亞硒酸鈉對(duì)薇菜發(fā)酵中亞硝酸鹽含量的影響

谷　云，祁勇剛，，張義杰，高　冰

亞硒酸鈉對(duì)薇菜發(fā)酵中亞硝酸鹽含量的影響

谷云1，祁勇剛1，2，張義杰3，高冰2*

（1.武漢市鑫宏食品釀造科研所，湖北 武漢 430051；2.湖北工業(yè)大學(xué) 食品與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430068；3.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北 武漢 430000）

該試驗(yàn)研究了亞硒酸鈉對(duì)薇菜發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽含量的影響。分別添加亞硒酸鈉于自然發(fā)酵和接種發(fā)酵的薇菜，發(fā)現(xiàn)亞硒酸鈉可以降低“亞硝峰”；接種發(fā)酵薇菜，“亞硝峰”比自然發(fā)酵的低，且提前1 d出現(xiàn)，發(fā)酵8 d時(shí)，亞硝酸鹽和硝酸鹽含量皆比自然發(fā)酵的低。以接種發(fā)酵結(jié)束后的亞硝酸鹽含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定了發(fā)酵薇菜中亞硒酸鈉的適宜添加量為0.3 g/L。通過(guò)添加Na2CO3維持發(fā)酵薇菜的pH值為5.0，發(fā)酵薇菜的“亞硝峰”提前1 d出現(xiàn)，且發(fā)酵結(jié)束時(shí)亞硝酸鹽含量由自然pH時(shí)的2.16 mg/kg降為0。亞硒酸鈉分3次添加，每次0.10 g/L時(shí)，“亞硝峰”提前至發(fā)酵3 d時(shí)出現(xiàn)，且添加次數(shù)增多時(shí)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)亞硝酸鹽含量也由一次性添加時(shí)的1.26 mg/kg降低到0.34 mg/kg，而硝酸鹽也由0.13 g/kg降低到0.032 g/kg。

薇菜；亞硒酸鈉；發(fā)酵；亞硝酸鹽；亞硝峰

薇菜（Osmunda japonica），是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值比較高的蕨類植物，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能，被國(guó)內(nèi)外營(yíng)養(yǎng)學(xué)家稱為綠色保健食品，成為深受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者歡迎的“山菜之王”和“山珍”［1-3］。但薇菜味苦澀，不宜直接食用，對(duì)薇菜的研究多集中在漂燙后即食的加工研究，而我國(guó)的薇菜大多也是直接漂燙或干制后，帶水包裝出口到東亞［4-7］。薇菜經(jīng)過(guò)腌漬或發(fā)酵，不僅能去除其苦澀味，而且還能增添其香味。蔬菜腌制或發(fā)酵過(guò)程中都會(huì)產(chǎn)生一定量的亞硝酸鹽，對(duì)人們的健康產(chǎn)生危害［8-13］。硒（Se）是機(jī)體必需的一種微量元素，具有抗氧化、增進(jìn)人體免疫力、抗癌防癌以及延緩衰老等功效［14-15］。研究證實(shí)，機(jī)體對(duì)有機(jī)硒的利用率高于無(wú)機(jī)硒［16］。

亞硝酸鹽含量過(guò)高是腌制蔬菜常見(jiàn)的問(wèn)題，而亞硝酸鹽能使血液中正常攜氧的低鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白，因而失去攜氧能力而引起組織缺氧；亞硝酸鹽同時(shí)還是一種致癌物質(zhì)，據(jù)研究，食道癌與患者攝入的亞硝酸鹽量呈正相關(guān)性，亞硝酸鹽的致癌機(jī)理是：在胃酸等環(huán)境下亞硝酸鹽與食物中的仲胺、叔胺和酰胺等反應(yīng)生成強(qiáng)致癌物N-亞硝胺。亞硝胺還能夠透過(guò)胎盤(pán)進(jìn)入胎兒體內(nèi)，對(duì)胎兒有致畸作用。為了探索亞硒酸鈉對(duì)發(fā)酵薇菜中亞硝酸鹽的影響，本試驗(yàn)對(duì)富硒發(fā)酵薇菜［17］的工藝進(jìn)行了研究，研究了發(fā)酵薇菜中亞硝酸鹽和硝酸鹽含量的變化及消長(zhǎng)關(guān)系，進(jìn)而初步研究其對(duì)亞硝酸鹽和硝酸鹽的影響機(jī)理。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1材料

薇菜：由湖北長(zhǎng)友現(xiàn)代農(nóng)業(yè)股份有限公司提供；食鹽：湖北鹽業(yè)集團(tuán)有限公司；亞硒酸鈉（食品級(jí)）：河南宣源化工原料有限公司。

1.1.2試劑

葡萄糖、酵母膏、瓊脂粉、蛋白胨、牛肉膏、吐溫80、K2HPO4、MgSO4、亞硝酸鈉、硝酸鈉、Na2CO3（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3菌種

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）L1：由湖北工業(yè)大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院提供。

1.2儀器與設(shè)備

752S紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海棱光技術(shù)有限公司；鎘柱：天長(zhǎng)市金橋分析儀器廠；DS-1高速組織搗碎機(jī)：鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；HRN32手持折射儀：德國(guó)托摩根公司；SW-CJ-2D凈化工作臺(tái)：廣州瑞智科學(xué)儀器有限公司；LHS-250SC型智能型恒溫恒濕箱：上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；SLY-2112B型立式雙層大容量恒溫培養(yǎng)搖床：金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司；YM系列A型立式壓力蒸汽滅菌器：上海三申醫(yī)療器械有限公司；PHS-3C雷磁pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3方法

1.3.1薇菜發(fā)酵的工藝流程

1.3.2亞硒酸鈉對(duì)自然發(fā)酵和接種發(fā)酵薇菜中亞硝酸鹽的影響

將新鮮薇菜洗凈，并剪去老梗，瀝干，稱取1 kg移至發(fā)酵壇；用純凈水配制成6%的食鹽水1 kg，并加入亞硒酸鈉0.2 g，混合均勻，一并加入到發(fā)酵壇中，封壇，22℃保溫發(fā)酵8 d，自發(fā)酵開(kāi)始測(cè)定亞硝酸鹽和硝酸鹽含量。試驗(yàn)重復(fù)3次，以不加亞硒酸鈉作為對(duì)照。

同上述操作，加入植物乳桿菌L1種子液50 mL，代替50 mL食鹽水，封壇，22℃保溫發(fā)酵，自發(fā)酵開(kāi)始測(cè)定亞硝酸鹽和硝酸鹽含量。試驗(yàn)重復(fù)3次，以不加亞硒酸鈉作為對(duì)照。

1.3.3薇菜發(fā)酵中亞硒酸鈉添加量的試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將新鮮薇菜洗凈，并剪去老梗，瀝干，稱取1 kg移至發(fā)酵壇；用純凈水配制成6%的食鹽水1 kg，添加亞硒酸鈉，混合均勻，加入到發(fā)酵壇中；加入植物乳桿菌L1種子液50 mL，封壇，22℃保溫發(fā)酵8 d，作5個(gè)處理，編號(hào)分別為A、B、C、D、E，亞硒酸鈉添加量分別為：0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L，自發(fā)酵開(kāi)始測(cè)定亞硝酸鹽含量。

1.3.4薇菜發(fā)酵中亞硝酸鹽影響機(jī)理的初步研究

將新鮮薇菜洗凈，并剪去老梗，瀝干，稱取1 kg，移至發(fā)酵壇；用純凈水配制成6%的食鹽水1 kg，并加入亞硒酸鈉0.3 g/L，混合均勻，一并加入到發(fā)酵壇中，加入植物乳桿菌L1種子液50 mL，封壇，22℃保溫發(fā)酵8 d，通過(guò)添加Na2CO3使發(fā)酵液pH值維持在5.0左右，自發(fā)酵開(kāi)始測(cè)定硝酸鹽和亞硝酸鹽含量，試驗(yàn)重復(fù)3次，以不加亞硒酸鈉作為對(duì)照?？疾靵單徕c對(duì)薇菜發(fā)酵中亞硝酸鹽的影響是否為pH作用，若不是，則說(shuō)明是酶作用。

1.3.5亞硒酸鈉的添加次數(shù)對(duì)薇菜發(fā)酵中亞硝酸鹽的影響

a.將新鮮薇菜洗凈，并剪去老梗，瀝干，稱取1 kg移至發(fā)酵壇；用純凈水配制成6%的食鹽水1 kg，并加入亞硒酸鈉0.3 g/L，混合均勻，一并加入到發(fā)酵壇中，加入植物乳桿菌L1種子液50 mL，封壇，22℃保溫發(fā)酵8 d，通過(guò)添加Na2CO3使發(fā)酵液pH值維持5.0，自發(fā)酵開(kāi)始測(cè)定硝酸鹽和亞硝酸鹽含量，試驗(yàn)重復(fù)3次，作為對(duì)照組；b.操作同“a”，亞硒酸鈉分2次添加，分別在發(fā)酵前和發(fā)酵3 d時(shí)，每次添加量0.15 g/L，試驗(yàn)重復(fù)3次；c.操作同“a”，亞硒酸鈉分3次添加，分別在發(fā)酵前、發(fā)酵2 d和發(fā)酵4 d時(shí)，每次添加量0.1 g/L，自發(fā)酵開(kāi)始測(cè)定硝酸鹽和亞硝酸鹽含量，試驗(yàn)重復(fù)3次。

按照最后確定的亞硒酸鈉的添加量和添加次數(shù)，添加于接種植物乳桿菌L1的薇菜中，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定薇菜中硒的含量，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6測(cè)定方法

硝酸鹽和亞硝酸鹽的測(cè)定：參照GB 5009.33—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》；pH值測(cè)定：采用pH計(jì)測(cè)定；硒含量的測(cè)定：參照GB 5009.93—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中硒的測(cè)定》熒光法。

2　結(jié)果與分析

2.1亞硒酸鈉對(duì)自然發(fā)酵和接種發(fā)酵薇菜中亞硝酸鹽的影響結(jié)果

蔬菜在自然發(fā)酵初期，pH值＞5.5，細(xì)菌種類較多，隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行，pH逐漸降低，一些不耐酸的菌株生長(zhǎng)受到抑制，乳酸菌等產(chǎn)酸菌開(kāi)始成為優(yōu)勢(shì)菌種，而此時(shí)亞硝酸鹽含量也逐漸上升，直至達(dá)到峰值，之后又逐漸降低［19］。亞硒酸鈉對(duì)自然發(fā)酵薇菜中硝酸鹽和亞硝酸鹽的影響結(jié)果如圖1。

由圖1可知，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，硝酸鹽含量逐步降低，而亞硝酸鹽則先升高后降低，出現(xiàn)了“亞硝峰”；通過(guò)對(duì)照組的數(shù)據(jù)比較，添加了亞硒酸鈉，同一發(fā)酵時(shí)間，硝酸鹽含量更低，說(shuō)明其降低的更快，同樣，對(duì)于亞硝酸鹽，其含量也比對(duì)照組低，“亞硝峰”出現(xiàn)的時(shí)間一致，但峰值更低，從31.1 mg/kg降低為28.5 mg/kg；發(fā)酵8 d時(shí)，添加亞硒酸鈉使得薇菜中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量更低。本實(shí)驗(yàn)在一定程度上說(shuō)明，添加亞硒酸鈉既可以降低硝酸鹽含量，又可以降低亞硝酸鹽的含量。

圖1　亞硒酸鈉對(duì)自然發(fā)酵薇菜中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量的影響Fig.1 Effect of sodium selenite on nitrite and nitrate contents in the Osmunda japonicawith natural fermentation

亞硒酸鈉對(duì)人工接種乳酸菌發(fā)酵薇菜中亞硝酸鹽的影響見(jiàn)圖2。由圖2可知，人工接種發(fā)酵薇菜的“亞硝峰”提前1 d出現(xiàn)，并且峰值要比自然發(fā)酵的低，且發(fā)酵8 d時(shí)，硝酸鹽和亞硝酸鹽含量都要比自然發(fā)酵的低。原因可能是人工接種乳酸菌發(fā)酵制備發(fā)酵薇菜，可以使乳酸菌迅速成為優(yōu)勢(shì)菌，抑制雜菌的生長(zhǎng)，縮短發(fā)酵周期，而亞硒酸鈉的添加促進(jìn)了乳酸菌的增殖和轉(zhuǎn)化硝酸鹽和亞硝酸鹽的酶系分泌，從而促進(jìn)硝酸鹽和亞硝酸鹽的轉(zhuǎn)化與降解。

圖2　亞硒酸鈉對(duì)接種發(fā)酵薇菜中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量的影響Fig.2 Effect of sodium selenite on nitrite and nitrate contents in the Osmunda japonicawith inoculated fermentation

2.2薇菜接種發(fā)酵中亞硒酸鈉添加量的試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

薇菜接種發(fā)酵中亞硒酸鈉的添加量對(duì)亞硝酸鹽含量的影響見(jiàn)圖3。從圖3中可以看出，當(dāng)亞硒酸鈉的添加量為0.3 g/L時(shí)，接種發(fā)酵薇菜的“亞硝峰”最低，發(fā)酵結(jié)束后的亞硝酸鹽含量穩(wěn)定在2.17 mg/kg左右，也是所有試驗(yàn)處理中值最低的；當(dāng)其添加量為0.1 g/L和0.2 g/L時(shí)，“亞硝峰”較高，發(fā)酵結(jié)束后亞硝酸鹽含量也較高；當(dāng)亞硒酸鈉的添加量為0.4 g/L、0.5 g/L時(shí)，“亞硝峰”又變大了，且其添加量為0.5 g/L時(shí)，“亞硝峰”晚1 d出現(xiàn)，且峰值更大，亞硝酸鹽含量穩(wěn)定時(shí)的值也變大。綜上分析，薇菜接種發(fā)酵時(shí)亞硒酸鈉的添加量為0.3 g/L時(shí)較合適。

圖3　接種發(fā)酵薇菜中亞硒酸鈉的添加量對(duì)亞硝酸鹽含量的影響Fig.3 Effect of sodium selenite addition on nitrite contents in the Osmunda japonicawith inoculated fermentation

2.3薇菜發(fā)酵中亞硝酸鹽影響機(jī)理的初步研究結(jié)果與分析

圖4　pH對(duì)接種發(fā)酵薇菜中亞硝酸鹽及硝酸鹽含量的影響Fig.4 Effect of pH on nitrite and nitrate content in the Osmunda japonicawith inoculated fermentation

通過(guò)添加Na2CO3維持發(fā)酵液的pH值在5.0左右，研究了pH對(duì)薇菜發(fā)酵中亞硝酸鹽及硝酸鹽的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，調(diào)節(jié)pH的薇菜發(fā)酵中“亞硝峰”明顯比自然pH值的低，并且“亞硝峰”提前1 d出現(xiàn)，發(fā)酵結(jié)束后的亞硝酸鹽含量在發(fā)酵第6天時(shí)低于檢測(cè)限；對(duì)于硝酸鹽，試驗(yàn)組也比對(duì)照組下降的快，發(fā)酵第5天時(shí)，其含量降低到0.04 g/kg，發(fā)酵第6天，含量低于檢測(cè)限。綜上可知，將pH值恒定在5.0左右，“亞硝峰”反而更低，而發(fā)酵結(jié)束后的亞硝酸鹽和硝酸鹽含量低于檢測(cè)限。這說(shuō)明低pH不僅不能促進(jìn)亞硝酸鹽的降解，反而阻止了其徹底降解，亞硝酸鹽不是通過(guò)添加亞硒酸鈉促進(jìn)乳酸菌的快速增殖降低pH而更快的降解的，這可能是亞硒酸鈉的添加促進(jìn)了硝酸鹽還原酶和亞硝酸鹽還原酶的合成與分泌，而pH值為5.0時(shí)，更接近上述2種酶的最適pH值，進(jìn)而促進(jìn)了亞硝酸鹽和硝酸鹽的降解，因此乳酸菌對(duì)亞硝酸鹽的降解主要以酶降解為主。

2.4亞硒酸鈉的添加次數(shù)對(duì)薇菜接種發(fā)酵中亞硝酸鹽的影響研究了亞硒酸鈉添加量和添加次數(shù)對(duì)薇菜發(fā)酵中亞硝酸鹽和硝酸鹽含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5　亞硒酸鈉的添加量與添加次數(shù)對(duì)接種發(fā)酵薇菜中亞硝酸鹽（A）及硝酸鹽（B）含量的影響Fig.5 Effect of sodium selenite addition and adding times on nitrite（A）and nitrate（B）contents in theOsmunda japonicawith inoculated fermentation

由圖5可知，分2次添加亞硒酸鈉，每次0.15 g/L，可以降低“亞硝峰”峰值，當(dāng)分3次添加，每次0.1 g/L時(shí)，“亞硝峰”提前至發(fā)酵3 d時(shí)出現(xiàn)，且發(fā)酵結(jié)束時(shí)亞硝酸鹽含量也逐漸降低，分別降低至1.26 mg/kg和0.34 mg/kg?？梢?jiàn)，分次添加亞硒酸鈉有助于降低亞硝酸鹽含量。分2次或者3次添加亞硒酸鈉對(duì)硝酸鹽影響區(qū)別不大，其發(fā)酵結(jié)束時(shí)的含量也基本相近，為0.032 g/kg，但是比1次添加的發(fā)酵結(jié)束時(shí)的含量（0.13 g/kg）要低很多，因此亞硒酸鈉分3次添加，每次0.1 g/L時(shí)，效果較適宜。按此添加方式制備的發(fā)酵薇菜中硒含量為25.8 μg/100 g（富硒薇菜硒含量≥15 μg/100g）。中國(guó)居民膳食營(yíng)養(yǎng)素參考攝入量速查手冊(cè)規(guī)定18歲以上成年人、孕婦和乳母每天最大攝入量為400 μg［18］、營(yíng)養(yǎng)素參考值（nutrient reference values，NRV）建議量50 μg［19］，即發(fā)酵薇菜每天最大攝入量為1.55 kg、建議量為194 g。

3　結(jié)論

添加亞硒酸鈉于自然發(fā)酵或接種發(fā)酵的薇菜中，均能促進(jìn)薇菜中亞硝酸鹽峰值的降低，且接種發(fā)酵薇菜的“亞硝峰”比自然發(fā)酵的提前1 d出現(xiàn)，峰值更低，且發(fā)酵8 d時(shí)，亞硝酸鹽和硝酸鹽含量也更低。

亞硒酸鈉的添加能促進(jìn)了硝酸鹽還原酶和亞硝酸鹽還原酶的合成與分泌，而pH值為5.0時(shí)，更接近上述2種酶的最適pH值，進(jìn)而促進(jìn)了亞硝酸鹽和硝酸鹽的降解。

多次少量添加能降低“亞硝峰”峰值，促進(jìn)峰值提前出現(xiàn)，且使發(fā)酵薇菜成品中亞硝酸鹽和硝酸鹽含量處于較低值，而發(fā)酵薇菜中較低的硝酸鹽含量，也消除了其大量轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽的隱患。亞硒酸鈉最適添加量為0.3g/L（分3次添加，每次0.1 g/L），按此添加方式制備的發(fā)酵薇菜中硒含量為25.8 μg/100 g（富硒薇菜硒含量≥15 μg/100g）。

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Effect of sodium selenite on nitrite contents inOsmunda japonicafermentation

GU Yun1，QI Yonggang1，2，ZHANG Yijie3，GAO Bing2*
（1.Wuhan Xinhong Institute for Food Fermentation，Wuhan 430051，China；2.Collage of Food and Pharmaceutical Engineering，Huibei University of Technology，Wuhan 430068，China；3.Huibei Provincial Institute for Food Supervision and Test，Wuhan 430000，China）

The effect of sodium selenite on nitrite inOsmunda japonicafermentation was investigated.Sodium selenite could reduce nitrite-peak by adding it in theO.japonicawith natural and inoculated fermentation.The nitrite peak was lower than natural fermentation and appeared 1 d in advance in theO.japonicaby inoculated fermentation.When the fermentation was over at 8 d，nitrite and nitrate content of inoculatedO.japonicawere lower than that of natural fermentation.Using nitrite content after the end of the fermentation as evaluation index，results showed that the suitable sodium selenite was 0.3 g/L.Maintaining the pH 5.0 by adding Na2CO3in theO.japonicafermentation，nitrite-peak appeared 1 d in advance，then nitrite reduced from 2.16 mg/kg to 0 at the end of fermentation.When sodium selenite was added 0.10 g/L per time for three times，nitrite-peak appeared at 3 d，and then nitrite reduced from 1.26 mg/kg to 0.34 mg/kg，and nitrate reduced from 0.13 g/kg to 0.032 g/kg at the end of fermentation.

Osmunda japonica；sodium selenite；fermentation；nitrite；nitrite-peak

TS255.54

0254-5071（2016）07-0127-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.027

2016-03-20

武漢市產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新服務(wù)平臺(tái)項(xiàng)目（201220837301）

谷云（1987-），女，助理工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称钒l(fā)酵。

高冰（1963-），男，高級(jí)工程師，本科，研究方向?yàn)槭称钒l(fā)酵工藝與設(shè)備。