HPLC法測(cè)定野薔薇中齊墩果酸和熊果酸的含量

古力齊曼·阿布力孜，阿吾提·艾買爾，毛居代·亞爾買買提，迪麗努爾·馬里克，*（.新疆師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆烏魯木齊830054；.新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830054）

HPLC法測(cè)定野薔薇中齊墩果酸和熊果酸的含量

古力齊曼·阿布力孜1，阿吾提·艾買爾1，毛居代·亞爾買買提2，迪麗努爾·馬里克1，*
（1.新疆師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆烏魯木齊830054；2.新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830054）

目的：采用HPLC法測(cè)定野薔薇不同部位（根、莖、果實(shí)）中齊墩果酸和熊果酸的含量，比較不同產(chǎn)地野薔薇果實(shí)中齊墩果酸和熊果酸含量的差異。方法：采用Zorbax ODS色譜柱（4.6 mm×250 mm×5 μm），以甲醇-水（88∶12）為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。結(jié)果：齊墩果酸和熊果酸在20 min內(nèi)較好分離，其質(zhì)量濃度分別為0.02468～0.2468 mg/mL和0.02523～0.2523 mg/mL時(shí)與峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)分別為0.9994和0.9996；平均回收率為分別為99.96%（RSD為0.74%）和100.03%（RSD為0.95%）。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可同時(shí)測(cè)定野薔薇中齊墩果酸和熊果酸的含量，均在果實(shí)中含量最高；庫車縣、阿圖什市的野薔薇果實(shí)中齊墩果酸和熊果酸的含量最多，可作為最適開發(fā)利用的固定來源。

野薔薇，齊墩果酸，熊果酸，HPLC色譜法，含量測(cè)定

野薔薇（Rosa Multiflora Thunb.）屬于薔薇科薔薇屬植物，又名多花薔薇，是一種重要的藥食兩用的植物資源［1］。野薔薇藥用作用廣泛，根、莖、葉、花、果均可入藥，具有祛風(fēng)除濕、清熱解毒、活血、調(diào)經(jīng)、固精縮尿之功效等［2］?，F(xiàn)代藥理研究表明，齊墩果酸有消炎抑菌、降轉(zhuǎn)氨酶、防止肝硬化、降血脂、降血糖等多方面的臨床藥理作用，是治療肝炎的有效藥物之一［3-9］；熊果酸具有免疫調(diào)節(jié)作用及較好的抗腫瘤活性，對(duì)腫瘤形成各階段都有預(yù)防和抑制作用。新疆野薔薇不僅資源儲(chǔ)量大，而且野薔薇種源極為豐富。中藥中齊墩果酸和熊果酸常并存，兩者互為同分異構(gòu)體，不易分離，因此流動(dòng)相的選擇應(yīng)是兩成分達(dá)到基線分離。

近年來，已有文獻(xiàn)報(bào)道用高效液相色譜測(cè)定紅棗、芍藥、石見穿、白花蛇舌草、枇杷葉、夏枯草、柿葉、山楂中齊墩果酸（OA）和熊果酸（UA）的含量［10-17］，但目前未見有關(guān)野薔薇中齊墩果酸和熊果酸含量測(cè)定的相關(guān)報(bào)道。因此，為了研究野薔薇中齊墩果酸和熊果酸的含量差異，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法建立了野薔薇不同部位（根、莖、果實(shí)）中齊墩果酸和熊果酸含量測(cè)定的方法，并對(duì)來自新疆12批不同產(chǎn)地野薔薇果實(shí)中齊墩果酸和熊果酸進(jìn)行了含量測(cè)定，為不同產(chǎn)地野薔薇藥材提供質(zhì)量控制依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品、熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品 中國藥品生物制品檢定所，純度99.9%，批號(hào)：110709-200505、110742-200519；甲醇 色譜純，美國MREDA公司；三乙胺 色譜純，美國MREDA公司；冰乙酸 分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；野薔薇根、莖、果實(shí) 由新疆大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院努爾拜·阿布都沙勒克教授鑒定為薔薇科薔薇屬植物野薔薇（Rosa Multiflora Thunb.）的干燥根、莖、果實(shí)，果實(shí)產(chǎn)地分別為烏魯木齊南山、阿勒泰市、塔城市、博樂市、庫爾勒市、拜城縣、新和縣、庫車縣、溫宿縣、阿瓦提縣、喀什市、阿圖什市。

高效液相色譜儀 安捷倫1200LC，美國；色譜柱 安捷倫公司，Zorbax ODS4.6 mm×250 mm×5 μm；KQ2200DE超聲波清洗器 昆侖市超聲儀器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠生產(chǎn)；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)；MX5型分析天平 Mettler Toledo-瑞士。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的齊墩果酸對(duì)照品2.468 mg，熊果酸對(duì)照品2.523 mg，置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，得含齊墩果酸質(zhì)量濃度為0.2468 mg/mL，熊果酸的質(zhì)量濃度為0.2523 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，置4℃冰箱中保存，待用。

1.2.2 供試品溶液的制備 取一定量野薔薇根、莖和果實(shí)粉碎，過16目篩，石油醚脫脂，干燥，精密稱取野薔薇粉末各取3.0 g，分別置于100 mL錐形瓶中加入50 mL甲醇，稱重，浸泡3 h，超聲提?。l率40 kHz，45 min，35℃），放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，抽濾，濾液濃縮至5 mL，用0.45 μm微孔濾膜過濾，HPLC測(cè)定含量。

1.2.3 色譜條件 采用Agilent Zorbax ODS（4.6 mm×250 mm×5 μm）色譜柱，流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為緩沖溶液：三乙胺用冰乙酸調(diào)pH至5～7；甲醇-水（88∶12）；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；柱溫25℃；進(jìn)樣量為30 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 齊墩果酸和熊果酸的測(cè)定

對(duì)于分析時(shí)間、分離度、峰形等液相色譜分離分析的主要影響因素進(jìn)行了探討并確定的最佳色譜條件為甲醇-水（88∶12）為流動(dòng)相，柱溫為25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，流速為1.0 mL/min。此條件下得到同時(shí)分析齊墩果酸和熊果酸清晰圖譜，齊墩果酸的保留時(shí)間16.476 min，熊果酸的保留時(shí)間17.521 min，一次進(jìn)樣全部色譜峰在20 min內(nèi)完成，分析時(shí)間較短，色譜波動(dòng)較小，齊墩果酸和熊果酸色譜峰分離度達(dá)到1.446，拖尾因子0.983、1.005。

圖1 混合對(duì)照品和野薔薇提取液色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of mixed oleanolic acid and ursolic acid standards and extract from Rosa multiflora thunb

2.2 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性關(guān)系 分別精密吸取混合對(duì)照溶液50、100、200、300、400、500 μL用甲醇定容至500 μL，搖勻，按1.2.3節(jié)色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，齊墩果酸質(zhì)量濃度在0.02468～0.2468 mg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，齊墩果酸的線性方程為：Y=10924.0173C-42.0068（r=0.9994）；熊果酸的質(zhì)量濃度在0.02523～0.2523 mg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，熊果酸線性方程為：Y=9873.65167C-34.108（r=0.9996）。該方法對(duì)齊墩果酸和熊果酸的最低檢出限（按信噪比為3計(jì)）分別為3 ng和12 ng。

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取齊墩果酸和熊果酸混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次30 μL，測(cè)定峰面積。結(jié)果表明相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.19%和1.35%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取同一批野薔薇根（烏魯木齊市南山）樣品5份，按1.2.2節(jié)的方法制備樣品溶液，準(zhǔn)確吸取30 μL進(jìn)樣分析，進(jìn)行含量測(cè)定。計(jì)算齊墩果酸平均含量的RSD為1.51%，熊果酸平均含量的RSD為1.03%。

2.2.4 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn) 稱取6份野薔薇根（烏魯木齊市南山）樣品1.0 g，分低、中、高濃度三組，分別加入混合對(duì)照品溶液適量（1.0、1.5、2.0 mL），按1.2.2節(jié)的方法配制加標(biāo)樣品溶液，測(cè)定齊墩果酸和熊果酸的含量，計(jì)算加標(biāo)回收率。該方法齊墩果酸和熊果酸平均回收率分別為99.96%、100.03%，回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.74%、0.95%。結(jié)果見表1。

2.2.5 樣品的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 按1.2.2節(jié)樣品處理的方法制備樣品（烏魯木齊市南山）溶液，放置4℃冰箱里，以第一天的測(cè)定值為基準(zhǔn)，分別在1、3、5、7、9 d進(jìn)樣30 μL，測(cè)定其含量，計(jì)算齊墩果酸和熊果酸穩(wěn)定性RSD分別為0.47%和0.18%（n=5），相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均較小，表明處理后的樣品溶液至少在9 d內(nèi)4℃冰箱里可穩(wěn)定保存。

表1 齊墩果酸和熊果酸回收率分析（n=6）Table1 Mean spike recoveries for oleanolic acid and ursolic acid in a blank sample（n=6）

2.2.6 樣品的測(cè)定 精密吸取根、莖和果實(shí)（烏魯木齊市南山）的供試品溶液各30 μL，測(cè)定齊墩果酸和熊果酸的峰面積，計(jì)算齊墩果酸和熊果酸的平均含量，結(jié)果見表2。

表2 野薔薇不同部位中齊墩果酸和熊果酸的含量測(cè)定結(jié)果（n=5）Table2 Determination of oleanolic acid and ursolic acid in the different parts of Rosa multiflora Thunb.（n=5）

表3 12批產(chǎn)地野薔薇果實(shí)中齊墩果酸和熊果酸的測(cè)定結(jié)果（n=5）Table3 Determination of oleanolic acid and ursolic acidcontents in Rosa multiflora Thunb.fruits from 12 regions（n=5）

由表2可知，野薔薇根、莖和果實(shí)均含有齊墩果酸和熊果酸，根和莖中齊墩果酸和熊果酸含量差異不大，但果實(shí)中兩者含量相差二倍多，且總含量最多，由此可知果實(shí)是野薔薇最適進(jìn)一步開發(fā)利用的部位。因此，取12批新疆不同產(chǎn)地野薔薇果實(shí)樣本，制備供試品溶液1.2.3節(jié)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算熊果酸、齊墩果酸的含量，結(jié)果見表3。

由表3可知，不同產(chǎn)地野薔薇果實(shí)中齊墩果酸和熊果酸的含量范圍分別為0.2724～0.8674 mg/g和0.1602～0.6409 mg/g，含量差異較大。庫車縣和阿圖什市野薔薇果實(shí)中齊墩果酸和熊果酸的總含量最高。

3 結(jié)論

采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定野薔薇中齊墩果酸和熊果酸的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，野薔薇不同部位均含齊墩果酸和熊果酸，果實(shí)中齊墩果酸和熊果酸的總含量高于野薔薇莖和根；不同產(chǎn)地野薔薇果實(shí)中庫車縣和阿圖什市野薔薇果實(shí)中齊墩果酸和熊果酸的總含量最高。本文建立的高效液相色譜法樣品處理快捷、簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好，可同時(shí)測(cè)定齊墩果酸和熊果酸的含量，兩者達(dá)到基線分離。該方法更全面的反映中藥的物質(zhì)信息，為野薔薇的用藥和食品加工提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Determination of oleanolic acid and ursolic acid in Rosa Multiflora Thunb.by HPLC

Gulqiman·ABLIZ1，Awut·AMAR1，Maojudai·YAERMAIMAITI2，Dilnur·MALIK1，*
（1.Chemistry and Chemical Engineering，Xinjiang Normal University，Urumqi 830054，China；2.College of Life Science Xinjiang Normal University，Urumqi 830054，China）

Objective：The content of oleanolic acid（OA）and ursolic acid（UA）in different arts（roots，stems，fruits）of Rosa Multiflora Thunb.have been compared，and taken analysis on content of OA and UA in Rosa Multiflora Thunb.fruit from different origin by HPLC.Methods：Zorbax ODS chromatography column（4.6 mm×250 mm×5 μm），methanol-water（88∶12）was used as mobile phase，diode array detector at 210 nm wavelength had been used for detection.Results：The OA and UA was better separated within 20 minutes，it had good linear relationship between peak area mass concentration between 0.02468～0.2468 mg/mL and 0.02523～0.2523 mg/mL with the correlation coefficient of 0.9994 and 0.9996 respectively.The recovery rates were 99.96%（RSD 0.74%）and 100.03%（RSD 0.95%）.Conclusion：The established method was simple，quick，accurate，and had better reproducibility for the determination of OA and UA in Rosa Multiflora Thunb.at the same time by HPLC.The content of OA and UA in fruits reached the highest value.The Rosa Multiflora Thunb.from Kuqa and Atux had the highest content of OA and UA，so that could be used as the origin for the research of Rosa Multiflora Thunb.

Rosa Multiflora Thunb.；oleanolic acid；ursolic acid；HPLC；quantitative determination

TS207.3

A

1002-0306（2016）06-0049-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.001

2015-07-21

古力齊曼·阿布力孜（1988-），女，在讀碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物，E-mail：1436607467@qq.com。

迪麗努爾·馬里克（1964-），女，大學(xué)本科，教授，研究方向：天然產(chǎn)物，E-mail：pkudilnur@sina.com。

國家自然科學(xué)基金（21165018）項(xiàng)目資助；新疆少數(shù)民族科技人才特殊培養(yǎng)計(jì)劃科研項(xiàng)目（201423121）資助；自治區(qū)自然科學(xué)基金特配項(xiàng)目（201523119）資助。