮濃度處理下不同組織間，-actin和表達(dá)最穩(wěn)定（圖4-D）；不同氮源處理下不同組織間，和-actin穩(wěn)定性最好（圖4-E）；所有處理樣品池中，和-actin表達(dá)最穩(wěn)定（圖4-F）。此外，在大多數(shù)處理下和-tubulin穩(wěn)定性較差。

本研究中各個(gè)處理的V2/3均小于0.15閾值（圖5），表明進(jìn)行基因表達(dá)分析時(shí)最佳內(nèi)參基因數(shù)為2個(gè)。不同氮濃度處理下幼葉、成熟葉和幼根中，分別可選擇+-actin+和-actin+組合為內(nèi)參基因。不同氮源處理下各個(gè)組織及所有處理樣品池中，可使用+-actin組合作為內(nèi)參基因。

2.4.2 NormFinder軟件分析

NormFinder主要基于方差分析對(duì)內(nèi)參基因穩(wěn)定性進(jìn)行排序，并引入不同樣品組間表達(dá)差異[26]。結(jié)果表明（表2），不同氮濃度處理下，在幼葉中表達(dá)最穩(wěn)定，-actin在成熟葉和幼根中表達(dá)最穩(wěn)定。不同氮濃度處理各個(gè)組織間，單基因-actin表達(dá)最穩(wěn)定，+組合表達(dá)穩(wěn)定性最好。不同氮源處理各個(gè)組織和所有處理樣品池中單基因表達(dá)最穩(wěn)定，而穩(wěn)定性最佳的組合分別為+和+。此外，除不同氮濃度處理成熟葉外，NormFinder的分析結(jié)果與GeNorm基本一致。

2.4.3 綜合評(píng)價(jià)

綜合比較2種軟件評(píng)價(jià)結(jié)果（表3），在所有處理樣品池中、-actin和表達(dá)穩(wěn)定性較好，可用作氮處理下內(nèi)參基因。不同氮濃度處理下，成熟葉中表達(dá)最穩(wěn)定的組合為+；不同氮濃度處理幼根和各個(gè)組織間，-actin+為最佳組合；不同氮濃度處理幼葉、不同氮源處理各個(gè)組織間和所有處理樣品池中表達(dá)穩(wěn)定性最好的組合為+-actin。

2.5 內(nèi)參基因穩(wěn)定性驗(yàn)證

硝酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Nitrate transporter, NRT）和銨根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Ammonium transporter，AMT）主要參與植物根系對(duì)硝酸鹽（NO3-）和銨鹽（NH4+）的吸收及在不同組織和器官間轉(zhuǎn)運(yùn)，其中和分別參與植物根系對(duì)硝態(tài)氮低親和吸收和銨態(tài)氮高親和吸收[27-29]。為驗(yàn)證內(nèi)參基因?qū)RT-PCR結(jié)果的影響，根據(jù)不同氮濃度處理下茶樹(shù)幼葉中內(nèi)參基因穩(wěn)定性評(píng)價(jià)結(jié)果，分別以穩(wěn)定性較好的、穩(wěn)定性較差的-tubulin和穩(wěn)定性最佳的組合+-actin為內(nèi)參基因，分析和在幼葉中的表達(dá)模式。由圖6可知，以或+-actin為內(nèi)參基因時(shí)，目的基因的相對(duì)表達(dá)量隨處理時(shí)間延長(zhǎng)變化規(guī)律基本一致，表明這兩個(gè)基因表達(dá)穩(wěn)定性較好；而以-tubulin為內(nèi)參基因時(shí)，目的基因的相對(duì)表達(dá)量變化規(guī)律與前兩者存在明顯差別，表明-tubulin在不同氮處理幼葉中表達(dá)穩(wěn)定性較差，不能對(duì)目的基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行準(zhǔn)確校正。

3 討論

本研究所有處理樣品池中、-actin和3個(gè)內(nèi)參基因穩(wěn)定性最好，可能由于這些基因參與生物體基本生命活動(dòng)。是糖酵解、糖異生及光合作用碳固定循環(huán)過(guò)程中的關(guān)鍵酶，表達(dá)量較高[30]。-actin為生物體維持生命活動(dòng)所必需細(xì)胞骨架的基本成分。真核生物中與核內(nèi)rRNA結(jié)合構(gòu)成60S大亞基，在蛋白質(zhì)生物合成中起重要作用，且具有較強(qiáng)的保守性[31-32]。孫美蓮等[13]研究表明，在茶樹(shù)不同成熟度葉片和愈傷組織中較穩(wěn)定，而在不同器官中-actin最穩(wěn)定。郝姍[16]對(duì)不同逆境條件下茶樹(shù)幼葉研究表明，在冷害、干旱、傷害和鹽脅迫下表達(dá)穩(wěn)定性較好。Jain等[33]研究發(fā)現(xiàn)，在冷害、鹽害、脫水等脅迫處理下水稻幼苗中轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平不變。Ye等[34]對(duì)櫻桃不同基因型和不同組織、器官中基因表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)較穩(wěn)定。作為傳統(tǒng)內(nèi)參基因之一，在茶樹(shù)qRT-PCR中已經(jīng)得到普遍應(yīng)用[35-36]。然而在本研究中，雖然在所有處理樣品中表達(dá)豐度很高，但其除在不同氮濃度處理下成熟葉和幼根中穩(wěn)定性較好外，它在其他處理下穩(wěn)定性并不理想。這可能因?yàn)樵趒RT-PCR中表達(dá)豐度過(guò)高，而目的基因豐度較低，導(dǎo)致定量結(jié)果準(zhǔn)確性降低[25]。和-tubulin在所有處理樣品中表達(dá)穩(wěn)定性均較差，然而Gohain等[14]對(duì)茶樹(shù)不同試驗(yàn)條件下4個(gè)常用內(nèi)參基因穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定性較好。在靈芝[37]不同組織間、鹽角草[12]不同氮脅迫下-tubulin表達(dá)最穩(wěn)定。可見(jiàn)，同樣的內(nèi)參基因在不同作物品種或試驗(yàn)條件下表達(dá)穩(wěn)定性存在很大差異。這可能因?yàn)槠渌鶜w屬的基因家族中不同基因間具有組織特異性或?qū)Σ煌囼?yàn)條件響應(yīng)不同[1,38]。本研究中內(nèi)參基因穩(wěn)定性驗(yàn)證的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)根據(jù)特定試驗(yàn)體系選擇合適的內(nèi)參基因是qRT-PCR定量結(jié)果準(zhǔn)確可靠的關(guān)鍵。此外，在進(jìn)行目的基因表達(dá)分析前，有必要對(duì)內(nèi)參基因在某一具體試驗(yàn)條件下的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)[39]。

本研究中、-actin和3個(gè)內(nèi)參基因在氮處理下穩(wěn)定性均較好，其中作為新的內(nèi)參基因首次在茶樹(shù)內(nèi)參基因研究中得到驗(yàn)證。-tubulin和穩(wěn)定性較差，不適宜用作氮處理下內(nèi)參基因。為消除單一內(nèi)參基因所帶來(lái)的定量偏差，增加結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確度，建議選擇+-actin組合進(jìn)行氮處理下目的基因校正。此外，隨著茶樹(shù)全基因組測(cè)序研究的深入，內(nèi)參基因的獲得將不再局限于幾個(gè)傳統(tǒng)內(nèi)參基因，除了EST數(shù)據(jù)庫(kù)外還可以像擬南芥[40]、水稻[41]等模式生物一樣，利用基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行全基因組搜索并經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證來(lái)獲得更多穩(wěn)定可靠的新內(nèi)參基因[42]。

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Screening and Validation of Reference Genes for Quantitative Real-time PCR Analysis in Tea Plant () under Different Nitrogen Nutrition

LIU Yuan, WANG Liyuan*, WEI Kang, CHENG Hao*, ZHANG Fen, WU Liyun, HU Juan

Tea Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Sciences, National Center for Tea Improvement, Hangzhou 310008, China

The objective of this study was to select the most reliable reference genes for qRT-PCR analysis of target tea plant genes under varying nitrogen source and availability. We chose 6 housekeeping genes which included five commonly used and one new candidates to systematically assess their expression levels at three different tissues (young leaves, mature leaves and roots) under different nitrogen regimes by qRT-PCR. GeNorm and NormFinder software were used to analyze and evaluate the data for reference genes. The results indicated that,andare the best reference genes for normalizing target gene expression in tea plant under different nitrogen nutrition, whereasandare not suitable in many experimental conditions and the best combination (+) was recommended. Meanwhile, the expression levels ofandin young leaves of tea plants were analyzed. The results showed that the variation tendency ofandare exactly consistent when usingand+as reference genes. However, the expression levels of these genes are showed significant differences whenwas used as a reference gene. Thus, validation of

suitable reference genes for specific condition can guarantee the accurate quantification of the target genes in qRT-PCR analysis.

tea plant (), reference gene, nitrogen treatment, qRT-PCR

S571.1；S143.1

A

1000-369X（2016）01-092-10

2015-04-14

2015-07-27

浙江省茶樹(shù)農(nóng)業(yè)新品種選育重大科技專項(xiàng)（2012C12905）、國(guó)家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（nycytx-23）。

劉圓，男，碩士研究生，主要從事茶樹(shù)分子生物學(xué)研究。*通訊作者：chenghao@mail.tricaas.com