不同發(fā)酵工藝對毛酸漿酵素抗氧化性的影響

李世燕，朱　丹，牛廣財，任躍英，魏文毅，王　贏

不同發(fā)酵工藝對毛酸漿酵素抗氧化性的影響

李世燕1，朱丹2，3*，牛廣財1，任躍英2，魏文毅1，王贏1

毛酸漿（Physalis pubescensL.）別名洋菇娘、黃菇娘等，為茄科酸漿屬多年生草本植物。其大多數(shù)分布在美洲熱帶及溫帶地區(qū)，少數(shù)分布在歐亞大陸及東南亞，在我國主要產(chǎn)地為內(nèi)蒙古呼倫貝爾盟和黑龍江?。?］。毛酸漿是一種藥食兩用植物，具有解除疲勞、消除肌肉疼痛、降低血壓、預(yù)防動脈硬化和心血管疾病的發(fā)生以及保護(hù)皮膚等作用［2-4］，深受大眾的喜愛。

酵素中含有豐富的維生素、酶、礦物質(zhì)和次生代謝產(chǎn)物等營養(yǎng)成分，是一種功能性微生物發(fā)酵產(chǎn)品，它具有抗衰老、抗菌消炎、凈化血液、增強機體免疫能力及解毒抗癌等多種保健功能［5］。近年來，國內(nèi)外對酵素制備及其抗氧化的關(guān)注程度逐漸提高［6］，蔣增良等［7］對藍(lán)莓酵素、葡萄酵素［8］在天然發(fā)酵過程中的抗氧化性能進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓酵素具有高抗氧化性能；賈麗麗等［9］對冬棗酵素發(fā)酵過程中生物學(xué)特性和抗氧化活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)還原力、羥自由基清除率和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）酶活力均不斷升高；董銀卯等［10］也發(fā)現(xiàn)火龍果酵素有很強的生物活性；KRIS-ETHERTON P M等［11］研究表明富含抗氧化成分的食品在防治自由基引起的疾病方面有重要的作用。

但是，目前尚少見到有關(guān)毛酸漿酵素制備與抗氧化性方面的報道。本研究以毛酸漿果為主要原料，采用不同發(fā)酵工藝制備毛酸漿酵素，以還原力、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力和SOD酶活性為評價指標(biāo)，對比分析不同發(fā)酵制備工藝的毛酸漿酵素的抗氧化性，以期選出一種較優(yōu)的發(fā)酵工藝并對其保健功能提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

毛酸漿：黑龍江省大慶市農(nóng)貿(mào)市場；安琪牌葡萄酒用高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）1.557：中科院微生物研究所；蔗糖（白砂糖）：黑龍江北方糖業(yè)股份有限公司；SOD酶活力檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：美國Sigma公司；Tris、鹽酸：天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；甲醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉：天津市大茂化學(xué)試劑廠；鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氯乙酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。試驗所用試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

HR7633型打漿機：珠海經(jīng)濟(jì)特區(qū)飛利浦家庭電器有限公司；DRP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱、SPH-250型生化培養(yǎng)箱：上海森信實驗儀器有限公司；UV-1100型紫外可見分光光度計：上海美譜達(dá)儀器有限公司；Exploter分析天平：奧豪斯儀器上海有限公司；HWS24型恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；WS113手持糖度儀：上海測維光電技術(shù)有限責(zé)任公司；BCN-1360型超凈工作臺：北京東聯(lián)哈爾儀器有限公司；湘儀L420臺式低速自動平衡離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1發(fā)酵方式

（1）菌種的活化

酵母菌活化：將安琪牌葡萄酒用高活性干酵母用10倍水在30～32℃水浴鍋中活化30 min備用。

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）1.557活化：將試管斜面保存的植物乳桿菌1.557接種于100 mL的MRS肉湯培養(yǎng)基中，在37℃條件下培養(yǎng)48 h，備用。

（2）發(fā)酵方式

操作要點：

（1）毛酸漿前處理：選取成熟度好、粒大飽滿、無病蟲害、無霉變的毛酸漿鮮果，去除萼片，清水洗滌后熱燙30 s，冷卻瀝干后將其破碎，得到毛酸漿原漿。

（2）接菌發(fā)酵：將毛酸漿原漿與白砂糖按質(zhì)量比1∶1加入到已滅菌的1 000 mL廣口玻璃瓶中，在無菌操作臺上接菌發(fā)酵。

（3）發(fā)酵方式：①自然發(fā)酵：在室溫條件下，自然發(fā)酵22 d。②先接種酵母菌后接種植物乳桿菌1.557順序發(fā)酵：先接入0.2%活化好的酵母菌在30℃條件下發(fā)酵10 d，再接入1%活化好的植物乳桿菌1.557在37℃條件下繼續(xù)發(fā)酵12 d。③先接種植物乳桿菌1.557后接種酵母菌順序發(fā)酵：先接入1%活化好的植物乳桿菌1.557在37℃條件下發(fā)酵10 d，再接入0.2%活化酵母菌繼續(xù)發(fā)酵12 d。④酵母菌-植物乳桿菌1.557同時接種發(fā)酵：同時接入0.2%已活化好的酵母菌和1%已活化好的植物乳桿菌1.557發(fā)酵22 d。

（4）指標(biāo)測定：在發(fā)酵過程中，定期取樣，樣品經(jīng)3 600 r/min離心15 min后，取上清液用于測定發(fā)酵液的各項指標(biāo)。

1.3.2毛酸漿酵素還原力的測定

取0.2 mL發(fā)酵液，加入2.5 mL磷酸緩沖液（0.2 mol/L，pH=6.6），加入1 mL 10%鐵氰化鉀溶液，于50 mL水浴中20 min，快速冷卻后，加入2.5 mL 20%三氯乙酸溶液，3 600 r/min離心15 min，立即取2.5 mL上清液加入2.5 mL去離子水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵。以去離子水為參比，在波長700 nm處測定吸光度值［12］。以吸光度值A(chǔ)700nm反映毛酸漿酵素還原能力，吸光度值越大，說明還原能力越強，抗氧化性越好。

1.3.3毛酸漿酵素DPPH自由基的清除作用

取40 μL發(fā)酵液加入到4 mL 0.1 mmol/L DPPH-甲醇溶液中，再加入450μL50mmo/LTris-HCl緩沖液（pH=7.4）。25℃條件下恒溫水浴30 min，以去離子水為參比溶液。在波長517 nm條件下測定吸光度值［12］。DPPH自由基清除能力計算公式如下：

式中：A0為空白對照液吸光度值；A1為樣品測定管吸光度值；A2為樣品本底管吸光度值。

1.3.4毛酸漿酵素SOD酶活性的測定

發(fā)酵過程中，每隔6 d取50 mL發(fā)酵液離心取上清液，按照SOD試劑盒說明書測定酶活性［9］。

2　結(jié)果與分析

2.1毛酸漿酵素制備過程中還原力的變化

還原能力是指物質(zhì)提供電子的能力，還原能力強的物質(zhì)能給自由基供應(yīng)電子，使其成為較穩(wěn)定的物質(zhì)，從而中斷自由基的連鎖反應(yīng)［13］。本試驗采用鐵氰化鉀法測定不同發(fā)酵工藝的毛酸漿酵素的還原能力，以顯色反應(yīng)吸光度值的高低反映物質(zhì)還原能力的強弱，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，隨著發(fā)酵時間的延長，自然發(fā)酵和發(fā)酵方式3的還原力都呈先上升后下降的趨勢，還原力分別在發(fā)酵第13天時達(dá)到最大值0.738和1.051。發(fā)酵方式1和發(fā)酵方式2分別出現(xiàn)了兩次快速上升階段，分別是酵母菌快速增值階段和乳酸菌快速增值階段，且酵母菌發(fā)酵階段的上升幅度較乳酸菌發(fā)酵階段更大。發(fā)酵22 d后，各發(fā)酵方式的還原力趨于穩(wěn)定，不同發(fā)酵方式的毛酸漿酵素的還原能力大小排序為：發(fā)酵方式3＞發(fā)酵方式1＞發(fā)酵方式2＞自然發(fā)酵，并且發(fā)酵方式1、發(fā)酵方式2和發(fā)酵方式3的還原力比自然發(fā)酵分別提高了30.74%、27.27%和39.83%，經(jīng)SPASS軟件分析差異顯著（P＜0.05）。說明經(jīng)過酵母菌和植物乳桿菌1.557發(fā)酵，毛酸漿酵素的抗氧化成分在不斷增加，抗氧化活力得到了很大地提高。這可能是酵母菌和植物乳桿菌1.557產(chǎn)生SOD、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和還原型輔酶（nicotinamide adenine dinucleotide hydrogen，NADH）等抗氧化酶類清除活性氧所致［14-15］。

圖1　發(fā)酵過程中還原力變化Fig.1 Changes of reducing power during fermentation process

2.2毛酸漿酵素DPPH自由基清除能力的變化

DPPH法是評價抗氧化能力的常用方法之一，其基本原理為：DPPH在有機溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，呈現(xiàn)深紫色，其孤對電子在波長517 nm附近有強吸收。當(dāng)有自由基清除劑存在時，自由基清除劑與孤對電子配對，使得其吸收消失或減弱，溶液顏色變淺。因此，可以通過吸收減弱的程度，來評價自由基清除劑的活性［16］。由于此法簡單方便，而且DPPH自由基比羥基自由基和超氧自由基更穩(wěn)定，這使得DPPH自由基已被廣泛用于分析抗氧化活性成分的自由基清除能力［17］。

不同發(fā)酵方式的毛酸漿酵素在發(fā)酵過程中DPPH自由基清除能力的變化結(jié)果見圖2。由圖2可知，發(fā)酵22 d后，不同發(fā)酵方式制備的毛酸漿酵素和對照的DPPH自由基清除能力均上升，自然發(fā)酵和發(fā)酵方式1、2和3的DPPH清除率比第1天分別上升了18.97%、22.12%、21.30%和23.02%，經(jīng)SPSS軟件分析差異顯著（P＜0.05）。發(fā)酵22 d后發(fā)酵方式1、2和3與自然發(fā)酵相比分別提高了22.94%、15.49%和26.74%，發(fā)酵方式3在第7天時DPPH自由基清除能力達(dá)到最大值30.97%，此結(jié)果比毛酸漿原液的DPPH自由基青的清除能力高42.01%。在整個發(fā)酵過程中，發(fā)酵方式1和發(fā)酵方式2也出現(xiàn)了兩次快速上升階段，這與還原力的變化趨勢是一致的。造成這種差別的原因可能是由于酵母發(fā)酵階段酚類和黃酮類物質(zhì)被浸提出來，含量均逐漸增加，從而使得酵母發(fā)酵階段的DPPH自由基清除能力逐漸增大。SHAHIDI F等［18］研究也認(rèn)為酚類物質(zhì)能很容易的給出一個氫離子并通過共振雜化而穩(wěn)定，是具有高自由基清除能力的主要原因。另外，也可能是多酚和酵素內(nèi)其他抗氧化物質(zhì)共同作用的結(jié)果。

圖2　發(fā)酵過程中DPPH自由基清除能力的變化Fig.2 Changes of DPPH free radical scavenging ability during fermentation process

2.3毛酸漿酵素制備過程中SOD酶活性的變化

超氧化物歧化酶（SOD）是一種廣泛存在于動、植物及微生物中的金屬酶，是國內(nèi)外公認(rèn)的氧自由基的專一清除劑，與機體衰老、腫瘤發(fā)生、自身免疫性疾病和輻射防護(hù)等有關(guān)。目前，SOD活性已成為抗衰老藥物和抗衰老保健食品的一個重要指標(biāo)［19］。不同發(fā)酵方式制備的毛酸漿酵素在發(fā)酵過程中SOD酶活力的變化見圖3。由圖3可知，隨著發(fā)酵時間的延長，各發(fā)酵方式中SOD酶活力呈上升趨勢，發(fā)酵22 d后，自然發(fā)酵和發(fā)酵方式1、2和3的SOD酶活力分別上升至216.18、399.41、364.01和409.52 U/mL，經(jīng)SPSS分析差異顯著（P＜0.05），四種發(fā)酵方式相比于毛酸漿原漿的SOD酶活力分別提高了23.27%、49.83%、44.95%、52.06%；發(fā)酵方式1、2和3比自然發(fā)酵分別提高了52.93%、39.37%和56.80%。這說明酵母菌和植物乳桿菌1.557均能夠產(chǎn)生超氧化物歧化酶，提高毛酸漿酵素的抗氧化活性。

圖3　發(fā)酵過程中SOD酶活力的變化Fig.3 Changes of SOD activities during fermentation process

2.4討論

近年來，酵素制品風(fēng)靡世界，在營養(yǎng)保健、臨床醫(yī)學(xué)、養(yǎng)生等領(lǐng)域的利用已經(jīng)非常廣泛。然而，目前酵素的制作主要以自然發(fā)酵為主，發(fā)酵過程復(fù)雜且周期較長，工業(yè)上無法批量生產(chǎn)。其次，目前酵素產(chǎn)品的生產(chǎn)大多是日本或臺灣專利，在國內(nèi)售價很高，因此需要積極開發(fā)有自主知識產(chǎn)權(quán)的工藝技術(shù)，以減低生產(chǎn)成本。

目前，酵素的發(fā)酵菌種主要有酵母菌和乳酸菌，本研究用酵母菌和植物乳桿菌1.557進(jìn)行多菌種發(fā)酵，通過調(diào)整發(fā)酵順序?qū)崿F(xiàn)毛酸漿酵素的多工藝發(fā)酵，進(jìn)而選出較優(yōu)的發(fā)酵工藝。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵方式3的還原力在第13天時達(dá)最大值1.051，優(yōu)于藍(lán)莓酵素（第48天，0.538）［7］、葡萄酵素（第56天，0.367）［8］以及7%的核桃青皮果蔬酵素（第180天，0.766）［20］的還原力，這可能是由于毛酸漿經(jīng)酵母菌和植物乳桿菌1.557發(fā)酵產(chǎn)生大量的SOD、谷胱甘肽過氧化物酶和還原型輔酶等抗氧化酶類，不斷清除活性氧，并且毛酸漿酵素中的抗氧化成分在不斷增加，使其抗氧化活力得到了很大提高；DPPH自由基清除能力在第7天時達(dá)最大值30.97%，低于藍(lán)莓酵素（第48天，94.41%）［7］、葡萄酵素（第56天，91.32%）［8］以及7%火龍果酵素（96.5%）［10］的DPPH自由基清除能力。這是由于藍(lán)莓和葡萄中含有大量的酚類物質(zhì)，而火龍果中含有花青素物質(zhì)，它們都具有很強的抗氧化性，從而提高清除DPPH自由基的能力，因而高于毛酸漿酵素的DPPH自由基清除能力；但是毛酸漿酵素發(fā)酵第22天時的SOD酶活性最高達(dá)409.52 U/mL，高于15%的火龍果酵素的SOD酶活性（300 U/mL）［10］，說明毛酸漿酵素發(fā)酵液有很好的自由基清除能力。

3　結(jié)論

研究結(jié)果表明，毛酸漿酵素發(fā)酵22 d后，與自然發(fā)酵相比，3種發(fā)酵工藝的還原力分別提高了30.74%、27.27%和39.83%；DPPH自由基清除能力分別升高了22.94%、15.49%和26.74%；SOD酶活力分別升高了52.93%、39.37%和56.80%。即在整個發(fā)酵過程中，3個人工接種工藝的毛酸漿酵素的抗氧化性均高于自然發(fā)酵，這說明人工接種微生物發(fā)酵可以提高酵素內(nèi)的抗氧化成分，提高其抗氧化性。實驗還表明，同時接種酵母菌和植物乳桿菌1.557的毛酸漿酵素抗氧化性最好，還原力在第10天時達(dá)最大值1.051，DPPH自由基清除能力在第7天時達(dá)最大值30.97%，發(fā)酵第22天時毛酸漿酵素的SOD酶活性最高達(dá)409.52 U/mL。

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（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長春 130118；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

以毛酸漿為主要原料，采用自然發(fā)酵、酵母菌-植物乳桿菌先后順序接種發(fā)酵、酵母菌-植物乳桿菌同時接種發(fā)酵等不同發(fā)酵工藝制備毛酸漿酵素，并對其發(fā)酵過程中的還原力、DPPH自由基清除能力和超氧化物歧化酶（SOD）活性進(jìn)行研究，初步評價不同發(fā)酵工藝對毛酸漿酵素抗氧化性的影響。結(jié)果表明，不同發(fā)酵工藝制得毛酸漿酵素均有較強的抗氧化性，發(fā)酵第22天，與自然發(fā)酵相比，3種人工接種發(fā)酵制備工藝的毛酸漿酵素的還原力分別提高了30.74%、27.27%和39.83%；DPPH自由基清除能力分別提高了22.94%、15.49%和26.74%；SOD酶活性分別提高了52.93%、39.37%和56.80%。其中，酵母菌和乳酸菌同時接種發(fā)酵的毛酸漿酵素產(chǎn)品抗氧化性最好，還原力最高達(dá)1.051，DPPH自由基清除能力最高達(dá)30.97%，SOD酶活性最高達(dá)409.52 U/mL。

毛酸漿；酵素；發(fā)酵工藝；抗氧化性

Effect of different fermentation technologies on antioxidant activity ofPhysalis pubescensenzyme

LI Shiyan1，ZHU Dan2，3*，NIU Guangcai1，REN Yueying2，WEI Wenyi1，WANG Ying1
（1.College of Food，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，China；2.College of Chinese Medicinal Materials，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；3.College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，China）

Physalis pubescensenzyme was prepared by different fermentation technologies（including natural fermentation，yeast-Lactobacillus plantaruminoculated fermentation in order，yeast-Lactobacillus plantaruminoculated fermentation at one time），the reducing power，scavenging capacity to DPPH radical and SOD activity were detected during fermentation，and the effect of different fermentation technologies on the antioxidant activities ofP.pubescensenzyme was studied.The results showed that theP.pubescensenzyme that got from different fermentation technologies had strong antioxidant activity.Compared with the natural fermentation after 22 d，the reducing power of artificial inoculation fermentation improved by 30.74%，27.27%and 39.83%，respectively，the scavenging capacity to DPPH improved by 22.94%，15.49%and 26.74%，respectively.Furthermore，the SOD activity improved by 52.93%，39.37%and 56.80%，respectively.The enzyme of yeast-L.plantaruminoculated fermentation at one time had the optimal antioxidant activity，the reducing power was up to 1.051，the scavenging capacity to DPPH was up to 30.97%and the SOD activity was up to 409.52 U/ml.

Physalis pubescens；enzyme；fermentation technology；antioxidant activity

TS201.2

0254-5071（2016）07-0085-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.018

2016-05-22

黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項目（YJSCX2015-Y49）

李世燕（1989-），女，碩士研究生，研究方向為園產(chǎn)品加工。

朱丹（1972-），女，副教授，博士研究生，研究方向為藥用植物。