缺氧對(duì)紅曲霉桔霉素相關(guān)基因表達(dá)量及產(chǎn)量的影響

馬博雅，張　佳，王雪蓮，王昌祿（.天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；.廊坊出入境檢驗(yàn)檢疫局，河北 廊坊 065000）

缺氧對(duì)紅曲霉桔霉素相關(guān)基因表達(dá)量及產(chǎn)量的影響

馬博雅1，2，張佳2，王雪蓮2，王昌祿1*
（1.天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.廊坊出入境檢驗(yàn)檢疫局，河北 廊坊 065000）

為了比較有氧與缺氧條件下與桔霉素合成相關(guān)的3個(gè)基因表達(dá)量的差異及探討桔霉素產(chǎn)量與相關(guān)基因表達(dá)量之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，將高產(chǎn)桔霉素的紅曲霉MX1分別置于有氧及缺氧條件下培養(yǎng)20 d，動(dòng)態(tài)監(jiān)測桔霉素產(chǎn)量及相關(guān)基因表達(dá)量的變化。有氧條件下桔霉素產(chǎn)量及相關(guān)基因表達(dá)量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢且均在第8天達(dá)到峰值；缺氧條件下，桔霉素產(chǎn)量一直處于較低狀態(tài)且終產(chǎn)量比有氧條件下低40.16%，ctnA基因的表達(dá)量總是低于有氧條件，而orf7基因的表達(dá)量總是高于有氧條件，pksCT基因的表達(dá)量沒有呈現(xiàn)明顯的規(guī)律性。結(jié)果表明，缺氧條件可能是通過抑制ctnA基因的表達(dá)和促進(jìn)orf7基因的表達(dá)來抑制桔霉素的合成，而pksCT基因不是調(diào)控桔霉素合成的關(guān)鍵基因。

紅曲霉；桔霉素；缺氧；基因表達(dá)量

紅曲霉（Monascus）在食品工業(yè)中的應(yīng)用已有悠久的歷史。近年來，由于它能夠生成多種生理活性物質(zhì)而備受各國專家學(xué)者的關(guān)注［1］。然而，紅曲霉在產(chǎn)生對(duì)人體有益的生物活性物質(zhì)的同時(shí)，還會(huì)產(chǎn)生一種真菌毒素—桔霉素。桔霉素主要作用于腎臟，不僅可以致畸、致癌，而且可以誘發(fā)突變［2-3］。

紅曲霉桔霉素的產(chǎn)量受到各種外界環(huán)境因子的影響，如培養(yǎng)基種類［4-6］、溫度［7］、光照［8-9］、pH［10］、物理化學(xué)誘變［11］、溶解氧［12］等。紅曲霉屬于好氧微生物，發(fā)酵液中的溶解氧直接影響著紅曲霉的生長以及次生代謝產(chǎn)物合成。通氣培養(yǎng)紅曲霉有利于菌絲體生長及活性物質(zhì)生成，但桔霉素的產(chǎn)量提高的更為顯著。因此，低氧氣轉(zhuǎn)換系數(shù)是降低桔霉素產(chǎn)量的重要因素。

紅曲霉菌產(chǎn)生的桔霉素屬于聚酮類化合物，由聚酮合酶（polyketide synthase，PKS）基因編碼合成。目前，與桔霉素合成相關(guān)的PKS基因和相應(yīng)基因簇的相關(guān)序列測定及功能分析已有報(bào)道。SHIMIZU T等［13-15］根據(jù)真菌PKS保守區(qū)設(shè)計(jì)簡并引物，從紫色紅曲菌（Monascus purpureus）中克隆得到一段13 kbp的基因組片段，得到桔霉素合成相關(guān)的PKS基因（pksCT）全長，隨后又克隆了pksCT基因的兩側(cè)序列，得到一個(gè)21 kbp桔霉素合成相關(guān)基因簇（共6個(gè)基因，其中包括ctnA）。LI Y P等［16］對(duì)橙色紅曲菌（Monascus aurantiacus）基因組文庫進(jìn)行篩選，對(duì)獲得的克隆子進(jìn)行測序分析后，得到長約43kbp的序列，除了包含SHIMIZUT等［13］報(bào)道的6個(gè)基因外，還有10個(gè)新發(fā)現(xiàn)的開放閱讀框架（openreadingframe，ORF）（包括orf7）。

雖然國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)對(duì)紅曲霉桔霉素進(jìn)行的比較深入的研究，然而在缺氧環(huán)境誘導(dǎo)下桔霉素產(chǎn)量與其合成相關(guān)基因表達(dá)量的對(duì)應(yīng)關(guān)系的研究卻鮮有報(bào)道。本研究從缺氧對(duì)紅曲霉桔霉素產(chǎn)量及其報(bào)道的桔霉素合成相關(guān)的3個(gè)基因（ctnA，pksCT，orf7）的表達(dá)量影響入手，從基因表達(dá)角度解釋缺氧環(huán)境誘導(dǎo)紅曲霉桔霉素代謝機(jī)理，為真菌的次生代謝途徑研究提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株

紅曲霉（Monascus）MX1：天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2培養(yǎng)基

菌種保藏培養(yǎng)基：麥芽汁（糖度10～12°Bx），瓊脂粉2%。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖60 g/L，蛋白胨20 g/L，NaNO310 g/L，MgSO4·7H2O 5 g/L，KH2PO410 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖160 g/L，酵母浸粉40 g/L。

以上培養(yǎng)基均采用高壓蒸汽滅菌，121℃、20 min。

1.1.3化學(xué)試劑

乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）：德國Merck公司；超純水：娃哈哈集團(tuán)有限公司；桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%）：美國Sigma公司。

1.2儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜儀、MX3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：美國Agilent公司；YQX-Ⅱ型厭氧培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.3方法

1.3.1培養(yǎng)條件及方法

將菌種接種于斜面培養(yǎng)基，30℃恒溫培養(yǎng)4 d，制成濃度為2×106個(gè)/mL孢子懸浮液，以每瓶5 mL接種于50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖勻，分別置于有氧與缺氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)樣品做3個(gè)平行。下層發(fā)酵液用于桔霉素的測定，上層菌絲體用于核糖核酸（ribose nucleic acid，RNA）的提取及生物量的測定。

1.3.2樣品處理

準(zhǔn)確吸取0.5 mL紅曲發(fā)酵液，放入10 mL容量瓶中，用無水乙醇定容至10 mL，混勻后60℃水浴1 h，水浴過程中每隔10 min顛倒混勻一次，5 000 r/min離心15 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后備用。

1.3.3桔霉素含量檢測高效液相色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相：乙腈∶甲醇∶水=70∶10∶20（V/V），放置過夜，用磷酸調(diào)pH 2.66～2.68；熒光檢測器，λex=331 nm，λem=500 nm；柱溫：25℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3.4桔霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取5.00 mg桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品用色譜純乙腈定容至10 mL，得到質(zhì)量濃度為500 μg/mL的桔霉素標(biāo)準(zhǔn)母液，配制成質(zhì)量濃度為0、0.10 μg/mL、0.25 μg/mL、2.00 μg/mL、5.00 μg/mL、10.00 μg/mL的桔霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后備用。

1.3.5桔霉素合成相關(guān)基因表達(dá)量測定方法

Takara RNA提取試劑盒、Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄。以美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）上報(bào)道的紅曲霉桔霉素合成相關(guān)各基因序列為參考序列，ctnA（No.AB243687），pksCT（No.AB167465），orf7（No.EU309474）以及內(nèi)參基因actin（No.AJ417880），用NCBIPrimer-BLAST設(shè)計(jì)引物，用以擴(kuò)增紅曲霉MX1上述3個(gè)基因。采用SYBR Green染色，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real time fluorogenic quanti tativePCR，RT-qPCR）方法對(duì)紅曲霉桔霉素合成相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行監(jiān)控。PCR擴(kuò)增程序：95℃、30 s；95℃、5 s，60℃、30 s，72℃、30 s，42個(gè)循環(huán)。

2　結(jié)果與分析

2.1桔霉素含量及紅曲霉產(chǎn)量的測定

桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖如圖1所示，桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為4.830 min。

圖1　桔霉素標(biāo)品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of citrinin standard

桔霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得峰面積（y）對(duì)桔霉素質(zhì)量濃度（x）的線性回歸方程為：y=58.06x，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4。結(jié)果表明，二者線性關(guān)系良好。

紅曲霉發(fā)酵樣品的液相色譜圖如圖3所示，紅曲霉發(fā)酵樣品中桔霉素保留時(shí)間為4.828 min。按照桔霉素標(biāo)準(zhǔn)回歸方程計(jì)算發(fā)酵液中桔霉素含量（以mg/g干菌質(zhì)量計(jì)），紅曲霉菌絲體烘干至恒質(zhì)量，作為干菌質(zhì)量即生物量。

圖2　桔霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of citrinin

圖3　發(fā)酵樣品HPLC色譜圖Fig.3 HPLC of fermentation sample

2.2缺氧對(duì)紅曲霉桔霉素產(chǎn)量的影響

按1.3.1的方法將紅曲霉MX1置于有氧培養(yǎng)箱及厭氧培養(yǎng)箱，30℃恒溫培養(yǎng)20d，生物量及桔霉素產(chǎn)量結(jié)果見圖4。

圖4　有氧與缺氧條件下生物量和桔霉素產(chǎn)量Fig.4 Biomass and citrinin yield under aerobic and anaerobic conditions

由圖4可知，在有氧條件下，桔霉素產(chǎn)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在第8天達(dá)到峰值，為6.64 mg/g干菌質(zhì)量，發(fā)酵最后桔霉素產(chǎn)量降低至2.54 mg/g干菌質(zhì)量；而在缺氧條件下，桔霉素產(chǎn)量一直處于較低的水平，在第18天產(chǎn)量最高，為2.13 mg/g干菌質(zhì)量，發(fā)酵終產(chǎn)量為1.52 mg/g干菌質(zhì)量，比有氧條件下低40.16%。

結(jié)果表明，在缺氧條件下，紅曲霉MX1桔霉素產(chǎn)量顯著低于有氧條件，生產(chǎn)上可以通過控制通氧量來抑制桔霉素的產(chǎn)量。

2.3缺氧對(duì)紅曲霉桔霉素合成相關(guān)基因表達(dá)量的影響

按1.3.5的方法設(shè)計(jì)RT-qPCR實(shí)驗(yàn)所用引物，引物序列如表1所示。

表1　RT-qPCR實(shí)驗(yàn)所用引物Table 1 Primers for RT-qPCR

按照1.3.5的方法，以actin作為內(nèi)參基因，以有氧條件下培養(yǎng)至第6天時(shí)各基因表達(dá)量為單位1，比較有氧條件與缺氧條件下桔霉素合成相關(guān)基因表達(dá)量的差異，基因相對(duì)表達(dá)量測定結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，在有氧條件下，3個(gè)基因的表達(dá)量都呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，而且都是在第8天達(dá)到最高值，這與桔霉素產(chǎn)量變化趨勢一致。在缺氧條件下，只有ctnA基因表達(dá)量與桔霉素產(chǎn)量變化趨勢呈正相關(guān)且與有氧條件相比一直處于較低水平，pksCT基因的表達(dá)量沒有表現(xiàn)出明顯的規(guī)律性，orf7基因的表達(dá)量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而增加且一直高于有氧條件。

由圖5可知，在有氧條件下，3個(gè)基因的表達(dá)量都呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，而且都是在第8天達(dá)到最高值，這與桔霉素產(chǎn)量變化趨勢一致。但在缺氧條件培養(yǎng)下，各基因表達(dá)量的變化各有不同，缺氧條件打亂了相關(guān)基因表達(dá)量與桔霉素產(chǎn)量之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。在缺氧條件下，ctnA基因表達(dá)量與桔霉素產(chǎn)量變化趨勢呈正相關(guān)且與有氧條件相比一直處于較低水平。ctnA基因編碼鋅指轉(zhuǎn)錄因子，是桔霉素合成途徑中的激活因子［14，17］。缺氧條件可能是通過抑制ctnA基因的表達(dá)來抑制桔霉素的合成。pksCT基因是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的與桔霉素合成相關(guān)的基因，一度被認(rèn)為是調(diào)控桔霉素合成的關(guān)鍵基因［13，18-20］。本試驗(yàn)中，在缺氧條件下該基因的表達(dá)量沒有表現(xiàn)出明顯的規(guī)律性，這表明在缺氧條件下，pksCT基因并不是調(diào)控桔霉素合成的關(guān)鍵基因。值得注意的是，鄒樂花等［21］的研究表明，敲除orf7基因后，桔霉素產(chǎn)量是野生型菌株的2.42倍，orf7基因可能對(duì)桔霉素的合成起到抑制作用。由圖5可知，在缺氧條件下orf7基因的表達(dá)量與有氧條件相比顯著升高，這同樣表明了缺氧條件可能是通過促進(jìn)orf7基因的表達(dá)來抑制桔霉素的生成。

圖5　缺氧條件對(duì)桔霉素合成ctnA（A），pksCT（B）及orf7（C）基因表達(dá)量的影響Fig.5 Effect of anaerobic conditions on expression level ofctnA（A），pksCT（B）andorf7（C）genes of the citrinin synthesis

3　結(jié)論

缺氧培養(yǎng)可以顯著降低紅曲霉桔霉素的產(chǎn)量。缺氧條件可以抑制ctnA基因的表達(dá)、促進(jìn)orf7基因的表達(dá)。缺氧條件可能是通過抑制ctnA基因的表達(dá)和促進(jìn)orf7基因的表達(dá)來抑制桔霉素的合成，而pksCT基因不是調(diào)控桔霉素合成的關(guān)鍵基因。

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Effect of anaerobic condition on the citrinin yields and the expression level of citrinin biosynthetic genes inMonascus

MA Boya1，2，ZHANG Jia2，WANG Xuelian2，WANG Changlu1*
（1.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.Langfang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Langfang 065000，China）

In order to compare the difference of expression level of the three genes involved with citrinin synthesis under aerobic and anaerobic conditions and discuss the corresponding relationship between yield and expression level of genes involved，high citrinin-producingMonascusMX1 was cultured for 20 d under the aerobic and anaerobic conditions，respectively.The changes of citrinin yield and expression level of genes involved were monitored dynamically.Under aerobic conditions，both the citrinin yield and expression level of genes involved first increased，then decreased，and reached their highest levels on the 8th day.While under anaerobic conditions，the citrinin yield was in a low level and the final yield of citrinin was 40.16%lower than that under aerobic conditions.The expression level ofctnAgene under anaerobic conditions was always lower than that under aerobic conditions，while the expression level oforf7gene was higher，and the expression level ofpksCTgene had no obvious regularity.The results showed that anaerobic conditions could inhibitionctnAgene expression and promoteorf7gene expression to inhibit the synthesis of citrinin，but pksCTgene was not the key gene of citrinin synthesis.

Monascus；citrinin；anaerobic conditions；expression level of gene

Q786

0254-5071（2016）07-0143-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.031

2016-02-20

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31171729）

馬博雅（1988-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。

王昌祿（1960-），男，教授，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。