臭豆腐鹵水發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分的變化趨勢分析

賀　靜，謝　靚，劉軍鴿，陳淼芬，蔣立文，徐睿烜

臭豆腐鹵水發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分的變化趨勢分析

賀靜1，2，謝靚1，2，劉軍鴿3，陳淼芬3，蔣立文1，2*，徐睿烜1，2

臭豆腐頗具盛名，具有較高營養(yǎng)價值。臭豆腐經(jīng)過了較長時間的發(fā)酵，其所含的蛋白質(zhì)分解為各種氨基酸［1］，并含鈣、磷、鐵、鋅等礦物質(zhì)以及乳酸菌［2-4］，有利于人體腸道吸收，還具有降血壓的生理活性［5-6］；它所含的VB12對老年癡呆癥有良好的預(yù)防效果［7］。臭豆腐鹵水是制造臭豆腐核心原料，用來泡制臭豆腐，不能直接食用。鹵水的原料一般有莧菜梗、竹筍、臭豆豉、香菇等植物性原料［8-10］。臭豆腐鹵水的臭味差異由不同的制造地域及所用鹵水原料決定。

近來，傳統(tǒng)小吃備受關(guān)注，關(guān)于臭豆腐產(chǎn)品的揮發(fā)性成分的研究也越來越多。黃香華等［11］利用水蒸氣蒸餾法結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用儀研究臭豆腐的主體氣味物質(zhì)；鄭小芬等［12］研究了湖南本地的兩種非發(fā)酵型臭豆腐鹵水中的揮發(fā)性成分；劉玉平等［13］利用同時蒸餾萃取法和固相微萃取再結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用儀對老才臣臭豆腐中的揮發(fā)性成分進行提取分析；孫潔雯等［14］利用同時蒸餾萃取法結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用儀研究王致和臭豆腐中的特征香氣成分。而臭豆腐鹵水的氣味成分研究卻較為鮮見。

本試驗采用固相微萃?。╯olid phase microextraction，SPME）結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀的方法測定發(fā)酵不同階段臭豆腐鹵水揮發(fā)性成分，以期找出發(fā)酵過程中氣味成分的變化趨勢以及核心氣味物質(zhì)，為臭豆腐工業(yè)化生產(chǎn)及數(shù)據(jù)化控制提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

原料均來自長沙火宮殿的臭豆腐鹵水，分別為發(fā)酵3個月鹵水（標記為鹵水1號，一代），發(fā)酵一年以上的鹵水（標記為鹵水2號，二代鹵水），發(fā)酵一年半以上鹵水（標記為鹵水3號，三代鹵水），用于生產(chǎn)的泡豆腐水（標記為鹵水4號，四代鹵水）。

1.2儀器與設(shè)備

AUY220分析天平：日本SHIMADZU（島津）公司，GL-3250磁力攪拌器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；DK-98-11A電熱恒溫水浴鍋、101-2AB型電熱鼓風干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；PDMS（50/30 μm）萃取頭：美國Supelco公司；HP6890-5973氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司。

1.3試驗方法

1.3.1樣品預(yù)處理

當首次使用的固相微萃取頭時，萃取頭必須在進樣口進行老化，將PDMS（50/30 μm）萃取頭在270℃的條件下活化60min，直至色譜檢測無雜峰出現(xiàn)。吸取5mL的臭豆腐鹵水放入20 mL SPME樣品瓶中，用密封墊與鋁帽進行密封，密封后在70℃的條件下磁力攪拌加熱平衡15 min，攪拌的速度為650 r/min，將已活化的萃取頭通過隔墊頂空插入樣品瓶內(nèi)，推出纖維頭，使之距樣品液面約1.5 cm，頂空吸附40min，在拔出萃取頭前抽回纖維頭，再將萃取頭插入氣相色譜進樣口，并且推出纖維頭，在250℃條件下解吸5 min。

1.3.2氣相色譜條件

色譜柱為DB-5MS彈性石英毛細管柱（30 cm×0.25 mm× 0.25 μm）；載氣為高純氦氣（99.999%），氦氣流速1.0 mL/min；進樣口溫度250℃；不分流進樣。程序升溫：柱溫45℃，保持1 min，以5℃/min升溫至290℃，保持2 min。

1.3.3質(zhì)譜條件

離子源為電子電離（electron ionization，El）源，離子源溫度200℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流150 μA；倍增器電壓1 037 V；接口溫度220℃；質(zhì)量掃描范圍45～500 m/z。

1.3.4定性定量分析

總離子流色譜圖經(jīng)美國國家標準技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）08標準譜庫檢索定性鑒定出成分，采用面積歸一法進行定量分析，得到各成分在臭豆腐鹵水揮發(fā)性風味物質(zhì)中的相對含量。

2　結(jié)果與分析

2.1 GC-MS鑒定總離子流色譜圖

鹵水1號、2號、3號及4號中揮發(fā)性成分的GC-MS總離子流色譜圖見圖1。

圖1　鹵水1號（A）、2號（B）、3號（C）及4號（D）揮發(fā)性成分的GC-MS總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components of brine NO.1（A），NO.2（B）NO.3（C）and NO.4（D）by GC-MS analysis

2.2氣味物質(zhì)組分鑒定結(jié)果

對GC-MS分析檢測的成分進行譜庫檢索和其他方法核對及確認，對4種鹵水中揮發(fā)性成分鑒定結(jié)果見表1。

表1　不同階段鹵水揮發(fā)性成分的GC-MS鑒定結(jié)果Table 1 GC-MS identification results of volatile components in brine at different stages of production

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

由表1可知，4種鹵水共鑒定出122種成分，其中醇類18種，酸類9種，酯類24種，酮類20種，醛類6種，酚類3種，烷類30種，烯類9種，吲哚3種。

結(jié)合文獻報道，蔣立文等［15］針對湖南瀏陽臭豆豉揮發(fā)性成分作過研究，認為與風味（肯定含有的臭味）密切相關(guān)的且含量較高的是酯類、酸類、吡嗪類。朱照華［16］研究竹筍發(fā)酵后揮發(fā)性成分，發(fā)現(xiàn)類型最多的為醛、醇、酯、酸、酚、烯；酮、烯、含硫化合物較少；相對活躍的揮發(fā)性風味物質(zhì)多為醛類、醇類、酸類。萬力婷等［17］對臭（霉）莧菜梗的風味成分作了分析與鑒定，發(fā)現(xiàn)其主體風味成分為醇類、酸類和烷烴類。張書香［18］對香菇的風味成分做過詳細的分析，發(fā)現(xiàn)醛、醇、酮的貢獻最大。

2.3氣味物質(zhì)組分分類分析

2.3.1酮類

由表1可知，鹵水1號未完全發(fā)酵時不含酮類化合物，而在敞口發(fā)酵過程中產(chǎn)生酮類化合物。酮類物質(zhì)在發(fā)酵過程中總量在不斷積累，成為鹵水中的主體物質(zhì)。經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)鹵水2、3、4號并不存在共有的酮類化合物，說明在發(fā)酵的過程中不僅生成酮類物質(zhì)，還有酮類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化反應(yīng)（如6，10，14-三甲基-2-十五烷酮、苯基丙酮、2-癸酮、N-乙?；?4-哌啶酮、3-辛酮、苯乙酮、松酮、香葉基丙酮、2-十九烷酮）。對比主要原料中的相關(guān)氣味，發(fā)現(xiàn)瀏陽豆豉不含有酮類物質(zhì)［15］；竹筍和莧菜在發(fā)酵過程中都會產(chǎn)生較多的酮類物質(zhì)［16-17］；而在香菇中，酮類物質(zhì)的含量維持在較高水平［18］，可以得出竹筍、莧菜和香菇在發(fā)酵過程中對于鹵水中酮類物質(zhì)的含量起到了重要作用。

2.3.2酚類

由表1可知，鹵水的發(fā)酵過程中僅發(fā)現(xiàn)3種酚類物質(zhì)，隨著發(fā)酵時間的增加，四代鹵水中僅含2，4-二叔丁基苯酚。但在鹵水發(fā)酵的初期，2，4-二叔丁基苯酚的占有率并不明顯。對比主要原料中的相關(guān)氣味，發(fā)現(xiàn)瀏陽豆豉僅含有愈創(chuàng)木酚1種酚類物質(zhì)［15］；在竹筍發(fā)酵過程中檢測到3種酚類［16］；在香菇中檢測出1～2種酚類物質(zhì)［18］；而莧菜在發(fā)酵過程中沒有檢出酚類［17］，說明鹵水中的酚類物質(zhì)主要來自原料，而且酚類物質(zhì)難生成易被氧化，這導(dǎo)致了鹵水在發(fā)酵過程中酚類物質(zhì)不斷減少。

2.3.3烷類

由表1可知，鹵水在發(fā)酵初期，烷類物質(zhì)含量并不多，發(fā)酵兩年以上的鹵水中其含量量才有所提高。其中芹子烷、1，3-二環(huán)己基丁烷、十四烷、十五烷是各代鹵水中存在的共同物質(zhì)，5-丙基壬烷是在成品鹵水中才含有的物質(zhì)，雖然含量很少，但在成品鹵水中也占據(jù)著很大的比例。對比主要原料的相關(guān)氣味，發(fā)現(xiàn)在瀏陽豆豉中檢測出10種烷類物質(zhì)［15］，莧菜在發(fā)酵過程中產(chǎn)生12種烷類物質(zhì)［17］，竹筍在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的烷類物質(zhì)僅有2種［16］，而在香菇中烷類物質(zhì)主要以含硫化合物存在［18］。

2.3.4醇類

由表1可知，在鹵水發(fā)酵初期，醇類物質(zhì)含量很少，但一直呈現(xiàn)出明顯的增長趨勢，其中紅沒藥醇是鹵水發(fā)酵中均含有的醇類物質(zhì)，對比鹵水2、3、4號，2-乙基己醇、A-畢橙茄醇雖然在發(fā)酵開始階段并不存在，但從2號鹵水開始到成品鹵水，其含量也在逐漸增加，再加上2，3-二甲基環(huán)己醇、反-2-十二烯-1-醇、十二醇、1-十五醇、1-十六烷醇、十九醇這六種醇類物質(zhì)，最終構(gòu)成成品鹵水揮發(fā)組分中的主體物質(zhì)。對比主要原料的相關(guān)氣味，瀏陽豆豉含有5種不同的醇類物質(zhì)［15］，竹筍在發(fā)酵過程中產(chǎn)生11種醇類，莧菜在發(fā)酵過程中產(chǎn)生16種醇類［16］，而香菇中也至少含有6種不同的醇類物質(zhì)，最多達到了11種［18］。

2.3.5烯類

由表1可知，4種鹵水中并不存在共有的烯類揮發(fā)性組分，即使排除發(fā)酵不完全的原料鹵水，后三個階段的鹵水中也并未檢測到相同的烯類揮發(fā)性成分，大部分的烯類物質(zhì)都在鹵水2號的階段產(chǎn)生，同時又發(fā)生了轉(zhuǎn)化反應(yīng)，使得后期鹵水發(fā)酵中并檢測到大量的烯類物質(zhì)，而在成品鹵水中，α-柏木烯、β-柏木烯、4，5-二乙基-3，6-二甲基-3、5-辛二烯、（-）-g-杜松烯、四氫化新植二烯成為鹵水揮發(fā)性組分中的主體物質(zhì)。對比主要原料的相關(guān)氣味，在香菇中未檢出烯類物質(zhì)［18］，瀏陽豆豉中僅含有2種烯類物質(zhì)［15］，竹筍發(fā)酵后檢測出3種烯類物質(zhì)［16］，莧菜在發(fā)酵過程中檢測出3種烯類物質(zhì)［17］。鹵水在不同發(fā)酵過程中的檢測中烯類物質(zhì)的占有量并不大，這和主要原料中的烯類物質(zhì)較少含量有很大的關(guān)系。

2.3.6醛類

由表1可知，在鹵水發(fā)酵的初期，前兩個階段的鹵水中沒有檢測到醛類物質(zhì)，自鹵水3號開始，醛類物質(zhì)開始合成并慢慢積累。其中，壬醛和癸醛的相對含量慢慢增多，而十二醛、十三醛、肉豆蔻醛在成品鹵水中才出現(xiàn)，相對含量雖然少，但依然作為主體物質(zhì)存在于鹵水的揮發(fā)性組分中。對比主要原料中的相關(guān)氣味，不管是瀏陽豆豉還是香菇，其中的醛類物質(zhì)都很少，竹筍和莧菜只有在發(fā)酵過程中才會產(chǎn)生比較豐富的醛類物質(zhì)［16-17］。在原料浸泡液中并沒有檢測到醛類物質(zhì)，說明醛類物質(zhì)并非完全由原料帶入，而是隨著發(fā)酵的不斷進行醛類物質(zhì)才慢慢積累。

2.3.7酯類

由表1可知，在鹵水發(fā)酵的初期，尤其是初原料階段，其揮發(fā)性組分中酯類物質(zhì)的含量水平非?？捎^，雖然總量并不是很多，但種類豐富。而在長時間的發(fā)酵過程中，酯類物質(zhì)慢慢被轉(zhuǎn)化，原有的酯類物質(zhì)并未在后期的發(fā)酵鹵水中檢出，但在成品鹵水中，仍存在少量的酯類物質(zhì)，不同于最初的鹵水中揮發(fā)性組分。對比主要原料的相關(guān)氣味，瀏陽豆豉中含有10種不同的酯類物質(zhì)，是瀏陽豆豉中含量最高的揮發(fā)性成分［15］；竹筍發(fā)酵過程中產(chǎn)生5種不同的酯類物質(zhì)，且相對含量不高［16］；莧菜在發(fā)酵過程中僅產(chǎn)生2種不同的酯類，其所占的比例也是最少的［17］；在香菇中極少檢測出酯類物質(zhì)［18］。鹵水中酯類的所占比例說明瀏陽豆豉作為鹵水原料對酯類物質(zhì)的貢獻很大。

2.3.8酸類

由表1可知，鹵水揮發(fā)性組分中的酸類物質(zhì)僅僅存在于1代鹵水當中，酸類物質(zhì)在初期生產(chǎn)鹵水時，由于添加的原料隨著發(fā)酵不斷被分解后所產(chǎn)生的，具有不愉快氣味。而在后期的發(fā)酵過程中，酸類物質(zhì)逐漸減少，在成品鹵水中沒有檢出酸類物質(zhì)。對比主要原料的相關(guān)氣味分析發(fā)現(xiàn)，在瀏陽豆豉中雖然酸類物質(zhì)僅含有4種，但在含量上卻達到了20.19%，香菇中的含量很少［18］；竹筍在發(fā)酵過程中產(chǎn)生6種酸類物質(zhì)，但是總體含量不高［16］；莧菜在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酸類物質(zhì)有13種，所占的相對含量達到了15.9%［17］?？梢宰C明的一點是，通過鹵水的不斷發(fā)酵，酸類物質(zhì)雖然在氣味上帶給人們不愉快的氣味物質(zhì)，但最終并沒有對成品鹵水的氣味產(chǎn)生消極的影響。

2.3.9吲哚類和其他

吲哚是一種具有強烈臭味的物質(zhì)，由表1可知，3-甲基吲哚是整個發(fā)酵過程唯一都存在的物質(zhì)。3-甲基吲哚又名糞臭素，它有腐爛的、令人作嘔的臭氣、衛(wèi)生球以及大糞臭，在極稀釋的情況下，有茉莉花香，極度稀釋后有成熟的水果的香味［19］。而且在鹵水1～4號樣品中，其相對含量分別是11.69%、19.62%、0.87%、1.18%。對比主要原料的相關(guān)氣味，并沒發(fā)現(xiàn)存在吲哚類物質(zhì)［15-18］，說明吲哚是鹵水中特有的組分，對臭豆腐的臭香味起到重要作用。

由表1可知，在鹵水的發(fā)酵過程中產(chǎn)生了相當多的其他揮發(fā)性成分，各種物質(zhì)也因為不斷的發(fā)酵發(fā)生了相應(yīng)的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，并不存在在鹵水各階段都含有的同類物質(zhì)，但在最終的成品鹵水中還是存在著相當多的氣味成分，不確定這些成分是不是對鹵水的氣味有著很顯著的影響，但作為成品鹵水中的主體物質(zhì)，對成品鹵水揮發(fā)性組分的組成結(jié)構(gòu)還是有著很積極的作用。

3　結(jié)論

本試驗通過對鹵水發(fā)酵過程中個不同階段的氣味物質(zhì)組成進行全面的研究，通過對比原料中揮發(fā)性成分，發(fā)現(xiàn)原料在鹵水發(fā)酵過程中的揮發(fā)性成分組成起到了很關(guān)鍵的作用。其主體物質(zhì)酮類、醇類、醛類的總量都是呈上升趨勢的，但是在整個發(fā)酵過程中種類在不斷的變化；其他主體物質(zhì)酚類、烷類、烯類、酯類雖然在發(fā)酵過程中時高時低，但是一直到發(fā)酵末期都會存在，目前沒有檢測出相同種類的化合物；酸類物質(zhì)只在發(fā)酵初期檢測出來，而在后期的發(fā)酵過程中基本消失，之所以產(chǎn)生酸類物質(zhì)是因為在發(fā)酵前期原料被微生物分解所產(chǎn)生的一種具有不愉快氣味的物質(zhì)，后期階段的消失說明鹵水發(fā)酵過程對于具有不良氣味的成分物質(zhì)有一定的分解抑制作用；從目前研究結(jié)果來看，3-甲基吲哚是唯一貫穿整個發(fā)酵過程的物質(zhì)，在整個發(fā)酵過程中，是臭豆腐鹵水發(fā)酵的核心物質(zhì)之一，是臭豆腐臭香味生成的主要因素，這種風味物質(zhì)的形成可能與微生物有關(guān)［20］。

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［19］章思歸.精細有機化學品技術(shù)手冊［M］.北京：科學出版社，1992：1297.

［20］徐睿烜.長沙臭豆腐制作過程中主要指標的分析［D］.長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學，2015.

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學 食品科技學院，湖南 長沙 410128；2.食品科學與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128；3.獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國家地方聯(lián)合工程研究中心，湖南 長沙 410128）

采用固相微萃取法（SPME）對不同發(fā)酵工藝階段的臭豆腐鹵水中的揮發(fā)性成分進行提取，提取物經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）分析，探索了臭豆腐鹵水整個發(fā)酵過程中揮發(fā)性物質(zhì)的變化趨勢。共鑒定出122種成分，其中，醇類18種，酸類9種，酯類24種，酮類20種，醛類6種，酚類3種，烷類30種，烯類9種，吲哚3種，其他化合物30種。結(jié)果表明，核心氣味物質(zhì)3-甲基吲哚貫穿整個發(fā)酵過程，是臭豆腐臭香味生成的主要因素。

臭豆腐；揮發(fā)性成分；萃??；分析

Changes trend of volatile components in stinky tofu brine during the fermentation

HE Jing1，2，XIE Jing1，2，LIU Junge3，CHENG Miaofen3，JIANG Liwen1，2*，XU Ruixuan1，2
（1.College of Food Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China；2.Hunan Provincial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology，Changsha 410128，China；3.National and Provincial Union Engineering Research Centre for the Veterinary Herbal Medicine Resources and Initiative，Changsha 410128，China）

The volatile components in stinky tofu brine at different fermentation stages were extracted by SPME and analyzed by GC-MS.The changes trend of volatile components in stinky tofu brine during the whole fermentation was studied.122 compounds were identified，including 18 alcohols，9 organic acids，24 esters，20 ketones，6 aldehydes，3 phenols，30 alkanes，9 alkenes，3 indole，and 30 other compounds.The results showed that 3-methylindole was detected during the whole fermentation and it was the main factor for generating stinky tofu smell fragrance.

stinky tofu；volatile components；extraction；analysis

TS214.2

0254-5071（2016）07-0079-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.017

2016-02-16

國家自然科學基金項目（31571819）

賀靜（1990-），女，碩士研究生，研究方向為食品加工與安全。

蔣立文（1968-），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。