顯齒蛇葡萄葉總黃酮對原發(fā)性高血壓大鼠的降血壓研究

趙喜蘭（漯河醫(yī)學高等專科學校，河南漯河462002）

顯齒蛇葡萄葉總黃酮對原發(fā)性高血壓大鼠的降血壓研究

趙喜蘭
（漯河醫(yī)學高等?？茖W校，河南漯河462002）

為了探討顯齒蛇葡萄葉總黃酮對原發(fā)性高血壓大鼠的影響，采用超聲波輔助提取，D-101大孔樹脂純化制備顯齒蛇葡萄葉總黃酮，將SHR大鼠40只隨機分成正常組、模型組、顯齒蛇葡萄葉黃酮組（100、200和400 mg/kg）和依那普利組（5 mg/kg），顯齒蛇葡萄葉黃酮組和依那普利組按照體重分別給予對應藥物灌胃10周，分別在10周和12周測定血壓及血清中各項指標。同時利用顯齒蛇葡萄葉黃酮不同劑量喂養(yǎng)正常大鼠6個月，測定血壓及血清各項指標。結(jié)果顯示，顯齒蛇葡萄葉黃酮治療原發(fā)性高血壓大鼠10周后能明顯降低血壓，另外也降低血清中血漿腎素、血管緊張素Ⅱ、內(nèi)皮縮血管肽和丙二醛的含量和提高一氧化氮、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽的含量，對正常Wistar大鼠喂養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)對血壓基本沒有影響。提示顯齒蛇葡萄葉黃酮對原發(fā)性高血壓大鼠具有明顯的降血壓效果，潛在的機理可能與腎素-血管緊張素的-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）調(diào)制和抗氧化系統(tǒng)有關，另外顯齒蛇葡萄葉黃酮對正常大鼠的血壓沒有影響，表明顯齒蛇葡萄葉黃酮可用來作為天然藥物或功能食品來預防高血壓。

顯齒蛇葡萄葉，總黃酮，原發(fā)性高血壓大鼠，降血壓

顯齒蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata）屬于葡萄科蛇葡萄屬藤本植物，中國特有種，主要分布在湖南、湖北、貴州等省份，一直為侗族、苗族和土家族等少數(shù)民族常用的茶代品［1］，其嫩葉做成茶后俗稱“藤茶”，用來治療或者預防多種疾病，具有抗氧化、降血糖、抗菌消炎、降血壓等功效，據(jù)民間流傳，顯齒蛇葡萄的主要功能是降血壓［2］。

顯齒蛇葡萄葉富含黃酮，主要包括二氫楊梅素、楊梅素、山奈酚、二氫山柰酚、楊梅素-3-O-L-鼠李糖苷、阿福豆素、1，5，8-三羥基-3-甲氧基酮、槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、楊梅素-3'-O-β-D-吡喃木糖苷、蛇葡萄素、楊梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷、紫云英苷、楊梅素-3-O-β-D-半乳糖苷等黃酮類化合物［3］。其中以二氫楊梅素含量最高［4］，目前國內(nèi)外有關顯齒蛇葡萄的研究主要集中在成分研究，相關研究還未見報道，本研究以顯齒蛇葡萄葉的總黃酮（The flavonoid fraction of Ampelopsis grossedentata，TFA）對SHR大鼠進行降血壓及其機制研究，為該天然植物的進一步開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

顯齒蛇葡萄葉 采集于湖南省康龍自然保護區(qū)，經(jīng)鑒定為葡萄科蛇葡萄屬藤本植物，采集的顯齒蛇葡萄葉嫩葉洗凈，晾干，120℃殺青10 min后60℃烘干粉碎，過60目篩；血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）和馬尿酰組胺酰亮氨酸（HHL） Sigma公司；血漿腎素、血管緊張素Ⅱ、內(nèi)皮縮血管肽放射免疫試劑盒 北京市福瑞生物工程公司；SOD、CAT、NO和MDA試劑盒 南京建成生物科技公司；K+、Na+和Cl-測定試劑盒 北京利德曼生化技術有限公司；依那普利 武漢益生堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；其他試劑 均為分析純。

ALC-NIBP多通道無創(chuàng)傷大鼠尾動脈血壓計 上海奧爾科特生物科技有限公司；RA-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮儀器設備有限公司；GMJ型全自動放射免疫γ計數(shù)器 江蘇省醫(yī)療電子研究所；7170A全自動生化檢測儀 日本日立；2450紫外分光光度儀日本島津。

1.2 實驗動物

自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）40只，雄性，12周齡，體重（200±25）g，清潔級，購于中國醫(yī)學科院實驗動物研究所，編號：SCKK（京）：2005-0013。清潔級Wistar大鼠40只，雌雄各半，體重（180±25）g，購于河南省實驗動物中心，編號：SYXK（豫）2010-0001。在溫度（25±2）℃，相對濕度50%±5%，光照時間為每天12 h環(huán)境下適應性喂養(yǎng)一周后進行實驗。實驗過程中均嚴格按照動物委員會所頒布的實驗動物護理和使用指南來進行操作。

1.3 實驗方法

1.3.1 TFA的制備和測定

1.3.1.1 TFA的提取和純化 稱取干燥顯齒蛇葡萄葉嫩葉5 kg，用60%乙醇浸泡24 h后利用循環(huán)式超聲波提取儀提取45 min，減壓濃縮回收乙醇得浸膏，浸膏80℃的熱水溶解后過濾得濾液，上D-101大孔樹脂，先用20%的乙醇洗脫去除雜質(zhì)，再用60%的乙醇洗脫，得總黃酮的乙醇溶液，減壓濃縮回收乙醇后烘干粉碎得顯齒蛇葡萄葉總黃酮粉末。

1.3.1.2 TFA含量測定的標準曲線的繪制 精密稱取在80℃干燥至恒重的槲皮素對照品20 mg，置100 mL容量瓶中，加70%乙醇50 mL，置于水浴上微熱使溶解，放冷，加乙醇稀釋至刻度，搖勻。使之成為濃度為0.2 mg/mL的槲皮素標準品溶液，精密吸取對照液0、 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分別置于25 mL量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻放置6 min后，加10%氯化鋁溶液1.0 mL，搖勻。放置6 min后，加1.0 mol/L NaOH 10 mL，最后各用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置15 min。用第一瓶作空白，在510 nm處測吸光度，以吸光度（A）作縱坐標，蘆丁濃度（C）作橫坐標繪制標準曲線，得出回歸方程：A=0.0825C－0.0008（r= 0.9996）。

1.3.1.3 TFA的含量測定 精確稱取顯齒蛇葡萄總黃酮粉末5.0 g，加乙醇溶解后，用水定容至100 mL的容量瓶中，量取1 mL，參照標準曲線的制作方法測定TFA的含量。

1.3.2 TFA體外降血壓研究 分別取300 μL底物馬尿酰組胺酰亮氨酸溶液于5支試管中，向其中的4支管分別加入30 μL樣品溶液，另一只試管作為對照，加入30 μL蒸餾水。37℃水浴條件下放置5 min。任取一支添加有樣液的試管，向其添加250 μL 1 mol/L HCl溶液。再向5支試管中分別加入100 μL血管緊張素轉(zhuǎn)換酶溶液，置于渦旋混合器上充分攪拌。在37℃水浴條件下反應60 min。終止反應需向各試管中添加250 μL 1 mol/L HCl（預先加入的試管除外），在漩渦混合器上充分攪拌。取1.5 mL乙酸乙酯加入各試管中，渦旋混合器上攪拌約1 min后進行離心分離（3000 r/min，10 min）。用移液管移取上層溶液（乙酸乙酯層）1 mL，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀干燥（40～45℃）。再經(jīng)減壓干燥60 min后，用3 mL蒸餾水溶解，228 nm波長處測吸光度。

抑制率（%）=（Ac-As）/（Ac-Ab）×100

式中：As為試樣的吸光度值；Ac為蒸餾水的吸光度值；Ab為預先加入鹽酸組的吸光度值。

1.3.3 TFA對SHR大鼠的降血壓研究 50只SHR大鼠隨機分為5組，第Ⅰ組為模型組，第Ⅱ組依那普利組，顯齒蛇葡萄葉黃酮低、中、高劑量組，其中模型組給予蒸餾水，劑量為10 g/kg體重。依那普利治療組每天灌胃依那普利（5 mg/kg體重），顯齒蛇葡萄葉總黃酮低、中、高劑量組分別為100、200、400 mg/kg體重。每2周測定SHR的收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP），喂養(yǎng)10周后停藥，每組取4只SHR大鼠麻醉摘除眼眶取血離心得血清備用，剩下的SHR大鼠繼續(xù)喂養(yǎng)2周后測量收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）。同樣麻醉摘除眼眶取血離心得血清，用于生化指標的測定。

1.3.4 血清生化指標的測定 采集的血清，采用放射免疫分析法測定血漿腎素（PRA）、血管緊張素Ⅱ（ANGⅡ）、內(nèi)皮縮血管肽（ET），根據(jù)試劑盒說明用全自動生化檢測儀檢測超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、NO和丙二醛（MDA）。

1.3.5 TFA長期喂養(yǎng)對正常大鼠的血壓影響 Wistar大鼠40只，隨機分為4組，第Ⅰ組正常組，每天除基本飼料外喂蒸餾水，第Ⅱ-Ⅳ組分別喂養(yǎng)顯齒蛇葡萄葉黃酮劑量為100、200、400 mg/kg體重，每天一次，連續(xù)喂養(yǎng)6個月，最后一天測定血壓，然后麻醉，摘除眼眶取血離心得血清，采用分光光度法測定血清中K+、Na+和Cl-濃度。

1.3.6 統(tǒng)計學分析 全部數(shù)據(jù)用SPSS 13.00軟件包處理，正態(tài)分布的資料以（x±s）表示，非正態(tài)分布的資料均取自然對數(shù)正態(tài)化后進行統(tǒng)計分析。以p＜0.05，p＜0.01為統(tǒng)計學顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 TFA的含量

顯齒蛇葡萄葉嫩葉經(jīng)60%乙醇浸泡，超聲波輔助提取，減壓濃縮得1894.5 g浸膏，浸膏經(jīng)D-101大孔樹脂純化后減壓濃縮得浸膏982.6 g，最后測定黃酮的含量為86.4%。

2.2 TFA體外對ACE活性的抑制

采用ACE抑制體外檢測方法，利用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶水解血管緊張素的體外模擬物馬尿酰組氨酰亮氨酸產(chǎn)生馬尿酸，然后在228 nm測定吸光值計算馬尿酸的含量從而計算ACE抑制劑的活性。測得的抑制率越高，說明降血壓能力越強。對顯齒蛇葡萄葉黃酮的降血壓活性測定的結(jié)果見圖1。不同劑量的顯齒蛇葡萄葉黃酮具有一定的降血壓活性，并且隨著顯齒蛇葡萄葉黃酮濃度的增加，降血壓活性逐漸增加。

圖1 TFA體外對ACE的抑制效果Fig.1 The inhibitory ration of TFA on ACE

2.3 TFA對SHR大鼠的血壓影響

如圖2所示，治療前，SHR大鼠的收縮壓在166～175 mmHg之間。舒張壓在136～149 mmHg之間。經(jīng)過不同劑量顯齒蛇葡萄葉黃酮和依那普利的治療后發(fā)現(xiàn)，顯齒蛇葡萄葉黃酮對SHR的血壓都具有一定降低效果，并呈現(xiàn)劑量依賴性，但是效果不如依那普利的降血壓效果，停藥2周后，依那普利治療組的血壓具有明顯的回升，但是顯齒蛇葡萄葉黃酮治療后2周的血壓基本維持在停藥前。

2.4 TFA對SHR大鼠血清中PRA，ANGⅡ，ET和NO的影響

從圖3得知，經(jīng)過10周的治療，TFA-100劑量組大鼠血清中的血漿腎素（PRA）、血管緊張素Ⅱ（ANGⅡ）和內(nèi)皮縮血管肽（ET）的含量相對模型組大鼠的含量沒有明顯的下降，而TFA-200、TFA-400以及依那普利治療組血清中的PRA、ANGⅡ有明顯的降低，而ET的含量變化不明顯，另外，TFA-100劑量組大鼠血清中的NO含量沒有明顯的升高，而其他治療組血清中的NO含量有明顯的提高；經(jīng)過10周治療停藥2周后發(fā)現(xiàn)，依那普利治療組血清中PRA、ANGⅡ和ET的含量有明顯的升高，而NO含量明顯降低，其他治療組變化不明顯。

圖2 顯齒蛇葡萄葉黃酮對SHR大鼠血壓的影響（n=10）Fig.2 The effect of TFA on blood pressure of the SHRS（n=10）

2.5 TFA對SHR大鼠血清中SOD、CAT、GSH和MDA的影響

從圖4可知，經(jīng)過10周治療后不同治療組，除TFA-100外，其他組血清中的SOD、CAT和GSH的含量明顯升高，而MDA含量有明顯的下降，但是停藥2周后依那普利組與治療末相比，血清中的SOD、CAT、GSH含量明顯降低，MDA含量明顯升高，其他治療組無明顯的變化。

2.6 TFA對正常大鼠的血壓和血清Na+、K+和Cl-的影響

從表1可知，喂養(yǎng)不同劑量顯齒蛇葡萄葉黃酮6個月后，與正常組大鼠比較，不同劑量組大鼠血壓沒有明顯變化，另外測定血清中Na+、K+和Cl-的含量發(fā)現(xiàn)，Na+的含量沒有明顯變化，而K+的含量與正常組大鼠比較有稍微的提高，而Na+/K+的比值有變小趨勢，Cl-的濃度也沒有明顯的變化。

3 討論

圖3 TFA對SHR大鼠血清中PRA，ANGⅡ，ET和NO的影響Fig.3 The effect of TFA on PRA，ANGⅡ，ET and NO of the SHRS

圖4 TFA對SHRs大鼠血清中SOD、CAT、GSH和MDA的影響Fig.4 The effect of TFA on plasma SOD，CAT，GSH and MDA of the SHRS

表1 TFA對正常大鼠血壓及血清中K+，Na+和Cl-的影響Table1 The effect of TFA on the blood pressure，K+，Na+and Cl-in normotensive rats

SHR是一種比較成熟的高血壓模型，在藥理學和病理學上，已廣泛被使用在降血壓的相關研究［5］，本研究證明了顯齒蛇葡萄葉總黃酮對SHR大鼠的血壓具有良好的降血壓效果，發(fā)現(xiàn)在第二周就有明顯的降血壓功能，并且該效果至少能維持2周在治療10周停藥后。通過比較，雖然依那普利治療組在降低血壓、抑制腎素血-管緊張素-醛固酮系統(tǒng)明顯優(yōu)于顯齒蛇葡萄葉黃酮，但是本研究發(fā)現(xiàn)其本身具有很大的副作用，在臨床上也有明顯的報道。盡管顯齒蛇葡萄葉黃酮的降血壓效果不及依那普利治療，但是研究發(fā)現(xiàn)其基本沒有副作用。

腎素血-管緊張素-醛固酮（RAAS）系統(tǒng)在調(diào)節(jié)體液平衡、電解質(zhì)和血壓起著重要作用。腎素是一種蛋白酶，主要促進生成血管緊張素原和增加血管緊張素Ⅰ。血管緊張素Ⅰ可以進一步水解生成血管緊張素II。在RAAS系統(tǒng)，血管緊張素II是一個重要組成部分，收縮血管，增加外周阻力，升高動脈血壓，調(diào)節(jié)醛固酮分泌［6-7］。顯齒蛇葡萄葉黃酮不同劑量能夠下調(diào)腎素血管緊張素II的含量，尤其是中劑量和高劑量作用顯著，表明顯齒蛇葡萄葉黃酮降血壓可能是通過調(diào)節(jié)RAAS系統(tǒng)而實現(xiàn)。此外，停藥后2周發(fā)現(xiàn)，血清中的腎素，血管緊張素Ⅱ，內(nèi)皮縮血管肽與依那普利治療組比較，沒有明顯的變化，充分說明顯齒蛇葡萄葉黃酮在降血壓方面沒有副作用。

內(nèi)皮素（ET）由血管內(nèi)皮細胞分泌，是一種較強的縮血管物質(zhì)［8］。而NO也被稱為內(nèi)皮依賴性因子，能擴張血管，調(diào)節(jié)血壓，抑制血細胞與內(nèi)皮細胞的黏附，抑制內(nèi)皮細胞增殖，從而降低內(nèi)皮素的分泌。在內(nèi)皮系統(tǒng)，NO和內(nèi)皮素相互制約［9］。本研究發(fā)現(xiàn)顯齒蛇葡萄總黃酮能夠明顯增加NO的含量和降低內(nèi)皮素的含量。

抗氧化系統(tǒng)減弱是一個高血壓的主要并發(fā)癥［10］，高血壓使得血管內(nèi)皮細胞受損，從而產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），反過來，ROS有助于高血壓疾病。ROS水平調(diào)制的內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)，其中SOD、CAT和GSH是最重要的抗氧化要素。高血壓的條件下，水平SOD、CAT和GSH降低，ROS水平升高。過多的ROS攻擊不飽和脂肪酸在細胞膜上，并引起脂質(zhì)過氧化，從而上調(diào)MDA內(nèi)容。因此，血漿SOD、CAT、GSH和MDA水平反映ROS水平［11］。本研究中顯齒蛇葡萄葉黃酮能夠明顯的上調(diào)SOD、CAT和GSH的含量，并且明顯下調(diào)血漿MDA水平，表明顯齒蛇葡萄葉黃酮具有較好的抗氧化活性。并且停藥后2周，SOD、CAT、GSH和MDA的含量沒有明顯的變化。

本研究首次證明了顯齒蛇葡萄葉黃酮對正常大鼠血壓的影響不明顯。在侗族地區(qū)，顯齒蛇葡萄葉作為茶代品使用有千年的歷史，主要用來治療高血壓或正常血壓人群引用。所以評價長期食用顯齒蛇葡萄葉帶來的副作用顯得格外重要。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過6個月的喂養(yǎng)正常血壓大鼠后發(fā)現(xiàn)顯齒蛇葡萄葉黃酮對血壓和主要器官無影響。但增加了血清K+含量和降低了Na+/K+的比值。與大量藥理和臨床實驗相符。適當降低血清中Na+和提高K+的含量有利于心血管系統(tǒng)［12］。

4 結(jié)論

利用超聲波提取顯齒蛇葡萄中的總黃酮，繼而利用大孔樹脂進行純化，得到了較高純度的顯齒蛇葡萄總黃酮，通過喂養(yǎng)SHR大鼠后，通過定期測定SHR大鼠的舒張壓和收縮壓，并且在實驗末測定與高血壓相關生化指標發(fā)現(xiàn)顯齒蛇葡萄葉黃酮對原發(fā)性高血壓大鼠具有明顯的降血壓效果，并且停藥后無反彈，另外，利用顯齒蛇葡萄總黃酮喂養(yǎng)正常SD大鼠6個月，發(fā)現(xiàn)對正常大鼠的血壓沒有影響。通過實驗可以證明顯齒蛇葡萄葉黃酮可以作為天然藥物或功能食品來預防高血壓是可行的。

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Effect of the flavonoid fraction of Ampelopsis grossedentata on spontaneously hypertensive rats

ZHAO Xi-lan
（Luohe Medical College，Luohe 462002，China）

The present study aimed to assess the effect of the total flavoniods Ampelopsis grossedentata on （TFA）spontaneously hypertensive rats and normotensive rats，TFA was extracted by ultrasonic method and purified by D-101 macroporous resin.The spontaneously hypertensive rats in experimental group were intragastrically administrated with TFA at 100，200 and 400 mg/kg once a day for consecutive 10 weeks.Rats were given intragastrically with 5 mg/kg enalapril as controls.At end of 10 week，some rats were randomly selected for blood pressure determination and were anesthetized for serum preparation.After keeping normally for 2 weeks，the remaining rats were subjected to blood pressure measurement and serum isolation.The concentration of PRA，ANGⅡ，ET，NO，SOD，CAT，GSH，MDA were evaluated.After the healthy SD rats were treated with TFA for 6 months，the blood pressure，the concentration of Na+，K+，Cl-and Na+/K+were measured.TFA significantly reduced the blood pressure，the concentration of PRA，ANG II，ET and MDA in serum and increase the level of NO，SOD，CAT，GSH in primary hypertension rats for 10-week treatment.There was no significant changes in blood pressure of control rats after TFA treatment.TFA significantly reduced the blood pressure in primary hypertension rats.The potential mechanism may be related with the antioxidant system regulation by RAAS.No significant effect was observed on healthy rats.All these suggested that ampelopsis grossedentata showed significant effect on preventing hypertension as natural medicine and natural function food.

Ampelopsis grossedentata；flavoniods；spontaneously hypertensive rats；antihypertensive

TS201.1

A

1002-0306（2016）06-0351-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.062

2015－06－12

趙喜蘭（1969-），女，大學本科，主要從事藥學方面的研究，E-mail：zxlan69@163.com。