HPLC法測(cè)定比沙可啶腸溶片含量的測(cè)量不確定度評(píng)定

孫　婷，姜建國(guó)，張　菁，耿　韞（河北省藥品檢驗(yàn)研究院，石家莊　050011）

HPLC法測(cè)定比沙可啶腸溶片含量的測(cè)量不確定度評(píng)定

孫婷＊，姜建國(guó)，張菁，耿韞（河北省藥品檢驗(yàn)研究院，石家莊050011）

目的：建立測(cè)定比沙可啶腸溶片含量的測(cè)量不確定度的評(píng)定方法。方法：采用高效液相色譜（HPLC）外標(biāo)法測(cè)定比沙可啶腸溶片的含量，并建立評(píng)定其不確定度的數(shù)學(xué)模型，對(duì)來自于溶液配制過程和儀器測(cè)定過程的各種不確定度影響因素進(jìn)行系統(tǒng)分析并予以評(píng)估。結(jié)果：HPLC外標(biāo)法測(cè)定比沙可啶腸溶片的含量為97.8%，置信概率為95%時(shí)，其擴(kuò)展測(cè)量不確定度為2.8%，測(cè)量結(jié)果表示為（97.8±2.8）%，k=2。結(jié)論：建立的方法適用于HPLC外標(biāo)法測(cè)定比沙可啶腸溶片含量的測(cè)量不確定度評(píng)定。HPLC儀器的定期校準(zhǔn)檢定和稱量過程的嚴(yán)格控制有利于提高HPLC法測(cè)定的準(zhǔn)確度。

高效液相色譜法；比沙可啶腸溶片；含量測(cè)定；測(cè)量不確定度評(píng)定

比沙可啶腸溶片為2015年版《中國(guó)藥典》（二部）收載的品種，是國(guó)外20世紀(jì)50年代末上市的優(yōu)良緩瀉藥，臨床上主要通過與腸黏膜直接接觸刺激其感覺神經(jīng)末梢而增強(qiáng)腸反射性蠕動(dòng)，導(dǎo)致排便［1］。筆者在前期研究中對(duì)比沙可啶腸溶片的含量進(jìn)行了測(cè)定。本研究中，筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)［2-8］，依次按照建立數(shù)學(xué)模型、分析不確定度來源以及計(jì)算不確定度分量、合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展不確定度的過程，對(duì)高效液相色譜（HPLC）外標(biāo)法測(cè)定比沙可啶腸溶片含量的測(cè)量不確定度進(jìn)行了評(píng)定，旨在為提高比沙可啶腸溶片的質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制水平提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料

1.1儀器

1260型HPLC儀，包括1260泵、UV檢測(cè)器和EZChrom色譜工作站（美國(guó)安捷倫公司）；XS105型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；50 ml量瓶級(jí)別為A級(jí)。

1.2藥品與試劑

比沙可啶對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100181-200402，純度：100.0%）；比沙可啶腸溶片（A公司，批號(hào)：30901，規(guī)格：5 mg）；乙腈（色譜純，美國(guó)Fisher Chemical公司）；乙酸銨（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；冰乙酸（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；水為超純水。

2　方法與結(jié)果

色譜柱：Agilent ZORBAX C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-20 mmol/L乙酸銨（冰乙酸調(diào)pH至5.0）（55∶45，V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μl。在上述色譜條件下，比沙可啶峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度符合要求。

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液取比沙可啶對(duì)照品適量，精密稱定，加冰乙酸-乙腈-水（4∶30∶66，V/V/V）溶解并制成每1 ml中約含0.2 mg比沙可啶的對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液取樣品20片，除去包衣后，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量（約相當(dāng)于比沙可啶10 mg），置于50 ml量瓶中，加冰乙酸-乙腈-水（4∶30∶66，V/V/V）溶解并定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.3空白輔料溶液精密稱取生產(chǎn)企業(yè)處方中包含的所有輔料適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行操作，制成空白輔料溶液。

2.3方法學(xué)驗(yàn)證

本部分內(nèi)容參見文獻(xiàn)［9］。

2.4樣品含量測(cè)定

靶區(qū)和正常組織勾畫：依據(jù)RTOG Breast Cancer Contouring Atlas[1]標(biāo)準(zhǔn)，在Pinnacle 9.8計(jì)劃系統(tǒng)中，勾畫臨床靶區(qū)CTV，勾畫正常組織：同側(cè)肺、對(duì)側(cè)肺、心臟、對(duì)側(cè)乳腺、甲狀腺等。計(jì)劃靶區(qū)PTV由臨床靶區(qū)CTV均勻外放0.5 cm得到。

分別精密量取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液和供試品溶液各20 μl，注入HPLC儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果，比沙可啶腸溶片的含量測(cè)量結(jié)果為97.8%

3　測(cè)量不確定度評(píng)定

3.1建立數(shù)學(xué)模型

以比沙可啶腸溶片含量計(jì)算公式作為測(cè)量不確定度評(píng)定的數(shù)學(xué)模型。根據(jù)測(cè)定的原理和過程，比沙可啶腸溶片含量計(jì)算公式為：

式中，Y：供試品中比沙可啶的標(biāo)示百分含量；AX：供試品的峰面積；AR：對(duì)照品的峰面積；WX：供試品的稱樣量；WR：對(duì)照品的稱樣量；VX：供試品溶液的稀釋體積；VR：對(duì)照品溶液的稀釋體積；PR：對(duì)照品的純度；W：供試品平均片質(zhì)量；標(biāo)示量：5 mg/片。由上式可知，比沙可啶腸溶片含量測(cè)定的不確定度來源于對(duì)照品的純度、對(duì)照品的稱樣量、對(duì)照品溶液的稀釋體積、對(duì)照品的峰面積、供試品的峰面積、供試品的稱樣量、供試品溶液的稀釋體積、供試品平均片質(zhì)量。

3.2識(shí)別測(cè)量不確定度的來源

有關(guān)測(cè)量不確定度的來源見圖1。

圖1　測(cè)量不確定度分量因果圖Fig 1　Cause-effect diagram of uncertainty components

3.3測(cè)量不確定度分量的量化分析

3.3.1PR的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（PR）屬B類測(cè)量不確定度。PR的不確定度包括由定值的測(cè)量方法引入的不確定度、協(xié)作標(biāo)定試驗(yàn)的不確定度、由非均勻性和不穩(wěn)定性引入的不確定度等［10］。比沙可啶對(duì)照品由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，純度為100.0%，其分散區(qū)間的半峰寬α=0.05%，P= 100%），按矩形分布（均勻分布）計(jì)算2.88×10-4。

3.3.2WR相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ure（lWR）其不確定度來源有2個(gè)：天平示值和天平稱量的重復(fù)性。（1）天平示值的不確定度分析：屬B類不確定度。根據(jù)所用電子天平的計(jì)量檢定證書所述，該天平最大允許誤差為±0.1 mg，按矩形分布計(jì)算，k=，經(jīng)計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)不確定度mg。（2）天平稱量重復(fù)性的不確定度分析：屬B類不確定度。根據(jù)所用電子天平的計(jì)量檢定證書所述，該天平的稱量重復(fù)性誤差為0.02 mg，按矩形分布計(jì)算，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（WR2）=則天平單次稱量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為因稱量過程使用減重法，故其不確定度10-2mg。對(duì)照品稱取2份，稱樣量分別為10.22 mg和10.25 mg，則

3.3.4AR的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ure（lAR）其不確定度來源為進(jìn)樣重復(fù)性。屬A類不確定度。樣品溶液測(cè)定過程中受進(jìn)樣體積重復(fù)性、泵流速穩(wěn)定性、分離重復(fù)性、組分在色譜柱等滯留變化、檢測(cè)器穩(wěn)定性、積分變動(dòng)性等隨機(jī)變化的影響。以上在進(jìn)樣、分離、檢測(cè)過程中產(chǎn)生的隨機(jī)影響，可合并為進(jìn)樣重復(fù)性進(jìn)行測(cè)量［10］。對(duì)照品兩個(gè)平行樣，分別連續(xù)進(jìn)樣5次和2次。對(duì)照品峰面積測(cè)定結(jié)果見表1。

表1　對(duì)照品峰面積測(cè)定結(jié)果Tab 1　Determination result of the peak area for the standard

3.3.6VX的不確定度urel（VX）供試品稀釋過程與對(duì)照品相同，此不確定度分量的分析同“3.3.3”項(xiàng)。則urel（VX）=7.50× 10-4。

3.3.7AX的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（AX）此不確定度分量的分析同“3.3.4”項(xiàng)。供試品2個(gè)平行樣，每個(gè)樣進(jìn)2針，所用HPLC儀檢定證書給出的定量測(cè)量重復(fù)性RSD=0.4%（n=6）。供試品峰面積測(cè)定結(jié)果見表2。

表2　供試品峰面積測(cè)定結(jié)果Tab 2　Determination result of the peak area for the test sample

因檢測(cè)次數(shù)較少，采用極差法計(jì)算AX引入的不確定度。當(dāng)n=2時(shí)，極差系數(shù)C=1.13。計(jì)算得到

3.4計(jì)算不確定度各分量的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc，rel

不確定度各分量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表3。

經(jīng)計(jì)算，含量測(cè)定的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc，rel=（［urel（PR））2+（ure（lWR））2+（ure（lVR））12+（ure（lAR））2+（ure（lWX））2+（urel（VX））2+（ure（lAX））2+（ure（lW））2］2=［（2.88×10-4）2+（1.14×10-2）2+ （7.50×10-4）2+（5.36×110-7）2+（5.41×10-3）2+（7.50×10-4）2+（8.48× 10-7）2+（2.11×10-3）2］2=1.44×10-2。因測(cè)得比沙可啶腸溶片含量=97.8%，則合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（cX）=97.8%×1.44×10-2= 1.41%。

3.5給出擴(kuò)展不確定度U

測(cè)量結(jié)果符合正態(tài)分布，取置信概率為95%，包含因子k=2，則U=2×1.41%=2.8%。

表3　不確定度各分量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Tab 3　Relative standard uncertainty of the each component

3.6測(cè)量不確定度報(bào)告

HPLC外標(biāo)法測(cè)定比沙可啶腸溶片含量的測(cè)量結(jié)果表示為：X=（97.8±2.8）%，k=2。

4　討論

研究結(jié)果顯示，采用HPLC外標(biāo)法測(cè)定比沙可啶腸溶片含量的不確定度主要來自于對(duì)照品稱量的相對(duì)不確定度，且HPLC儀器的定期校準(zhǔn)檢定和稱量過程的嚴(yán)格控制有利于提高HPLC法測(cè)定的準(zhǔn)確度。筆者所采用的色譜條件屬于測(cè)定比沙可啶腸溶片含量的新方法，在進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證的基礎(chǔ)上，建立其測(cè)量不確定度評(píng)定方法十分重要，可為同品種不同劑型不確定度模型建立及評(píng)定提供可靠的參考依據(jù)。

［1］李穎，劉世寬，郝志剛.結(jié)腸定位給藥制劑-比沙可啶速釋片的研制［J］.山東醫(yī)藥工業(yè)雜志，2000，19（3）：7.

［2］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：二部［S］.2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：74.

［3］國(guó)家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.測(cè)量不確定度評(píng)定與表示JJF1059-1999［S］.北京：中國(guó)計(jì)量出版社，1999：1 569-1 587.

［4］中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì).化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南CNAS-GL06［S］.北京：中國(guó)計(jì)量出版社，2006：6-38.

［5］國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.常用玻璃量器檢定規(guī)程JJG196-2006［S］.北京：中國(guó)計(jì)量出版社，2006：6-8.

［6］倪育才.實(shí)用測(cè)量不確定度評(píng)定［M］.北京：中國(guó)計(jì)量出版社，2004：27-34.

［7］陸明，范國(guó)榮，汪楊，等.測(cè)量不確定度在藥品領(lǐng)域的應(yīng)用［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013，32（8）：1 053.

［8］秦立，王瑩，張利，等.HPLC測(cè)定氯氮平片含量的測(cè)量不確定度評(píng)定［J］.中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2015，32（2）：189.

［9］張西如，孫婷，姜建國(guó)，等.HPLC法測(cè)定比沙可啶腸溶片的含量及含量均勻度［J］.中國(guó)藥房，2016，27（18）：2 573.

［10］孫婷，韓學(xué)靜，姜建國(guó)，等.HPLC測(cè)定注射用長(zhǎng)春西汀含量的不確定度評(píng)定［J］.華西藥學(xué)雜志，2013，28（4）：401.

［11］EURACHEM/CITAC Guide.量化分析測(cè)量不確定度指南［M］.劉立，譯.北京：中國(guó)計(jì)量出版社，2003：129.

［12］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：四部［S］.2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：通則0101 3-4.

（編輯：周箐）

Evaluation of Measurement Uncertainty for the Content of Bisacodyl Enteric-coated Tablet by HPLC

SUN Ting，JIANG Jianguo，ZHANG Jing，GENG Yun（Hebei Institute for Drug Control，Shijiazhuang 050011，China）

OBJECTIVE：To a evaluation method for the measurement uncertainty for the content of Bisacodyl enteric-coated tablet.METHODS：HPLC external standard method was conducted for content determination of Bisacodyl enteric-coated tablet，and mathematical model for uncertainty evaluation was established to systematically analyze and evaluate the influential factors in processes of solution preparation and instrument measurement.RESULTS：HPLC external standard method showed the content was 97.8%，confidence probability was 95%，expanded uncertainty was 2.8%，and determination result was（97.8±2.8）%，k=2/CONCLUSIONS：The established method is suitable for the evaluation of measurement uncertainty for the content of Bisacodyl enteric-coated tablet.Regularly calibrated verification for HPLC equipment and strict control of the weighing process will help to improve the accuracy measured by HPLC.

HPLC；Bisacodyl enteric-coated tablet；Content determination；Evaluation of measurement uncertainty

R927文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

1001-0408（2016）24-3428-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.24.36

＊主管藥師。研究方向：藥物檢驗(yàn)和雜質(zhì)鑒定。E-mail：122547652@qq.com

2015-12-10

2016-07-18）