啤酒酵母乙醛代謝關(guān)鍵酶相關(guān)性研究

崔云前，王君偉，李　紅，金瑋鋆（.齊魯工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，中德啤酒技術(shù)中心，山東 濟(jì)南 50353；.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 0005）

啤酒酵母乙醛代謝關(guān)鍵酶相關(guān)性研究

崔云前1，王君偉1，李紅2*，金瑋鋆2
（1.齊魯工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，中德啤酒技術(shù)中心，山東 濟(jì)南 250353；2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100015）

乙醛是啤酒中的主要風(fēng)味物質(zhì)，其代謝主要來自酵母細(xì)胞。酵母中乙醇脫氫酶及乙醛脫氫酶是乙醛代謝的關(guān)鍵酶，對(duì)乙醛變化起著重要作用。跟蹤啤酒酵母發(fā)酵過程中相對(duì)酶活力及乙醛變化，發(fā)現(xiàn)兩種乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的相對(duì)酶活力與發(fā)酵過程乙醛含量變化具有一定相關(guān)性。同時(shí)對(duì)低產(chǎn)乙醛啤酒釀酒酵母kb2-4與出發(fā)菌株啤酒酵母kb進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，跟蹤檢測(cè)相對(duì)酶活力及乙醛含量，其乙醇脫氫酶Ⅰ和乙醇脫氫酶Ⅱ及乙醛脫氫酶相對(duì)酶活力均高于出發(fā)菌株，平均增幅分別為15.5%，11.6%和5%。3種酶活性的變化協(xié)同作用可以使乙醛含量降幅最大為33.8%。

乙醛；酵母；乙醇脫氫酶；乙醛脫氫酶；相對(duì)酶活

乙醛是啤酒中的主要風(fēng)味物質(zhì)，其代謝主要來自酵母細(xì)胞。酵母中乙醇脫氫酶及乙醛脫氫酶是乙醛代謝相關(guān)的主要酶。其酶活性在整個(gè)發(fā)酵過程中的變化導(dǎo)致了乙醛含量的變化。釀酒酵母利用糖酵解產(chǎn)生乙醇的代謝過程中，主要是葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑（embden-meyerhofparnas，EMP）轉(zhuǎn)化為丙酮酸，由丙酮酸脫羧酶催化還原生成乙醛，再經(jīng)乙醇脫氫酶還原生成乙醇，同時(shí)伴隨著乙醇向乙醛的逆轉(zhuǎn)化，另外，乙醛經(jīng)乙醛脫氫酶轉(zhuǎn)化為乙酸。在酵母內(nèi)整個(gè)乙醛代謝過程主要有丙酮酸脫氫酶、乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的共同參與。其中乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶對(duì)乙醛的出路起著至關(guān)重要的作用。釀酒酵母中有5種基因編碼與乙醇代謝相關(guān)聯(lián)的乙醇脫氫酶，分別是adh1、adh2、adh3、adh4和adh5［1-3］，其中的4種乙醇脫氫酶作用是將乙醛還原成乙醇，其中乙醇脫氫酶Ⅰ起著主要作用，一種乙醇脫氫酶（乙醇脫氫酶Ⅱ）是將乙醇氧化成乙醛［4］。乙醛脫氫酶是丙酮酸脫氫酶（pyruvate dehydrogenase，PDH）旁路作用的第二種酶，負(fù)責(zé)氧化乙醛生產(chǎn)乙酸［5］。國內(nèi)外已有眾多關(guān)于酵母內(nèi)乙醛脫氫酶及乙醇脫氫酶的研究，但多局限于酶的機(jī)理性質(zhì)方面的研究［6］。酶與乙醛等代謝產(chǎn)物的研究多集中在引入基因工程技術(shù)定向改變啤酒酵母遺傳及生理性狀［7-8］。而未對(duì)酵母內(nèi)酶活性與代謝產(chǎn)物變化相關(guān)性進(jìn)行深入探討。

在乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶作用下，乙醛向乙醇和乙酸以及乙醇向乙醛的轉(zhuǎn)化過程中涉及輔酶Ⅰ（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）和還原型輔酶Ⅰ（nicotinam ide adenine dinucleotide hydrogen，NADH）的相互轉(zhuǎn)化。通過酶系反應(yīng)中輔酶的變化可用來表示乙醇脫氫酶及乙醛脫氫酶的酶活性大小。本研究集中于乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的酶活性與乙醛的相關(guān)性探究。并對(duì)經(jīng)高濃度乙醛篩選的抗乙醛釀酒酵母菌株與原始菌株的酶活性及乙醛含量變化進(jìn)行對(duì)比研究。發(fā)現(xiàn)啤酒發(fā)酵過程中，酵母內(nèi)乙醇脫氫酶及乙醛脫氫酶與乙醛含量的變化規(guī)律，找出篩選釀酒酵母相比原始酵母主要酶活性的變化及對(duì)乙醛含量的影響。為后續(xù)從酵母細(xì)胞內(nèi)部相關(guān)酶活性及代謝機(jī)理方面找到有效降低啤酒乙醛等風(fēng)味物質(zhì)的研究打下基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1料與試劑

啤酒酵母kb：中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院提供；低產(chǎn)乙醛啤酒釀酒酵母kb2-4：中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院篩選。

40%乙醛（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂（生化試劑）：北京奧博拓達(dá)科技有限公司；磷酸氫二鉀（分析純）：磷酸二氫鉀（分析純）：北京紅星化工廠；乙二胺四乙酸（ethylene diam ine tetraacetic acid，EDTA）、氫氧化鉀（分析純）、無水乙醇（分析純）：北京化工廠；輔酶Ⅰ（NAD+）（純度98%）、還原型輔酶Ⅰ（NADH）（純度98%）：百靈威科技有限公司；甘氨酸（生化試劑）：北京索萊寶科技有限公司；氯化鉀（分析純）：西隴化工股份有限公司。

1.2器與設(shè)備

LRH-250生化培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；SY-1000E：多用途恒溫超聲提取機(jī)：北京弘祥隆生物技術(shù)公司；LR10-2.4A高速冷凍離心機(jī)：北京雷勃爾醫(yī)療器械有限公司；UV-1780紫外分光光度計(jì)：日本Shimadzu公司；PerkinElmer Auto-System XL高效氣相色譜儀：美國珀金埃爾默公司；LDZX-50KBS高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；100L啤酒釀造設(shè)備：中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院。

1.3驗(yàn)方法

1.3.1酒酵母發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

三角瓶發(fā)酵：用帶發(fā)酵栓三角瓶模擬啤酒發(fā)酵，主發(fā)酵溫度12℃。

選用12°P麥汁：斜面菌株一環(huán)→5mL麥汁（20mL試管）（28℃、24h）→45mL麥汁（100mL三角瓶）（28℃、24h）→500mL麥汁（1 000m L錐形瓶），搖勻后加上發(fā)酵栓，去離子水密封，12℃發(fā)酵。

100 L發(fā)酵罐發(fā)酵：三級(jí)擴(kuò)培酵母菌種液10 L（接種量為5%），罐裝13°P麥汁60 L，采用12℃進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，封罐后降到2℃［9］。每天跟蹤測(cè)定相關(guān)數(shù)據(jù)（每天取樣時(shí)間點(diǎn)相同）。

1.3.2母細(xì)胞的獲?。?0-11］

取30m L發(fā)酵液于離心管中（離心管需事先稱質(zhì)量并編號(hào)），以5 000×g離心5 m in，棄去上清液收集酵母細(xì)胞。用5m L 2mmol/L EDTA和超純水分別清洗兩次，每次以5 000×g離心10min。稱量含有底層酵母泥的離心管質(zhì)量，以計(jì)算得到酵母泥質(zhì)量，將收集得到的酵母泥懸浮于100mmol/L的磷酸鉀緩沖溶液（pH 7.5），得酵母細(xì)胞菌懸液。

1.3.3酶液的制備［12-14］

采用凍融-超聲結(jié)合法對(duì)酵母懸液進(jìn)行破壁處理，將菌懸液冷凍于-18℃冰箱，按12 h-3 h-3 h的時(shí)間進(jìn)行3次冷凍。每次將冷凍的菌懸液4℃冰箱解凍10m in。最后一次4℃冰箱解凍后，解凍液置于超聲提取機(jī)，溫度0℃、功率350W、工作時(shí)間2 s、間歇時(shí)間5 s條件下進(jìn)行超聲10min。將超聲后的菌懸液在10℃條件下10 000×g離心10min，吸取上清液作為細(xì)胞抽提物即粗酶液。

1.3.4活測(cè)定方法［15-16］

（1）乙醛脫氫酶酶活測(cè)定

配制3m L酶活反應(yīng)體系（0.15mol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7.5），0.001mol/LNAD+，1×10-4mol/L乙醛），其中以乙醛為反應(yīng)底物。

同等溫度條件下加細(xì)胞浸出液0.1m L，對(duì)照樣為0.1m L超純水。采用單池時(shí)間掃描，連續(xù)5min內(nèi)，讀取波長340 nm處吸光度值。

（2）乙醇脫氫酶酶活測(cè)定

①乙醇脫氫酶Ⅰ

配制3m L酶活反應(yīng)體系（0.05mol/L甘氨酸-氫氧化鉀緩沖溶液（pH 9.0），0.001mol/LNAD+，1×10-4mol/L乙醛）其中以乙醛為反應(yīng)底物。

同等溫度條件下加細(xì)胞浸出液0.5m L，對(duì)照樣為0.1m L超純水。采用單池時(shí)間掃描，連續(xù)5min內(nèi)，讀取波長340 nm處吸光度值。

②乙醇脫氫酶Ⅱ

配制3m L酶活反應(yīng)體系（0.05mol/L甘氨酸-氫氧化鉀緩沖溶液（pH 9.0）緩沖液，0.001mol/L NADH，0.1mol/L乙醇）其中以乙醇為反應(yīng)底物。

同等溫度條件下加細(xì)胞浸出液0.5m L，對(duì)照樣為0.1m L超純水。采用單池時(shí)間掃描，連續(xù)5min內(nèi)，讀取波長340 nm處吸光度值。

酶活定義：常溫條件下，3m L酶活性測(cè)定反應(yīng)體系，5m in內(nèi)NADH的增加或減少量表示酶的活性大小，即每分鐘波長340 nm下吸光度值增加0.001為一個(gè)活力單位，U。本研究酶活性以測(cè)得酶活性值除以酶液對(duì)應(yīng)酵母泥質(zhì)量表示（U/mg）。

1.3.5醛含量測(cè)定［17］

乙醛含量采用頂空氣相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。DB-WAX毛細(xì)管柱（0.25mm×0.25μm×30m），選取內(nèi)標(biāo)：3-庚酮。具體測(cè)定條件如下：

頂空進(jìn)樣器平衡溫度70℃，平衡時(shí)間30m in，傳輸線溫度130℃，進(jìn)樣時(shí)間0.04min，進(jìn)樣口溫度200℃，檢測(cè)器溫度250℃，色譜柱初始溫度40℃，經(jīng)程序升溫10℃/min升至180℃，柱流速1.2m L/min，載氣（N2）流速30m L/min，燃?xì)猓℉2）流速：47m L/m in，助燃?xì)猓諝猓┝魉?00m L/min。

2　結(jié)果與分析

2.1醛含量與三種酶酶活在三角瓶發(fā)酵過程中的變化規(guī)律

2.1.1角瓶發(fā)酵過程中乙醛含量及三種酶活性的變化

三角瓶發(fā)酵條件下，每隔1 d測(cè)定發(fā)酵液中乙醛含量、乙醛脫氫酶和乙醇脫氫酶Ⅰ、Ⅱ酶活，結(jié)果見圖1。

圖1　三角瓶發(fā)酵3種酶相對(duì)酶活與乙醛含量實(shí)時(shí)跟蹤圖Fig．1 Real-time tracking graph of relative enzyme activity of three kinds of enzym es and acetaldehyde content in triangular flask fermentation

由圖1可知，發(fā)酵1～3 d，乙醛含量快速增加，乙醛脫氫酶及乙醇脫氫酶Ⅱ的酶活有所增加，乙醇脫氫酶Ⅰ的酶活有所下降。第3天以后，乙醛含量開始下降，同時(shí)乙醛脫氫酶和乙醇脫氫酶Ⅱ酶活也隨之下降，而乙醇脫氫酶Ⅰ酶活則呈相反趨勢(shì)。

2.1.2角瓶發(fā)酵過程酶活與乙醛含量相關(guān)性分析

三角瓶發(fā)酵條件下，對(duì)3組平行試驗(yàn)酶活與乙醛含量數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS相關(guān)性分析，結(jié)果見表1。

表1　相對(duì)酶活力與乙醛含量相關(guān)性Table 1 Co rrelation between relative enzym e activity and acetaldehyde content

由表1可知，乙醛脫氫酶和乙醇脫氫酶Ⅱ酶活變化與乙醛含量在0.01水平上有正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.845和0.690。而乙醇脫氫酶Ⅰ與乙醛含量在0.01水平上呈負(fù)相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為-0.630。這與圖3乙醛含量與酶活變化趨勢(shì)相吻合，而相關(guān)系數(shù)大小偏低，說明單獨(dú)某種酶無法決定乙醛含量的變化而是3種酶共同作用的結(jié)果。

2.2醛含量與3種酶酶活在100 L發(fā)酵罐過程中的變化規(guī)律

2.2.1100 L發(fā)酵罐發(fā)酵過程中乙醛含量及三種酶活性的變化

100 L發(fā)酵罐條件下，篩選低產(chǎn)乙醛啤酒釀酒酵母kb2-4與原始啤酒酵母kb，在相同條件啤酒發(fā)酵試驗(yàn)，跟蹤測(cè)定酵母體內(nèi)3種酶的活性，結(jié)果見圖2。

圖2　兩種酵母100 L發(fā)酵乙醇脫氫酶Ⅰ（A）、Ⅱ（B）及乙醛脫氫酶（C）酶活實(shí)時(shí)跟蹤圖Fig．2 Real-tim e tracking graph of relative enzyme activity of a lcohol dehydrogenase I（A），alcoholdehydrogenase II（B）and aldehyde dehydrogenase（C）in 100 L fermentation for two yeast strains

由圖2可知，經(jīng)篩選的低產(chǎn)乙醛啤酒釀酒酵母kb2-4在整個(gè)主發(fā)酵時(shí)期（第二天除外），其酶活性（乙醇脫氫酶Ⅰ、Ⅱ，乙醛脫氫酶）均高于原始菌株。

同時(shí)計(jì)算篩選低產(chǎn)乙醛啤酒釀酒酵母kb2-4與原始啤酒酵母kb所測(cè)酶活的每天的增幅值，結(jié)果見表2。

由表2可知，篩選菌株的3種酶（乙醇脫氫酶Ⅰ、Ⅱ，乙醛脫氫酶）的酶活對(duì)原始菌株的最大增幅分別為30%、19.7%和14%，而平均增幅分別為15.5%、11.6%和5%。在發(fā)酵第2天兩種酵母酶活性相同，可能是主發(fā)酵的第2天酵母增殖量較大，其酶活變化不明顯。兩種酵母的乙醛脫氫酶在整個(gè)發(fā)酵過程中變化不明顯，且在第1天出現(xiàn)負(fù)的增幅，可能是篩選的酵母菌株相對(duì)原始菌株在乙醛脫氫酶的酶活性上沒有發(fā)生較大改變，而主要是乙醇脫氫酶Ⅰ、Ⅱ的酶活性發(fā)生了變化。

表2　篩選菌株相比原始菌株相對(duì)酶活增幅Table 2 Increase am plitude of the relative enzyme activity of screened strains compa red with the original strain

2.2.2100 L發(fā)酵罐發(fā)酵中乙醛含量變化比較

100 L發(fā)酵罐條件下，篩選低產(chǎn)乙醛啤酒釀酒酵母kb2-4與原始啤酒酵母kb，在相同條件下啤酒發(fā)酵試驗(yàn)，跟蹤檢測(cè)乙醛含量，結(jié)果見圖3。

圖3　兩種酵母100 L發(fā)酵乙醛含量實(shí)時(shí)跟蹤圖Fig.3 Real-tim e tracking graph of acetaldehyde content in 100 L ferm entation of two yeast strains

由圖3可知，整個(gè)發(fā)酵過程中篩選酵母菌株與原始酵母菌株乙醛含量變化趨勢(shì)大致相同而篩選菌株每天的乙醛含量卻更低。

計(jì)算篩選低產(chǎn)乙醛啤酒釀酒酵母kb2-4相對(duì)原始啤酒酵母kb乙醛含量的降幅值，結(jié)果見表3。

表3　篩選菌株相比原始菌株乙醛含量降幅Table 3 Decrease am plitude o f acetaldehyde content of screened stra ins com pared w ith the o riginal strain

由表3可知，第10天其相對(duì)降幅最大為33.8%。第2天降幅最小為4.5%，主要因?yàn)樵诘?天3種酶的酶活變化率都接近為零，使得第2天的乙醛含量差值也較小。結(jié)果表明，3種酶活性的變化協(xié)同作用可以使乙醛含量降幅最大為33.8%。

經(jīng)篩選低產(chǎn)乙醛啤酒釀酒酵母kb2-4與原始啤酒酵母kb經(jīng)100L啤酒發(fā)酵，兩種乙醇脫氫酶的酶活性均高于原始菌株，而乙醛脫氫酶酶活性變化不明顯且篩選低產(chǎn)乙醛啤酒釀酒酵母kb2-4乙醇脫氫酶Ⅰ相對(duì)原始啤酒酵母kb的平均酶活增幅（10%）低于乙醇脫氫酶Ⅱ活性增幅量（16%）。而最后發(fā)酵液的乙醛含量低于原始菌株發(fā)酵液含量?？赏茰y(cè)乙醇脫氫酶Ⅰ在乙醛的代謝中起著主導(dǎo)作用。

3　結(jié)論

啤酒發(fā)酵過程中乙醛含量主要受酵母細(xì)胞內(nèi)乙醇脫氫酶及乙醛脫氫酶的變化作用。其相對(duì)酶活性的增加或降低其乙醛含量也隨發(fā)生變化。

經(jīng)高濃乙醛篩選的抗乙醛釀酒酵母經(jīng)10發(fā)酵跟蹤測(cè)定酶活性，其乙醇脫氫酶Ⅰ，乙醇脫氫酶Ⅱ和乙醛脫氫酶酶活相比原始菌株均有一定增幅，平均增幅分別為15.5%，11.6%和5%。乙醇脫氫酶Ⅱ酶活的增幅（即催化乙醇向乙醛方向增幅）小于乙醇脫氫酶Ⅰ和乙醛脫氫酶的增幅（即乙醛向乙醇和乙酸轉(zhuǎn)化方向的增幅），且乙醇脫氫酶Ⅰ的增幅更大，而乙醛脫氫酶變化較小且有起伏。3種酶活性的變化協(xié)同作用可以使乙醛含量降低幅最大為33.8%，驗(yàn)證了乙醛含量變化是酵母細(xì)胞內(nèi)乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶共同作用的結(jié)果。且篩選低產(chǎn)乙醛啤酒釀酒酵母kb2-4相對(duì)原始原始啤酒酵母kb主要是與乙醛代謝相關(guān)的乙醇脫氫酶酶活性發(fā)生了較大改變。

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Correlation of key enzymes of acetaldehyde metabolism in beer yeast

CUIYunqian1，WANG Junwei1，LIHong2*，JINWeiyun2
（1.College ofBiological Engineering，Qilu University ofTechnology，China-Germany BeerBrew ing TechnicalCenter，Jinan 250353，China；2.China NationalResearch Institute ofFood and Fermentation Industry，Beijing 100015，China）

Acetaldehyde is themain flavorsubstance in beer，and itsmetabolism mainly occurs in yeast cells.A lcoholdehydrogenase（ADH）and aldehydedehydrogenase（ALDH）in yeastare the key enzymes in theacetaldehydemetabolism，which playsan important role in the changesofacetaldehyde.By tracking the relative enzyme activity and acetaldehyde changes during beer yeast fermentation process，the results showed the relative enzyme activity of two kindsof ADH and ALDH had certain relevancew ith the changesof acetaldehyde content during fermentation process.At the same time，in the fermentation testof low yield acetaldehydebeer brew ing yeastkb2-4 and original strain beer brewing yeastkb，the relative enzyme activity and the acetaldehyde contentweredeterm ined.The relative enzymeactivity of ADH I，ADH IIand ALDH werehigher than thatof the original strain，and theaverage grow th rateswere5%，11.6%and 15.5%，respectively.Thesynergistic effectof the threekindsof enzyme activity changes couldmake theacetaldehyde contentdecreasing amplitude to themaximum of 33.8%.

acetaldehyde；yeast；alcoholdehydrogenase；aldehydedehydrogenase；relative enzyme activity

TS261．4

0254-5071（2016）01-0029-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．007

2015-11-19

國家國際科技合作專項(xiàng)項(xiàng)目（2014DFG31770）

崔云前（1969-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)楝F(xiàn)代啤酒釀造技術(shù)。

李紅（1978-），男，高級(jí)工程師，博士后，研究方向?yàn)楝F(xiàn)代啤酒釀造技術(shù)。