擬南芥硫苷生物合成相關(guān)基因的組織和脅迫誘導(dǎo)表達(dá)譜的全基因組分析

杜 海，冉 鳳，劉 靜，文 婧，馬珊珊，柯蘊(yùn)倬，孫麗萍，李加納

（西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，重慶400715）

擬南芥硫苷生物合成相關(guān)基因的組織和脅迫誘導(dǎo)表達(dá)譜的全基因組分析

杜 海，冉 鳳，劉 靜，文 婧，馬珊珊，柯蘊(yùn)倬，孫麗萍，李加納

（西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，重慶400715）

【目的】分析擬南芥中硫代葡萄糖苷（Glucosinolatcs，簡稱硫苷）生物合成相關(guān)基因在不同組織器官、不同發(fā)育時(shí)期及不同生物和非生物脅迫處理?xiàng)l件下的表達(dá)譜，為篩選控制硫苷合成的關(guān)鍵基因、解析硫苷的生物合成規(guī)律及其在植物抗逆脅迫過程中的作用奠定基礎(chǔ)。【方法】利用AtGenExpress和PLEXdb中的10組表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)和2組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析擬南芥中硫苷生物合成途徑82個(gè)結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因的時(shí)空表達(dá)特性及其受生物和非生物脅迫的表達(dá)模式；采用Real-time PCR技術(shù)對(duì)10個(gè)硫苷合成途徑的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因的表達(dá)譜進(jìn)行驗(yàn)證；并利用STRING v10軟件分析硫苷生物合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)模式的相關(guān)性?！窘Y(jié)果】組織表達(dá)特性分析結(jié)果表明，擬南芥硫苷生物合成相關(guān)基因在營養(yǎng)器官和生殖器官中的表達(dá)模式差異較大，相關(guān)基因在營養(yǎng)器官中具有較高的表達(dá)量，在生殖器官中的表達(dá)量則較低，表明硫苷主要在營養(yǎng)組織中合成；其中脂肪族硫苷合成相關(guān)基因在莖、葉等地上營養(yǎng)組織中的表達(dá)量較高，而吲哚族硫苷合成相關(guān)基因則在根、莖、葉等地上和地下組織中均有較高的表達(dá)，且基因在同一組織的不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量通常具有差異，表明基因的表達(dá)還具有時(shí)空特異性；熒光定量PCR分析結(jié)果證明10個(gè)硫苷合成途徑代表基因的表達(dá)譜與芯片數(shù)據(jù)的結(jié)果保持一致；脅迫表達(dá)分析結(jié)果表明，脂肪族和吲哚族硫苷合成相關(guān)基因的表達(dá)均受到部分生物和非生物脅迫因子的誘導(dǎo)表達(dá)，其中吲哚族硫苷合成相關(guān)基因更易受到丁香假單胞桿菌（Pseudomonas syringae）、甘藍(lán)鏈格孢菌（Alternaria brassicicola）、桃蚜（Myzus persicae）等生物和低溫（4℃）、高鹽、高溫（38℃）等非生物脅迫因子的誘導(dǎo)表達(dá)；共表達(dá)分析結(jié)果表明，脂肪族和吲哚族硫苷合成分支途徑內(nèi)相關(guān)調(diào)控基因與結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)模式的相關(guān)性較高?！窘Y(jié)論】擬南芥硫苷生物合成相關(guān)基因主要在營養(yǎng)組織中高表達(dá)，在種子中低表達(dá)；植物中存在一個(gè)硫苷轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，負(fù)責(zé)將營養(yǎng)組織中合成的硫苷轉(zhuǎn)運(yùn)到種子中貯藏；硫苷合成相關(guān)基因的表達(dá)受到病原菌、蟲害、高溫等逆境因子的影響，其中吲哚族硫苷合成相關(guān)基因更易受到生物和非生物脅迫因子的誘導(dǎo)表達(dá)，說明吲哚族硫苷可能對(duì)植物抗性更為重要。

擬南芥；硫苷；表達(dá)模式；發(fā)育時(shí)期；生物脅迫；非生物脅迫；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

0 引言

【研究意義】硫代葡萄糖苷（glucosinolatcs，簡稱硫苷）是一類含氮、含硫的植物次生代謝產(chǎn)物［1］，廣泛存在于食用油料作物、蔬菜和擬南芥等十字花科植物中，是該科植物產(chǎn)生的一類重要次生代謝產(chǎn)物［2-3］，其降解產(chǎn)物具有多種生物學(xué)功能［4-5］。例如，硫苷降解產(chǎn)物異硫氰酸酯類（isothiocyanates，ITCs）、硫氰酸酯類（thiocyanates，TCs）、腈類（nitrilcs）、惡唑烷酮類（oxazolidinones，ODs）等具有較強(qiáng)的防腐和抗菌作用，可作為殺蟲劑、殺菌劑、抗微生物制劑和天然的生物熏蒸消毒劑［6-7］；硫苷具有芳香或刺激性氣味，既可作為十字花科專食性昆蟲（crucifer specialists）的引誘劑，刺激或抑制某些昆蟲產(chǎn)卵與攝食［8］，又可作為雜食性昆蟲（generalist herbivores）的驅(qū)散劑［9］；同時(shí)硫苷還賦予食物特殊的風(fēng)味，如蘿卜、甘藍(lán)等的辛辣味［10］；蘿卜硫素則被證明是迄今發(fā)現(xiàn)的抗癌活性最強(qiáng)的植物活性物質(zhì)，可預(yù)防前列腺癌、肺癌、食道癌等［10-11］。可見，硫苷及其降解產(chǎn)物對(duì)植物抗性和人類健康具有重要作用。擬南芥是重要的十字花科模式植物，相對(duì)于其他植物，具有較為完整的基因組信息和豐富的表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)資源。因此，在擬南芥中對(duì)硫苷的動(dòng)態(tài)合成規(guī)律展開系統(tǒng)研究，不僅具有重要的理論研究意義，還可以為進(jìn)一步在油菜、白菜等作物中開展相關(guān)研究提供重要的參考?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】硫苷類化合物均由β-D-硫葡萄糖基、硫化肟基團(tuán)以及來源于氨基酸的側(cè)鏈R基組成。通常根據(jù)側(cè)鏈R基的來源將硫苷分為脂肪族硫苷、吲哚族硫苷和芳香族硫苷三大類［12］。目前硫苷生物合成途徑較清楚，主要酶基因均已被證實(shí)［13］。硫苷的生物合成途徑大致可以分為前體氨基酸側(cè)鏈延長、核心結(jié)構(gòu)合成和次級(jí)修飾3個(gè)主要階段［14］。其中，核心結(jié)構(gòu)合成過程是所有硫苷合成的共同部分。核心結(jié)構(gòu)形成后再經(jīng)羧基化、甲基化、葡萄糖基化等次級(jí)修飾形成不同的硫苷類化合物。硫苷側(cè)鏈修飾具有重要的作用，硫苷及其降解產(chǎn)物的理化性質(zhì)很大程度上取決于硫苷的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)［15］。近年來，硫苷調(diào)控機(jī)理方面的研究也取得了一定的進(jìn)展，bHLH、Dof和MYB類轉(zhuǎn)錄因子均被證實(shí)參與調(diào)控硫苷的生物合成［15-19］。其中，MYB類轉(zhuǎn)錄因子對(duì)硫苷的生物合成尤為重要［15-16，20-22］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雖然硫苷的生物合成和調(diào)控途徑研究較清楚，但是對(duì)其合成規(guī)律、生物學(xué)功能仍缺乏系統(tǒng)的研究。鑒于硫苷的含量在不同材料和組織、不同發(fā)育時(shí)期和環(huán)境下均不同［3，23］，因此，研究硫苷合成相關(guān)基因的表達(dá)模式的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，將有助于揭示硫苷的生物合成和代謝規(guī)律、篩選控制硫苷合成或調(diào)控的關(guān)鍵基因?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究基于AtGenExpress［24-25］和 PLEXdb［26］中的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，結(jié)合Real-time PCR技術(shù)，在全基因組水平對(duì)擬南芥硫苷生物合成途徑主要酶基因和調(diào)控基因的時(shí)空表達(dá)特性和脅迫誘導(dǎo)表達(dá)譜進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，以解析不同硫苷組分的生物合成規(guī)律和脅迫誘導(dǎo)表達(dá)模式。

1 材料與方法

1.1硫苷生物合成相關(guān)基因的組織表達(dá)特性分析

本研究分析的硫苷生物合成相關(guān)基因如表 1所示。擬南芥組織表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)來源于AtGenExpress （http：//www.weigelworld.org/resources/microarray/ AtGenExpress），共包含不同發(fā)育時(shí)期的79個(gè)組織或器官［24］。均一化的芯片數(shù)據(jù)利用Cluster v3.0軟件［27］采用層級(jí)聚類法分析基因的表達(dá)譜，并用 Java TreeView軟件［27］圖形化基因表達(dá)譜熱力圖（heatmaps）。擬南芥哥倫比亞野生型（Arabidopsis thaliana ecotype Columbia-0）種子購自于 ARBC（擬南芥種質(zhì)資源中心），由重慶市油菜工程研究中心實(shí)驗(yàn)室保存。2016 年1月進(jìn)行組培室種植，培養(yǎng)條件為16 h光照/8 h黑暗，晝夜溫度 22℃/18℃，相對(duì)濕度 70%。分別于苗期和花期取植株的根、莖、葉、花和種子等組織，液氮中速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2硫苷生物合成相關(guān)基因的脅迫誘導(dǎo)表達(dá)譜分析

擬南芥生物（病原菌和蟲害）和非生物（激素和環(huán)境因子）脅迫誘導(dǎo)的基因芯片數(shù)據(jù)來自于AtGenExpress［25］和植物表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫（plant expression database， PLEXdb）［26］。所采用的9組芯片數(shù)據(jù)的編號(hào)分別為GSE5525（AT49）、GSE5640（AT50）、GSE5684 （AT51）、AT59、GSE6516（AT63）、GSE17193 （AT84）、GSE18960（AT90）、GSE20188（AT110）和GSE24552（AT112）。病原菌和蟲害芯片數(shù)據(jù)的試驗(yàn)處理詳見PLEXdb數(shù)據(jù)庫中相關(guān)芯片數(shù)據(jù)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)（http：//www.plexdb.org/plex.php？database= Arabidopsis）［26，28-30］；激素和環(huán)境因子脅迫誘導(dǎo)芯片數(shù)據(jù)的實(shí)驗(yàn)處理詳見AtGenExpress［24-25］。所有芯片數(shù)據(jù)均為已進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理的數(shù)據(jù)。

表1　擬南芥硫苷生物合成相關(guān)基因Table 1 Glucosinolate biosynthetic genes in Arabidopsis

續(xù)表1 Continued table 1

續(xù)表1 Continued table 1

根據(jù)擬南芥芯片信息，共找到78個(gè)探針，分別對(duì)應(yīng)78個(gè)基因。由于高度同源，有4個(gè)探針對(duì)應(yīng)2個(gè)基因（IPMDH1和IPMDH3，CYP79F1和CYP79F2），有2個(gè)基因（TSB1和NIT1）沒有找到對(duì)應(yīng)的探針。芯片數(shù)據(jù)用 Cluster v3.0軟件進(jìn)行層級(jí)聚類法分析相關(guān)基因的表達(dá)譜［27］，并利用Java TreeView軟件可視化相應(yīng)的表達(dá)譜熱力圖（heatmaps）［31］。利用STRING v10 （http：//string-db.org/newstring_cgi/show_input_page.pl？UserId=JnIkwsVs3Jb_&sessionId=U_KvLy4CMUs4）［32］軟件分析硫苷生物合成相關(guān)基因的共表達(dá)和互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3試劑、藥品和儀器

植物RNApure超純總RNA快速提取試劑盒購自于北京博邁德基因技術(shù)有限公司；RQ1 RNase-Free DNase購于美國 Promega公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit）購于TaKaRa公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（SsoAdvanced Universal超混合液）、耗材和儀器（CFX96 Touch）均購于BIO-RAD公司。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

按照RNApure超純總RNA快速提取試劑盒的操作說明分別提取野生型擬南芥根、莖、葉、花、角果和成熟種子的總RNA；經(jīng)DNaseⅠ（RQ1）處理去除總RNA中殘留的痕量基因組DNA；根據(jù)TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行第一鏈cDNA的合成。使用SsoAdvanced Universal Mix（SYBR Green）試劑盒和BIO-RAD公司的CFX96 Touch熒光定量PCR儀進(jìn)行Real-time PCR（qPCR）擴(kuò)增。以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，以擬南芥Actin 7（AT5G09810.1）為內(nèi)標(biāo)基因，分別用10個(gè)硫苷合成相關(guān)基因的特異引物（表2）進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。采用2步法反應(yīng)程序，95℃5 min；95℃ 15 s，58℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)；繪制熔解曲線。設(shè)3次重復(fù)，取平均值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因在不同樣品中的相對(duì)表達(dá)量。

表2　擬南芥硫苷生物合成途徑10個(gè)代表基因的qPCR引物Table 2 Primers of 10 representive genes involved in glucosinalate biosynthesis pathway in Arabidopsis

2 結(jié)果

2.1硫苷生物合成相關(guān)基因的組織表達(dá)特性

對(duì)硫苷生物合成和分解途徑的70個(gè)酶基因和12個(gè)調(diào)控基因（表1）在擬南芥不同發(fā)育時(shí)期79個(gè)組織或器官中的組織表達(dá)特性分析結(jié)果表明（圖 1），大部分基因在不同組織和器官中的表達(dá)模式不同，且硫苷合成相關(guān)基因在根、莖、葉等營養(yǎng)組織中的表達(dá)量較高，在花和種子中的表達(dá)量普遍較低，說明硫苷可能主要在營養(yǎng)器官中合成。其中，脂肪族硫苷合成相關(guān)基因在莖、葉等地上營養(yǎng)器官中的表達(dá)量明顯高于根中的表達(dá)量；吲哚族硫苷合成相關(guān)基因則在根、莖和葉中有較高的表達(dá)量，推測(cè)脂肪族硫苷主要在地上營養(yǎng)組織中合成，而吲哚族硫苷在地下和地上營養(yǎng)組織中均有合成。另外，同一基因在相同組織和器官不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量通常有一定的差異，說明相關(guān)基因的表達(dá)可能具有時(shí)期特異性。

圖1　擬南芥硫苷代謝途徑相關(guān)基因表達(dá)譜Fig. 1Ex pression analysis of glucosinolate biosy nthetic genes in Arabidopsis

脂肪族硫苷氨基酸側(cè)鏈延伸基因MAM1在地上營養(yǎng)組織中的表達(dá)量較高，MAM3在根中的表達(dá)量較高；次級(jí)結(jié)構(gòu)修飾基因FMOGSL-OX1、FMOGSL-OX3和FMOGSL-OX5在地上組織中的表達(dá)量較高，F(xiàn)MOGSLOX2在花中的表達(dá)量較高，F(xiàn)MOGSL-OX4則在根中的表達(dá)量較高。而吲哚族硫苷側(cè)鏈修飾相關(guān)基因（CYP81F2、CYP81F3、CYP81F4、IGMT1和IGMT2）在根中的表達(dá)量較高。說明脂肪族硫苷的結(jié)構(gòu)修飾可能在植物發(fā)育不同時(shí)期和組織中均有發(fā)生，而吲哚族硫苷的結(jié)構(gòu)修飾可能主要發(fā)生在根中。

此外，脂肪族硫苷合成的調(diào)控基因 MYB28和MYB29的表達(dá)量較高，且與脂肪族硫苷合成途徑酶基因的表達(dá)模式相似，而MYB76的表達(dá)量較低，說明該基因的功能可能相對(duì)較弱。同理，吲哚族硫苷合成的調(diào)控基因 MYB34和 MYB51的表達(dá)量相對(duì)較高，而MYB122的表達(dá)量則較低。其中MYB34在根和地上組織中均表達(dá)，而MYB51主要在地上組織中表達(dá)，表明MYB34調(diào)控地上和地下組織中硫苷的合成，而MYB51主要調(diào)控地上組織中硫苷的合成。在硫苷降解途徑中，黑芥子酶基因TGG4在根中的表達(dá)量較高，PEN2和PEN3在大部分營養(yǎng)組織中的表達(dá)量較高，NSP2則在種子中的表達(dá)量較高（圖 1），說明不同硫苷降解酶基因在植物防御系統(tǒng)中可能負(fù)責(zé)相應(yīng)組織中硫苷的水解過程。

為驗(yàn)證芯片數(shù)據(jù)的分析結(jié)果，選擇10個(gè)分別參與脂肪族和吲哚族硫苷合成（包括前體氨基酸側(cè)鏈延長、核心結(jié)構(gòu)合成和次級(jí)修飾3個(gè)階段）（表1和表2）及調(diào)控的關(guān)鍵基因，采用qPCR法分析它們?cè)跀M南芥中的表達(dá)模式。結(jié)果表明，10個(gè)硫苷合成相關(guān)基因在營養(yǎng)組織中的表達(dá)量較高，在種子組織中的表達(dá)量則較低。其中，脂肪族硫苷合成相關(guān)基因MAM1、AOP2、CYP79F1、CYP83A1和MYB28主要在莖、葉或角果中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，在根、花和種子中的表達(dá)量相對(duì)較低；吲哚族硫苷合成相關(guān)基因IGMT1、ASA1、CYP83B1、CYP79B2和MYB34在根、莖或葉中的表達(dá)量較高，在角果、花和種子中的表達(dá)量則相對(duì)較低（圖 2）。qPCR法分析的結(jié)果與芯片數(shù)據(jù)分析的結(jié)果一致性較好，均證明脂肪族硫苷合成相關(guān)基因主要在地上營養(yǎng)組織中表達(dá)，而吲哚族硫苷合成相關(guān)基因在地上和地下營養(yǎng)組織中均有較高的表達(dá)水平。僅AOP2、ASA1 和MYB34的表達(dá)量略有差異，但是兩組數(shù)據(jù)的總體表達(dá)模式仍一致。例如，AOP2在芯片數(shù)據(jù)的葉、莖和花器官中均有較高的表達(dá)量，在qPCR數(shù)據(jù)的葉和莖中也具有較高的表達(dá)量，但是在花中的表達(dá)量則相對(duì)較低（圖1和圖2）。這是因?yàn)閮山M數(shù)據(jù)的取樣時(shí)期和組織不同所致，該基因在芯片數(shù)據(jù)的花中的表達(dá)量通常也較低，僅在特定時(shí)期的花器官中具有相對(duì)較高的表達(dá)量（圖1）。

2.2硫苷生物合成相關(guān)基因受生物脅迫的表達(dá)譜

對(duì)硫苷生物合成相關(guān)基因在9組生物脅迫芯片數(shù)據(jù)（AT49、AT50、AT51、AT59、AT63、AT84、AT90、AT110和AT112）中的表達(dá)譜分析結(jié)果表明，硫苷生物合成途徑部分酶基因的表達(dá)明顯受到病原細(xì)菌、真菌和蟲害的脅迫誘導(dǎo)（圖3）。在4組病原菌脅迫數(shù)據(jù)中，硫苷合成和降解相關(guān)基因明顯受到細(xì)菌性病原菌的抑制表達(dá)。其中，假單胞桿菌Pseudomonas G62 （AT112）浸染植株后，多數(shù)硫苷合成相關(guān)基因的表達(dá)受到抑制，僅有部分下游基因的表達(dá)未受影響（如MVP1、NSP2、NSP5、PEN3、BZO1、CHY1、TGG2 和GSH1）。在丁香假單胞桿菌（Pseudomonas syringae）的脅迫下，除了部分次級(jí)修飾基因（FMOGS-OX2、FMOGS-OX4、FMOGS-OX5和GS-OH），脂肪族硫苷合成相關(guān)基因的表達(dá)量較低，而吲哚族硫苷合成和降解相關(guān)基因的表達(dá)量增加（圖 3）。說明脂肪族硫苷合成相關(guān)基因的表達(dá)受到該病原菌的抑制，吲哚族硫苷合成相關(guān)基因的表達(dá)受到誘導(dǎo)。

在真菌脅迫數(shù)據(jù)中，僅木霉菌（Trichoderma spp，AT50）能夠同時(shí)誘導(dǎo)脂肪族和吲哚族硫苷合成相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)，其他真菌脅迫下脂肪族和吲哚族硫苷合成相關(guān)基因的表達(dá)模式通常相反（圖 3）。例如，當(dāng)植株受到灰霉病菌（Botrytis cinerea）、甘藍(lán)鏈格孢菌（Alternaria brassicicola）和白粉菌（Erysiphe orontii）（AT51）侵染后，多數(shù)脂肪族硫苷合成相關(guān)基因的表達(dá)受到抑制，而吲哚族硫苷合成和降解相關(guān)基因的表達(dá)受到誘導(dǎo)。相似地，疫霉菌（Phytophthora）侵染擬南芥葉片后，吲哚族硫苷合成相關(guān)基因的表達(dá)量迅速增加，脂肪族硫苷合成相關(guān)基因的表達(dá)量則較低。但隨著浸染時(shí)間的增加，吲哚族硫苷合成相關(guān)基因的表達(dá)量隨之下降，而脂肪族硫苷合成相關(guān)基因的表達(dá)量則上升。此外，發(fā)現(xiàn)部分脂肪族和多數(shù)吲哚族硫苷合成相關(guān)基因的表達(dá)還受到殼聚糖的誘導(dǎo)（AT84）。以上結(jié)果表明，吲哚族硫苷合成相關(guān)基因的表達(dá)更容易受到病原菌的誘導(dǎo)。

通過對(duì)多組抗蟲芯片數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn)，脂肪族硫苷合成和降解相關(guān)基因的表達(dá)受到菜青蟲的脅迫誘導(dǎo)，而吲哚族硫苷合成和降解相關(guān)基因的表達(dá)明顯受到西花薊馬、桃蚜（Myzus persicae，AT49）和粉虱（AT63）的脅迫誘導(dǎo)（圖3）。說明不同硫苷組分的抗蟲害作用可能不同，其中吲哚族硫苷可能對(duì)粉虱、西花薊馬和桃蚜有一定的防御作用。此外，本研究發(fā)現(xiàn)水楊酸（salicylic acid，SA）能夠誘導(dǎo)吲哚硫苷合成途徑大部分基因高表達(dá)（圖 3），說明吲哚族硫苷在植物防御系統(tǒng)中的作用依賴SA信號(hào)途徑。

圖2　硫苷合成相關(guān)基因在擬南芥中的表達(dá)模式Fig. 2 Expression patterns analyses of glucosinolate biosynthesis genes in Arabidopsis by qPCR

圖3　擬南芥硫苷生物合成基因受病、蟲害脅迫誘導(dǎo)的表達(dá)譜Fig. 3 The expression profiles of Arabidopsis glucosinolates biosynthesis genes induced by pathogen and insect stresses

2.3硫苷生物合成相關(guān)基因受非生物脅迫誘導(dǎo)的表達(dá)譜

如圖4所示，脂肪族硫苷合成相關(guān)基因主要在地上組織中表達(dá)，吲哚族硫苷合成相關(guān)基因主要在根中表達(dá)，僅有少數(shù)基因在懸浮細(xì)胞中表達(dá)，說明硫苷主要在地上和地下組織中合成。而且大部分上游基因（包括吲哚族和脂肪族）在地上組織和根中的表達(dá)受到多種非生物環(huán)境因子的脅迫誘導(dǎo)。例如，脂肪族硫苷合成上游基因BCAT4、LeuD1、LeuD2、BAT5、ST5b、GSTF11和IPMDH3在地上組織和根中的表達(dá)均受到低溫（4℃）、滲透脅迫、高鹽、UV-B和高溫（38℃）的抑制，但是受到干旱和傷害的誘導(dǎo)而上升，說明這些環(huán)境因子對(duì)脂肪族硫苷的合成有影響。同理，UGT74B1、GSTF9、CYP79B2、CYP79B3、CYP81B1等基因在地上組織中的表達(dá)量較低，但是在根中的表達(dá)量相對(duì)較高且明顯受到低溫、高鹽、滲透脅迫和高溫的抑制，證明吲哚族硫苷的合成受到這些非生物因子的脅迫誘導(dǎo)。

但是，次級(jí)修飾和降解相關(guān)基因沒有明顯受到上述非生物脅迫因子的誘導(dǎo)表達(dá)（圖 4）。其中，脂肪族硫苷次級(jí)修飾相關(guān)基因（FMOGS-OX1和FMOGS-OX1-3）在地上組織中有較高的表達(dá)水平，而吲哚族硫苷次級(jí)修飾相關(guān)基因（CYP81F1-4、IGMT1 和IGMT1）在根中有較高的表達(dá)水平。同理，硫苷降解酶基因（TGG2、TGG4、PEN2和MBP1）和調(diào)控基因（MYB29、MYB76、MYB51、MYB122和bHLH05）在地上組織和根中也具有相對(duì)較高的表達(dá)量（圖4）。以上結(jié)果進(jìn)一步證明脂肪族和吲哚族硫苷可能分別在地上和地下組織中合成，并與相應(yīng)的黑芥子酶基因組成一個(gè)緊密的防御體系，通過響應(yīng)相關(guān)因子的脅迫信號(hào)來調(diào)控硫苷的合成以抵御植株受到的非生物逆境脅迫。

2.4硫苷生物合成相關(guān)基因受激素誘導(dǎo)的表達(dá)模式

如圖 5所示，經(jīng)過吲哚乙酸（IAA）和脫落酸（ABA）處理3 h后硫苷合成相關(guān)基因的表達(dá)量明顯降低，說明它們對(duì)硫苷合成可能具有抑制作用。經(jīng)過生長素極性運(yùn)輸抑制劑（2，4，6T、PCIB、TIBA 和NPA）處理后，大部分硫苷合成相關(guān)基因的表達(dá)量無明顯變化，說明生長素在低水平時(shí)對(duì)硫苷合成沒有影響，但是積累到較高濃度時(shí)則會(huì)抑制硫苷的合成。經(jīng)過油菜素內(nèi)酯（brassinolide，BL）、乙烯合成酶 （1-aminocycropro-pane-1-carboxylic acid，ACC）、玉米素（zeatin）、GA和茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MJ）處理后，脂肪族硫苷合成相關(guān)基因的表達(dá)量沒有明顯的變化，少數(shù)吲哚族硫苷合成相關(guān)基因的表達(dá)量增加，表明這些激素對(duì)硫苷生物合成的影響相對(duì)較低。但是經(jīng)過乙烯抑制因子AgNO3處理后，部分吲哚族硫苷合成相關(guān)基因（例如 ST5a、UGT74B1、ASA1、CYP81F2、MYB51和MYB122）的表達(dá)量明顯增加，表明內(nèi)源性乙烯可能對(duì)吲哚族硫苷的合成具有調(diào)控作用。GA和BR抑制因子對(duì)硫苷合成相關(guān)基因的表達(dá)沒有明顯的影響，并且GA和BR信號(hào)通路關(guān)鍵突變體gal-3、gal-5和det2-1中硫苷合成相關(guān)基因的表達(dá)量也無明顯變化（圖 5），說明這兩種激素對(duì)硫苷的生物合成沒有影響。

此外，大多數(shù)脂肪族硫苷合成相關(guān)基因在植株缺硫24 h后表達(dá)量明顯降低，而吲哚族硫苷合成相關(guān)基因的表達(dá)量無明顯的變化，說明硫?qū)χ咀辶蜍盏纳锖铣删哂兄匾淖饔茫▓D 5）。還發(fā)現(xiàn)部分硫苷合成相關(guān)基因（例如CYP79B2、MYB51和TGG2）在22℃時(shí)的表達(dá)水平比 4℃時(shí)高，說明溫度對(duì)硫苷的生物合成也有影響（圖5）。

2.5硫苷生物合成途徑的互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

脂肪族和吲哚族硫苷代謝支路內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)模式相關(guān)性較高（圖6）。MYB28轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)模式與 CYP79F1、CYP79F2、FMOG-OX3和UGT74C1酶基因的表達(dá)模式相關(guān)性較高，說明它們可能是 MYB28調(diào)控的下游靶基因。同理，MYB29與FMOG-OX1和AOP2的表達(dá)模式也非常相似，說明它們可能為MYB29的共調(diào)控基因。以上結(jié)果進(jìn)一步證明MYB轉(zhuǎn)錄因子對(duì)硫苷生物合成具有重要的調(diào)控作用，且存在共調(diào)控機(jī)制。

3 討論

圖4　硫苷生物合成相關(guān)基因受非生物脅迫誘導(dǎo)的表達(dá)情況Fig. 4 Expression patterns of Arabidopsis glucosinolate genes under abiotic stresses

圖5　硫苷生物合成相關(guān)基因受激素誘導(dǎo)的表達(dá)情況Fig. 5 Expression analysis of Arabidopsis glucosinolate biosynthetic genes under hormone inductions

硫苷廣泛分布于十字花科植物的不同組織中，同一植物不同組織、不同生育期硫苷的組分和含量差異很大，具有動(dòng)態(tài)變化的特征。通常，種子中硫苷的含量明顯高于其他組織和器官。例如，甘藍(lán)型油菜種子中硫苷的含量高達(dá)180 μmol·g-1，而葉片中硫苷的含量一般只有10—20 μmol·g-1［33］。但是種子自身合成硫苷的量卻較少，說明植物體內(nèi)存在一個(gè)將“源”組織和器官中合成的硫苷運(yùn)輸?shù)健皫臁保ǚN子）中的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。該轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)最近已經(jīng)得到試驗(yàn)證實(shí)［34-36］。本研究基于大量芯片數(shù)據(jù)，系統(tǒng)分析了硫苷合成、降解、調(diào)控等82個(gè)相關(guān)基因在擬南芥79個(gè)不同發(fā)育時(shí)期和組織中的時(shí)空表達(dá)特性（圖 1）。結(jié)果顯示硫苷合成相關(guān)基因在營養(yǎng)器官中高表達(dá)，在貯藏器官中低表達(dá)，證實(shí)了植物體內(nèi)確實(shí)存在一個(gè)硫苷的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，負(fù)責(zé)將營養(yǎng)組織中合成的硫苷轉(zhuǎn)運(yùn)到種子組織中積累。此外，硫苷代謝途徑中同源基因的表達(dá)模式相似，但有一定的差別，說明同源基因間存在部分功能冗余。

圖6　擬南芥硫苷生物合成途徑相關(guān)基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)Fig. 6 The connection network of Arabidopsis glucosinolate biosynthesis genes

前人研究證明，R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子對(duì)吲哚族和脂肪族硫苷的生物合成具有重要的調(diào)控作用［14-16］。在擬南芥中有6個(gè)2R-MYB基因參與調(diào)控硫苷的生物合成（MYB28、MYB29、MYB34、MYB51、MYB76和 MYB122）。其中，MYB28、MYB29和MYB67調(diào)控脂肪族硫苷的生物合成，MYB28為主效基因［37-38］；而MYB34、MYB51和MYB122調(diào)控吲哚族硫苷的生物合成，MYB34為主效基因［16，39］。本研究表達(dá)譜分析結(jié)果表明，脂肪族硫苷合成的MYB調(diào)控基因和酶基因主要在地上部分營養(yǎng)組織中表達(dá)，而吲哚族硫苷合成的MYB調(diào)控基因和酶基因在地下和地上部分營養(yǎng)組織中均有表達(dá)（圖1）。共表達(dá)分析結(jié)果表明，MYB調(diào)控基因與硫苷合成途徑酶基因的表達(dá)模式相關(guān)性較高（圖6）。例如，MYB28與CYP79F1、FMOG-OX3、UGT74C1和CYP79F1酶基因的表達(dá)模式相關(guān)性較高，說明它們可能是 MYB28調(diào)控的下游靶基因。其中，CYP79F1和CYP79F2已經(jīng)被證明是MYB28的靶基因［15］，證明本研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。以上結(jié)果表明，調(diào)控基因和結(jié)構(gòu)基因共同組成了一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，實(shí)現(xiàn)對(duì)硫苷生物合成的精細(xì)調(diào)控。

硫苷作為十字花科植物特有的一類次生代謝產(chǎn)物，其降解產(chǎn)物具有多種生化活性，對(duì)植物的防御系統(tǒng)和動(dòng)物的健康均非常重要［2-7］。在生產(chǎn)中，硫苷及其降解產(chǎn)物具有雙重作用。例如在油菜生產(chǎn)中，一方面硫苷的降解產(chǎn)物是菜籽餅粕中主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子，嚴(yán)重影響其作為動(dòng)物飼料的食用安全性和適口性，限制了菜籽餅粕蛋白質(zhì)資源的開發(fā)利用，同時(shí)也不利于油菜作為飼草或油-菜兼用的開發(fā)應(yīng)用。另一方面，硫苷又對(duì)油菜的抗性和營養(yǎng)保健功能有重要作用，具有較強(qiáng)的防腐和抗菌作用，可作為殺蟲劑、殺菌劑、抗微生物制劑和天然的生物熏蒸消毒劑等［40-42］。在植物的防御體系中完整的硫苷并不具有生物學(xué)活性，介導(dǎo)植物與昆蟲互作的主要是經(jīng)黑芥子酶水解的硫苷降解物，二者構(gòu)成了熟知的“芥子油彈（mustard oil bomb）”，在植物防御系統(tǒng)中起重要作用［43］。本研究通過分析擬南芥中硫苷合成相關(guān)基因在不同組織和時(shí)期、不同生物和非生物脅迫下的表達(dá)特性，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)情況下硫苷降解和合成相關(guān)基因的表達(dá)模式相似（圖1），它們共同組成了一個(gè)緊密的生物防御體系，以抵御植株可能受到的逆境脅迫。硫苷降解相關(guān)基因在不同組織和時(shí)期、不同生物和非生物脅迫下的表達(dá)譜存在明顯的差異，表明降解酶基因受不同脅迫因子的誘導(dǎo)，進(jìn)而產(chǎn)生相應(yīng)的硫苷降解產(chǎn)物以抵御各種逆境脅迫。其中，吲哚族硫苷合成相關(guān)基因更易受病、蟲害的脅迫誘導(dǎo)表達(dá)（圖 3），推測(cè)該類物質(zhì)是擬南芥中主要的化學(xué)防御物質(zhì)，對(duì)其防御系統(tǒng)有重要的作用。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，部分基因的表達(dá)受到生物和非生物脅迫因子的共同誘導(dǎo)，例如脂肪族硫苷合成相關(guān)基因BCAT4、LeuD1、BAT5和吲哚族硫苷合成相關(guān)基因UGT74B1、CYP79B2、CYP81B1等同時(shí)受到生物和非生物的脅迫誘導(dǎo)表達(dá)（圖3和圖4）。

基因的表達(dá)模式對(duì)推斷基因功能、基因間互作等具有重要的作用。雖然因?yàn)檗D(zhuǎn)錄后修飾等機(jī)制，導(dǎo)致基因的轉(zhuǎn)錄水平與其蛋白水平可能不完全一致，但是表達(dá)譜是基因表達(dá)為相應(yīng)蛋白、行使其生物學(xué)功能的重要前提，可以為揭示基因的時(shí)空表達(dá)規(guī)律和功能提供重要的線索。本研究結(jié)果為進(jìn)一步在蛋白水平揭示硫苷的合成和積累規(guī)律，并在具有重要農(nóng)藝性狀的十字花科作物中開展相關(guān)研究提供了重要的參考。

4 結(jié)論

對(duì)擬南芥硫苷生物合成途徑 82個(gè)結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因的組織和生物及非生物脅迫誘導(dǎo)的表達(dá)譜進(jìn)行系統(tǒng)的分析表明，硫苷合成相關(guān)基因主要在營養(yǎng)組織中高表達(dá)、在生殖器官中低表達(dá)。吲哚族硫苷生物合成相關(guān)基因的表達(dá)容易受到病原菌、蟲害、高溫等逆境脅迫的影響，并且硫苷合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)模式具有較高的相關(guān)性。

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2.1 身體動(dòng)作的呈現(xiàn)形式豐富成套動(dòng)作層次感 動(dòng)作軌跡，即指在做動(dòng)作時(shí)，身體或身體某部分所移動(dòng)的路線。包括：軌跡形狀（直線、曲線、弧線等）、軌跡方向（前后、左右、上下等6個(gè)基本方向及各種旋轉(zhuǎn)與環(huán)繞等）和軌跡幅度（長度、角度）[2]。運(yùn)動(dòng)員的運(yùn)動(dòng)軌跡與方向的多變將直接在視覺上留給裁判和觀眾第一印象，其必須以變化多樣且完整的方式利用整個(gè)地面區(qū)域，并創(chuàng)造出不同的模式[3]。

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（責(zé)任編輯 李莉）

Genome-Wide Expression Analysis of Glucosinolate Biosynthetic Genes in Arabidopsis Across Diverse
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DU Hai， RAN Feng， LIU Jing， WEN Jing， MA Shan-shan， KE Yun-zhuo， SUN Li-ping， LI Jia-na
（College of Agronomy and Biotechnology， Southwest University， Chongqing 400715）

【Objective】The aim of this study is to analyze the expression profiles of Arabidopsis glucosinolate biosynthetic genes in different tissues at different developmental stages and under various stress treatments， so as to facilitate the identification ofthe key genes involved in controlling glucosinolate biosynthesis and provide valuable information for exploring the metabolic mechanism of glucosinolate biosynthesis as well as their functions in plant defenses. 【Method】 The dynamic expression profiles of 82 glucosinolate biosynthetic structural genes and regulating genes across a wide range of developmental stages and biotic and abiotic stresses were examined， based on ten expression microarray data and two RNA-Seq data in PLEXdb and AtGenExpress database. The expression patterns of ten key structural genes and regulating genes involved in glucosinolate biosynthesis pathway were further confirmed by Real-time PCR method. The correlation of the expression patterns of glucosinolate biosynthesis related genes was analyzed by STRING v10 software. 【Result】 The expressions of candidate genes between vegetative and reproductive organs were significantly different， with the majority of the candidate genes have higher expression levels in vegetative organs and lower expression levels in reproductive organs， indicating glucosinolates were mainly synthesized in vegetative tissues. The aliphatic glucosinolate biosynthesis genes were preferential expressed in shoot， such as stems and leaves， while indolic glucosinolate related genes were highly expressed in both of root and shoot， such as roots， stems and leaves. Moreover， the expressions of genes in a given tissue at different developmental stages were generally distinct， implying a temporal and spatial expression pattern. Real-time PCR analyses revealed that the expression profiles of the ten representive glucosinolate biosynthetic genes kept consistent with the results of microarray data assay. Furthermore， the expressions of aliphatic and indolic glucosinolate biosynthesis genes were tend to be induced by many bio- and abio-stresses， whereas indolic glucosinolate biosynthesis related genes were obviously induced by bio- and abio-stresses， such as Pseudomonas syringae， Alternaria brassicicola， Myzus persicae， low temperature （4℃）， salt and high temperature （38℃）. In addition， co-expression analysis revealed that the expressions of regulating genes were highly correlated to those of metabolic genes in aliphatic or indolic glucosinolate biosynthesis pathway. 【Conclusion】 The glucosinolates biosynthesis genes were preferentially expressed in vegetative tissues， as compared to seed tissues. There is a transport system that is responsible for transporting glucosinolates that were synthesized in vegetative tissues to seed tissues. The expressions of indolic glucosinolate biosynthesis genes tend to be induced by bio- and abio-stresses， indicating indolic glucosinolates are more important for Arabidopsis defense.

Arabidopsis thaliana； glucosinolates； expression patterns； development stage； biotic stresses； abiotic stresses； realtime PCR

2016-03-09；接受日期：2016-05-20

國家自然科學(xué)基金（31471528）、國家“973”項(xiàng)目（2015CB150201）、國家博士后基金面上項(xiàng)目（2014M552297）、中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（SWU113104，XDJK2014B035和2362015xk05）、國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（201510635026，201610635019）

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