棉籽蛋白酶解物的制備及其抗菌活性

韓曉燕，包郁明，辛鳳姣，孔志強，Christophe Blecker，戴小楓

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，中國北京 100193；2烈日大學(xué)食品學(xué)院，比利時）

棉籽蛋白酶解物的制備及其抗菌活性

韓曉燕1，包郁明1，辛鳳姣1，孔志強1，Christophe Blecker2，戴小楓1

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，中國北京 100193；2烈日大學(xué)食品學(xué)院，比利時）

【目的】通過體外模擬動物胃腸道消化環(huán)境，對兩種棉籽蛋白的酶解產(chǎn)物抗菌活性進(jìn)行研究，為棉籽蛋白精深加工、高值化利用提供理論依據(jù)。【方法】以棉籽粕為原料，用Osborne法和傳統(tǒng)的堿溶酸沉法分別制備棉籽蛋白（清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白及谷蛋白）和棉籽分離蛋白（cottonseed protein isolate，CPI），用凱氏定氮法測定所得棉籽蛋白的蛋白含量，Tricine-SDS-PAGE測定蛋白亞基組成，通過掃描電鏡觀察蛋白的表面微觀結(jié)構(gòu)，選取蛋白含量較高的球蛋白（cottonseed globulin，CPG）和CPI進(jìn)行研究。通過體外模擬動物胃腸道消化環(huán)境，用胃蛋白酶和胰蛋白酶依次對CPG和CPI進(jìn)行酶解；以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為受試菌，分別以抗生素卡那霉素（Kanamycin，Kan）及未經(jīng)酶解的蛋白溶液為對照，研究棉籽蛋白酶解產(chǎn)物的抗菌活性，同時用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測酶解產(chǎn)物中小肽的分子量大小及分布。【結(jié)果】堿溶酸沉法的提取率為（70.52±2.40）%，所得CPI的蛋白含量為（89.53±0.66）%；用Osborne法分別得到清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白等4種棉籽蛋白，提取率為（67.55±1.16）%，其中CPG的蛋白含量最高為（82.57±1.02）%。Tricine-SDS-PAGE圖譜表明CPG的亞基組成與CPI較接近；掃描電鏡觀察到的蛋白表面微觀結(jié)構(gòu)差別較大，CPI為顆粒大小較均勻整齊的蜂窩狀結(jié)構(gòu)，CPG由大小不均一的蛋白顆粒構(gòu)成；相對于CPI，CPG中氨基酸保留較為完全。相同加酶量處理情況下，CPI的水解度高于CPG，且棉籽分離蛋白的小分子肽段（MW ≤0.8 kDa）含量（70%—85%）顯著高于棉籽球蛋白（40%—60%）?？咕钚詸z測結(jié)果表明，當(dāng)胃蛋白酶-胰蛋白酶加酶量為5 000—5 000 U時，兩種蛋白酶解產(chǎn)物的抗菌能力最強，此時CPI和CPG的水解度分別為（24.72±1.07）%和（19.26±0.39）%，二者酶解產(chǎn)物對大腸桿菌的抑制能力均高于對金黃色葡萄球菌的抑制能力；CPI酶解產(chǎn)物的抗菌活性比CPG高，兩者未經(jīng)消化的蛋白溶液均無抗菌能力。通過分子量測定結(jié)果分析得到CPI酶解產(chǎn)物的抗菌活性物質(zhì)的分子量在0.57—0.75 kDa，而CPG分子量分布在0.66—0.78 kDa?！窘Y(jié)論】兩種方法制備的蛋白在提取率方面沒有顯著差異（P＞0.05），在亞基組成方面，Osborne法分級的蛋白間差異較大，但CPG和CPI組成較為相似；二者經(jīng)體外模擬消化后的酶解產(chǎn)物均具有一定的抗菌活性，CPI酶解產(chǎn)物的抗菌活性高于CPG。

棉籽分離蛋白；棉籽球蛋白；體外模擬消化；抗菌活性肽；分子量分布

0 引言

【研究意義】中國是產(chǎn)棉大國，近年來產(chǎn)量居世界首位（國家數(shù)據(jù)）。棉籽（年產(chǎn)量約800萬—900萬t）是棉花的主要副產(chǎn)物，其基本組成中蛋白含量較高，占棉籽仁的35%—48%［1］，且棉籽蛋白的氨基酸（除蛋氨酸稍低外）配比合理，必須氨基酸含量均達(dá)到聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織（FAO/WHO）推薦標(biāo)準(zhǔn)［2］，因此，棉籽蛋白是非常重要的植物蛋白資源。在中國，棉籽蛋白多用于肥料或粗飼料，國外棉籽蛋白也多為飼用，少部分作為食品添加劑用于食品行業(yè)［3］，近年來，植物蛋白短缺嚴(yán)重，因此，棉籽蛋白的高值化利用問題亟待解決。酶解制備生物活性肽是棉籽蛋白精深加工、高值化利用的重要方面?？咕钚噪木哂邢鄬Ψ肿淤|(zhì)量小、殺菌廣譜、抗菌活性高等特點［4］，作為抗菌藥物，抗菌肽具有無毒副作用、無殘留污染等優(yōu)點，相對于傳統(tǒng)抗生素，不易產(chǎn)生抗藥性［5-6］。抗菌肽的安全性及廣譜性使其有望成為一種新的抗菌劑應(yīng)用于食品及醫(yī)藥行業(yè)，因此，對棉籽蛋白酶解物抗菌活性方面的研究具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】傳統(tǒng)的棉籽蛋白提取方法為堿溶酸沉法［7-8］，該法因所得蛋白純度高而用于棉籽分離蛋白（cottonseed protein isolate，CPI）的制備。Osborne法可制備出性質(zhì)優(yōu)良的蛋白質(zhì)，且提取條件溫和，剩余殘渣可分級利用，已見于谷物［9-10］及其他油料蛋白［11］的提取，但在棉籽蛋白提取過程中未見報道。目前蛋白質(zhì)高值化利用的研究熱點是生物活性肽的制備［12］，已有研究表明，棉籽蛋白水解后得到的棉籽肽具有抗氧化活性［13-15］或ACE抑制活性［16］，而在抗菌活性方面鮮有涉及?！颈狙芯壳腥朦c】目前，棉籽蛋白提取方法多為堿溶酸沉法，Osborne法卻未見報道，其提取效果如何仍不清楚；棉籽蛋白酶解物的生物活性研究多集中在抗氧化活性等方面，是否有抗菌活性仍是未知。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究通過傳統(tǒng)方法和Osborne法制備棉籽蛋白，進(jìn)一步對其在體外模擬消化環(huán)境下的抑菌活性進(jìn)行研究，旨在對棉籽蛋白的精深加工與應(yīng)用提供理論依據(jù)，對提高棉籽附加值，開發(fā)棉花副產(chǎn)物綜合利用提供參考。

1 材料與方法

試驗于2014年11月至2015年10月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所（農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室）進(jìn)行。

1.1試驗材料

棉籽粕，北京銀天使國際貿(mào)易有限公司；本研究所用棉籽粕中蛋白質(zhì)含量為（45.85±0.26）%，棉酚含量為（190.37±0.14）mg·kg-1，水分含量為（7.03±0.02）%，灰分含量為（5.09±0.02）%，脂肪含量為（0.87±0.53）%；金黃色葡萄球菌，中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心；大腸桿菌，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所棉花病害防治實驗室；二硫蘇糖醇（DTT）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、絲氨酸、鄰苯二甲醛（OPA）、抑肽酶、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Arg-Gly、細(xì)胞色素C、維生素B12、三氟乙酸（TFA，色譜純）、胃蛋白酶、胰蛋白酶，Sigma公司；氯化鈉（NaCl）、無水乙醇、氫氧化鈉（NaOH）、鹽酸（HCl）等試劑均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂糖，瑞爾新德生物有限公司；蛋白胨、牛肉提取物、胰蛋白胨、酵母浸粉，Oxoid公司。

LB培養(yǎng)基：酵母浸粉1.0%，胰蛋白胨0.5%，NaCl 1.0%，瓊脂糖1.5%（液體培養(yǎng)基中不添加），121℃高壓蒸汽滅菌20 min；營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基：蛋白胨1.0%，牛肉提取物0.3%，NaCl 1.0%，瓊脂糖1.5%（液體培養(yǎng)基中不添加），121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2儀器設(shè)備

AUW220電子天平：日本島津公司，ZHWY-200B型恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司，SPX-100B-Z型生化培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，ChameleonV型酶標(biāo)儀：芬蘭Hidex公司，Evolution 260型紫外分光光度計：美國Thermo Fisher公司，Alpha 1-4 LDplus型冷凍干燥機(jī)：德國CHRIST公司，IB-5型離子濺射鍍膜儀：日本Eiko公司，S-3400N型電子掃描電鏡、CR22GⅡ型高速冷凍離心機(jī)、L-8900型全自動氨基酸分析儀：日本日立公司，ZHGHC1112B型超凈工作臺：上海智城分析儀器制造有限公司，GI80TW型滅菌鍋：美國ZEALWAY公司，DK-8D型電熱恒溫水浴槽：上海一恒科技有限公司，Agilent 1200型高效液相色譜儀：美國Agilent公司。

1.3試驗方法

1.3.1棉籽蛋白的制備

1.3.1.1棉籽分離蛋白制備 參考堿溶酸沉法［17］制備棉籽分離蛋白（CPI），試驗流程如下：

棉粕粉碎過80目篩→堿溶（pH 10.0，40℃，振蕩2.5 h）→離心（4 000 r/min，20 min）取上清→等電點（pI 4.8）酸沉（4℃靜置2 h使蛋白充分沉淀）→離心（4 000 r/min，20 min）得沉淀→水洗沉淀兩次→冷凍干燥→CPI。

1.3.1.2Osborne法分級制備棉籽蛋白 采用Osborne法［18］分級制備棉籽清蛋白、球蛋白（cottonseed globulin，CPG）、醇溶蛋白及谷蛋白。具體提取流程如圖1。

1.3.2蛋白含量、表面微觀結(jié)構(gòu)及亞基組成

1.3.2.1蛋白含量測定 根據(jù)GB5009.5—2010凱氏定氮法測定原料及所得蛋白質(zhì)的蛋白含量，其中蛋白質(zhì)換算系數(shù)取5.43，并按如下公式計算蛋白提取率：

1.3.2.2棉籽蛋白表面微觀結(jié)構(gòu) 取少量蛋白樣品，均勻鋪開，用雙面膠粘在電鏡進(jìn)樣臺上，真空條件下，對樣品進(jìn)行噴金處理，并保持樣品干燥，以便觀察。調(diào)節(jié)掃描電鏡至3 000及8 000倍數(shù)下，觀察同一視野內(nèi)蛋白的表面微觀結(jié)構(gòu)［19］。

1.3.2.3Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳 參考周乃繼［20］的方法并作相應(yīng)修改，采用 4%的濃縮膠和 12%的分離膠對制備的棉籽分離蛋白、清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白及谷蛋白質(zhì)進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE電泳分析，濃縮膠電壓為60 V，分離膠電壓為100 V；分離完成后用蛋白凝膠染色液InstantBlue染色30 min，用蒸餾水漂洗干凈即可采集蛋白凝膠圖像。

圖1　Osborne法分級提取棉籽清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白及谷蛋白工藝流程Fig. 1 The flow diagram of Osborne extraction of protein fractions from cottonseed meal

1.3.3氨基酸含量測定 參考顏靜等［21］的方法，準(zhǔn)確稱取蛋白質(zhì)量為60—80 mg的樣品于水解管中，加入10 mL 6 mol·L-1HCl，氮吹1 min使管內(nèi)充滿氮氣，密封，將其放入110℃烘箱內(nèi)水解24 h；冷卻至室溫，過濾到50 mL容量瓶中，用純凈水沖洗水解管2—3次，將沖洗液也一并過濾到容量瓶中，定容至50 mL，混勻；移取1 mL水解液至5 mL氮吹小瓶中，氮吹40 —60 min至干；加入1 mL 0.02 mol·L-1HCl復(fù)溶，混勻，0.45 μm濾膜過濾，用氨基酸自動分析儀進(jìn)行測定。

htot是分析蛋白質(zhì)水解度必不可少的常數(shù)，根據(jù)氨基酸測定結(jié)果可得出棉籽蛋白的總肽鍵數(shù)（htot）值，其計算公式如下：

1.3.4棉籽蛋白模擬體外消化［22］稱取一定量的棉籽蛋白粉，加入蒸餾水配制成 2%的蛋白溶液，37℃恒溫水浴預(yù)熱。用1 mol·L-1HCl調(diào)節(jié)pH至2.0，加入一定量的胃蛋白酶，37℃恒溫振蕩酶解 2 h。用 0.9 mol·L-1NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH至5.3，加入一定量的胰蛋白酶后，用1 mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.6，37℃恒溫振蕩酶解2 h，100℃滅酶10 min。并在酶解過程中每隔30 min取出100 μL消化液，100℃滅酶10 min以終止消化反應(yīng)，測定其水解度。將所得消化液冷凍干燥得到肽粉，作為進(jìn)一步試驗的樣品保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5水解度測定 參考鄰苯二甲醛（orthophthalaldehyde，OPA）法［23］并稍作修改，用酶標(biāo)儀測定消化液的水解度（degree of hydrolysis，DH）。在 96孔透明酶標(biāo)板的不同微孔中分別加入等濃度梯度的絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)液及稀釋 10倍的消化液樣品 30 μL，再向各微孔中添加200 μL OPA試劑（現(xiàn)配現(xiàn)用），混勻，精確反應(yīng)2 min，用酶標(biāo)儀測定340 nm處的吸光值，重復(fù)測定3次。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及吸光度計算樣品的 CSerine-NH2（mmol·L-1），并按下式計算出DH。

式中，Serine NH2：每克蛋白質(zhì)中 Serine NH2含量（mmol·g-1）；N：稀釋倍數(shù)；V：上清液體積（L）；X：樣品質(zhì)量（g）；P：樣品中蛋白含量（%）；常數(shù)α、β分別取1和0.4。

1.3.6抗菌活性測定 濾紙片-瓊脂擴(kuò)散［24］：酶解產(chǎn)物凍干后的肽粉用滅菌水（蒸餾水，121℃高壓滅菌20 min）配成100 mg·mL-1溶液，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，將滅菌的濾紙片浸于其中，備用。

將大腸桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基、將金黃色葡萄球菌接種于營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基中，37℃恒溫?fù)u床過夜培養(yǎng)，用紫外分光光度計在600 nm波長下調(diào)節(jié)菌懸液吸光度值（optical density，OD）至1，即菌落形成單位（colony forming unit，CFU）約為1×108，再稀釋1 000倍，取100 μL菌液均勻涂布于相應(yīng)固體培養(yǎng)基上，待菌液完全滲入培養(yǎng)基后放上不同藥液浸泡后的濾紙片，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18—24 h，觀察是否有抑菌圈形成。

1.3.7蛋白酶解物分子量分布測定 用高效液相色譜法［25］測定抗菌肽的分子量大小，取一定濃度的酶解液及標(biāo)準(zhǔn)品溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)樣，色譜條件如下。

色譜柱：TSK gel G2 000SWXL（7.8 mm×300 mm）；流動相：A（乙腈）∶B（含 0.1% TFA超純水）= 45∶55；檢測波長：220 nm；流速：0.5 mL·min-1；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線所用標(biāo)準(zhǔn)品：細(xì)胞色素C （MW12 384 Da），抑肽酶（MW6 511 Da），維生素B12（MW1 355 Da），甘氨酰-甘氨酰-酪氨酰-精氨酸（MW451 Da），甘氨酰-甘氨酰-甘氨酸（MW189 Da）。配成1 mg·mL-1混合標(biāo)樣，備用。

1.4數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行分析，不同處理組間顯著性分析采用t-雙尾檢驗（平均值的成對二樣本分析），結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1兩種方法提取的蛋白含量和提取率

過篩（80目）棉籽粕含有 45.85%的棉籽蛋白，堿溶酸沉法制備的CPI含量為（89.53±0.66）%，提取率為70.52%；Osborne法分級提取4種蛋白蛋白中，醇溶蛋白含量最低，CPG含量最高，而清蛋白和谷蛋白含量稍低，該方法提取率為67.55%，兩種方法的提取率沒有顯著性差異（P＞0.05）。

表1　兩種方法提取的蛋白含量和提取率Table 1 The protein content and extraction efficiency by these two extraction methods

2.2蛋白的表面微觀結(jié)構(gòu)觀察

掃描電鏡在3 000及8 000倍視野下觀察到5種棉籽蛋白的表面微觀結(jié)構(gòu)如圖2所示，CPI的表面微觀結(jié)構(gòu)為蜂窩狀（圖 2-A）；棉籽清蛋白的表面微觀結(jié)構(gòu)為鱗片狀（圖2-B）；CPG的表面微觀結(jié)構(gòu)為大小不均一的小顆粒組成（圖 2-C）；棉籽醇溶蛋白的微觀結(jié)構(gòu)顯示為顆粒物質(zhì)的組合，結(jié)構(gòu)較松散（圖2-D）；棉籽谷蛋白的表面微觀結(jié)構(gòu)與CPI較接近，均為蜂窩狀結(jié)構(gòu)，但棉籽分離蛋白結(jié)構(gòu)相對松散，且顆粒大小較均勻整齊（圖2-A、E）。

2.3棉籽蛋白的Tricine-SDS-PAGE電泳分析

Tricine-SDS-PAGE電泳圖譜如圖3所示，其中清蛋白分子量在20 kDa左右；谷蛋白分子量多在17 kDa左右；CPG主要由4個亞基組成，其分子量分別為56、 48、20及18 kDa；CPI主要由5個亞基組成，分子量分別為56、48、40、20及18 kDa；醇溶蛋白幾乎沒有電泳條帶。綜上表明，不同的提取方法所得的蛋白質(zhì)含量及亞基組成不同，Osborne法所得的4種蛋白中CPG的蛋白含量最高，且亞基組成與CPI接近，因此，選用CPG和CPI作為蛋白樣品進(jìn)行進(jìn)一步試驗。

2.4氨基酸組成及含量

由表2可知，相對于原料，CPI中異亮氨酸、亮氨酸及賴氨酸含量稍低，而CPG中氨基酸保留較好。DH是檢測蛋白水解程度的重要指標(biāo)，而水解度常數(shù)總肽鍵數(shù)（htot）是計算蛋白水解度必需的常數(shù)。通過測定蛋白質(zhì)的氨基酸組成及含量，可以計算蛋白質(zhì)htot。根據(jù)表2測定結(jié)果計算，CPI水解度常數(shù)htot=7.48，而棉籽粕及CPG的htot=7.55。

圖2　蛋白掃描電鏡圖Fig. 2 SEM micrograph of cottonseed protein

圖3　蛋白電泳圖譜Fig. 3 Protein profiles by Tricine-SDS-PAGE

表2　原料及蛋白中氨基酸測定結(jié)果Table 2 The results of determination of amino acid in cottonseed meal and protein

圖4　棉籽蛋白水解度隨時間變化曲線Fig. 4 The trend of hydrolysis degree of cottonseed protein

2.5蛋白酶解物水解度動態(tài)分析

根據(jù)絲氨酸濃度及相應(yīng)吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=0.556x+0.275（R2= 0.9949）。根據(jù)絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線及各時間段酶解物的吸光值計算出酶解物的相對絲氨酸濃度，從而計算出酶解物的水解度（DH），DH隨時間變化曲線如圖 4所示，胃蛋白酶處理 2 h后，加入胰蛋白酶，DH上升趨勢變大，由此可看出蛋白經(jīng)胃蛋白酶消化，加入胰蛋白酶后，消化率顯著升高。根據(jù)3 000 U、5 000 U及10 000 U處理的CPI 及CPG酶解物的水解度可看出，加酶量增加，水解度增大，且CPI水解度高于相同處理的CPG，說明CPI 較CPG易水解。

2.6蛋白酶解物抗菌活性分析

用濾紙片-瓊脂擴(kuò)散法，分別以Kan和未經(jīng)酶解的蛋白溶液為正負(fù)對照，以抑菌圈大小為指標(biāo)，測定每個處理液的抗菌活性，測定結(jié)果如圖5，與CPI和CPG的蛋白溶液相比，其消化液（I2-2、G2-2）對大腸桿菌都有相對明顯的抑制作用，而對金黃色葡萄球菌抗性相對較差（圖5-C、5-D）；Kan是一種廣譜性的抗生素，對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌都有一定的抗性，通過正對照Kan即可說明該方法的可行性，也能反映酶解產(chǎn)物的抗菌能力。由上述結(jié)果可知，I2-2、G2-2對革蘭氏陰性菌（G-）大腸桿菌的抗性要強于對革蘭氏陽性菌（G+）金黃色葡萄球菌的抗性。

圖5　CPI、CPG酶解產(chǎn)物對大腸桿菌（A、B）和金黃色葡萄球菌（C、D）抑制效果Fig. 5 The inhibition effect of hydrolysates of CPI and CPG respectively on the Escherichia coli （A， B） and Staphylococcus aureus （C， D）

2.7蛋白酶解物分子量測定結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果如圖 6，保留時間與標(biāo)準(zhǔn)品相對分子質(zhì)量的對數(shù)呈很好的相關(guān)性，其回歸方程為：y=-0.3917x+14.082（R2=0.9933），其中，y為分子量（MW）以10為底的對數(shù)（lg MW）。進(jìn)而得出酶解液中肽分子量大小及分布結(jié)果（圖7）。圖7-B所示棉籽球蛋白在加酶量為3 000 U時的酶解物分子量在1.65 kDa以上的肽段約為40%，明顯高于加酶量為5 000 U和10 000 U的酶解物，而10 000 U處理的酶解物中小分子量肽段較多，隨著加酶量的增加，酶解物分子量呈現(xiàn)1.34 kDa以上的肽段含量越來越低，而分子量小于0.78 kDa的肽段含量越來越高。而CPI也有這種趨勢，但沒有球蛋白明顯（圖7-A）。

3 討論

CPI蛋白含量高且Tricine-SDS-PAGE電泳圖譜顯示其亞基組成較為豐富，表明堿溶酸沉法提取總蛋白的效果更好；Osborne法提取條件相對溫和，更有利于維持蛋白的構(gòu)象［10］，且能夠較大程度避免蛋白的氨基酸損失，此方法所得蛋白中，醇溶蛋白含量最低，在Tricine-SDS-PAGE電泳圖譜上沒有顯示，可能是棉籽榨油過程中醇溶蛋白被萃出，醇提時醇溶性物質(zhì)如色素等被提取從而降低了醇溶蛋白的純度。掃描電鏡觀察到5種棉籽蛋白的表面微觀結(jié)構(gòu)特征具有較大差異，棉籽谷蛋白的結(jié)構(gòu)特征與CPI較接近，可能由于兩種蛋白均在堿性條件下提取得到。根據(jù)氨基酸測定結(jié)果計算得到，CPI水解度常數(shù) htot=7.48與林虬等［2］的結(jié)果（htot=7.48）相似，而棉籽粕及CPG的htot=7.55與謝麗蒙等［26］的結(jié)果（htot=7.54）相似，且兩種蛋白質(zhì)CPI和CPG的htot沒有明顯差異。

圖6　分子量校正標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜（A）及分子量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線（B）Fig. 6 HPLC chromatogram of mixed standard （A） and calibration curve of molecular weight measurement （B）

圖7　棉籽分離蛋白（A）和棉籽球蛋白（B）酶解物分子量分布Fig. 7 Molecular weight and content of hydrolysates of cottonseed protein isolate （A） and cottonseed globulin （B）

在體外模擬動物消化的酶解過程中，不同加酶量處理組間，CPI水解度及肽分子量分布的差別沒有CPG明顯，可能是不同制備過程的蛋白結(jié)構(gòu)不同，CPI在制備過程中的堿性環(huán)境導(dǎo)致其變性，易被酶水解，而球蛋白具有一定的蛋白結(jié)構(gòu)，蛋白酶（尤其是胃蛋白酶）不易與其作用位點接觸。蛋白酶的濃度對其水解度及肽分子量分布的影響沒有對CPG的影響大。體外模擬消化所得的酶解物中2-2的抗菌活性較好，但對不同的菌抗菌效果不同，除了菌活力的影響，還可能與革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)不同有關(guān)［27］。

從酶解物的分子量分布可看出，CPI酶解物 2-2 中 0.57—0.75 kDa這一區(qū)間的小肽含量高于 1-1及3-3，而CPG酶解物2-2中則是在0.66—0.78 kDa的小肽含量高于1-1及3-3。由此可推測CPI消化液抗菌活性物質(zhì)分子量應(yīng)在0.57—0.75 kDa，而CPG中抗菌活性物質(zhì)分子量則在0.66—0.78 kDa。至于具體是何種肽具有抗菌活性，其抗菌活性如何作用，還有待于深入研究。

4 結(jié)論

Osborne法制備的4種棉籽蛋白中球蛋白含量最高，其蛋白含量為（82.57±1.02）%，堿溶酸沉法提取得到的棉籽分離蛋白含量為（89.53±0.66）%，Tricine-SDS-PAGE電泳分析，球蛋白亞基組成較接近于棉籽分離蛋白。球蛋白和棉籽分離蛋白經(jīng)體外模擬消化后的產(chǎn)物均能抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長，因此，棉籽蛋白酶解產(chǎn)物具有抗菌活性，通過一定的分離純化方法可從中制備出棉籽抗菌肽。

References

［1］ 周建中， 張暉. 棉籽蛋白的研究進(jìn)展及其在食品中的應(yīng)用. 農(nóng)產(chǎn)品加工（學(xué)刊）， 2014（6）： 53-57. ZHOU J Z， ZHANG H. Research and application of cottonseed protein in food. Academic Periodical of Farm Products Processing，2014（6）： 53-57. （in Chinese）

［2］ 林虬， 黃薇， 宋永康， 姚清華， 蘇德森. 雙酶分步水解法制備棉籽多肽的蛋白酶篩選. 中國糧油學(xué)報， 2012， 27（2）： 76-80. LIU Q， HUANG W， SONG Y K， YAO Q H， SU D S. Selection of proteolytic enzymes to prepare cottonseed peptide by two-stephydrolysis. Journal of the Chinese Cereals and Oils Association， 2012，27（2）： 76-80. （in Chinese）

［3］ ARTHU J C， MELVIN K K. Preparation and properties of cottonseed protein dispersions. Journal of the American Oil Chemists’ Society，1948， 25（3）： 99-102.

［4］ YUAN W， JIN H T， REN Z H， DENG J L， ZUO Z C， WANG Y，DENG H D， DENG Y T. Effects of antibacterial peptide on humoral immunity in weaned piglets. Food and Agricultural Immunology，2015， 26（5）： 682-689.

［5］ SILA A， NEDJAR-ARROUME N， HEDHILI K， CHATAIGNé G，BALTI R， NASRI M， DHULSTER P， BOUGATEF A. Antibacterial peptides from barbel muscle protein hydrolysates： activity against some pathogenic bacteria. LWT-Food Science and Technology， 2014，55（1）： 183-188.

［6］ 李燕， 王嘉榕， 孫紅賓. 抗菌肽的制備和抗菌機(jī)制研究進(jìn)展. 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志， 2015， 32（2）： 465-469. LI Y， WANG J R， SUN H B. Research progress in preparation of antimicrobial peptides and their mechanisms of action. Journal of Biomedical Engineering， 2015， 32（2）： 465-469. （in Chinese）

［7］ ZHANG B N， CUI Y D， YIN G Q， LI X M， ZHOU X X. Alkaline extraction method of cottonseed protein isolate. Modern Applied Science， 2009， 3（3）： 77-82.

［8］ 何旭. 棉籽分離蛋白提取工藝的研究［D］. 鄭州： 河南工業(yè)大學(xué)，2010. HE X. Cottonseed protein isolated extraction technology ［D］. Zhengzhou： Henan University of Technology， 2010. （in Chinese）

［9］ CHATAIFRAGKOU A， PRABHAKUMARI P C， KOSIK O，LOVEQROVE A， SHEWRY P R， Charelampopoulos D. Extractability and characteristics of proteins deriving from wheat DDGS. Food Chemistry， 2016， 198： 12-19.

［10］ WANG C， LI D， XU F， HAO T S， ZHANG M. Comparison of two methods for the extraction of fractionated rice bran protein. Journal of Chemistry， 2014， 2014： 1-10.

［11］ USMAN L A， AMEEN O M， LAWAL A， AWOLOLA G V. Effect of alkaline hydrolysis on the quantity of extractable protein fractions （prolamin， albumin， globulin and glutelin） in Jatropha curcas seed cake. African Journal of Biotechnology， 2009， 8（6）： 6374-6378.

［12］ AGYEI D， DANQUAH M K. Rethinking food-derived bioactive peptides for antimicrobial and immunomodulatory activities. Trends in Food Science and Technology， 2012， 23（2）： 62-69.

［13］ GAO D， CAO Y， LI H. Antioxidant activity of peptide fractions derived from cottonseed protein hydrolysate. Journal of the Science of Food and Agriculture， 2010， 90（11）： 1855-1860.

［14］ SUN H， YAO X， WANG X， WU Y F， LIU Y， TANG J W， FENG J. Chemical composition and in vitro antioxidant property of peptides produced from cottonseed meal by solid-state fermentation. CyTA-Journal of Food， 2015， 13（2）： 264-272.

［15］ BOBOEV A， HASANOV A， YOTOVA L， HASANOV H. Antioxidant activity of peptides obtained from wheat and cottonseed proteins. Bulgarian Journal of Agricultural Science， 2012， 18（1）： 103-111.

［16］ GAO D D， CHANG T， LI H X， CAO Y S. Angiotensin I-converting enzyme inhibitor derived from cottonseed protein hydrolysate. African Journal of Biotechnology， 2010， 9（53）： 8977-8983.

［17］ 趙小龍， 劉大川， 劉曄， 黃鑫， 黃良哲. 棉籽分離蛋白制備工藝研究. 中國油脂， 2014， 39（12）： 31-34. ZHAO X L， LIU D C， LIU Y， HUANG X， HUANG L Z. Preparation of cottonseed protein isolate. China Oils and Fats， 2014， 39（12）：31-34. （in Chinese）

［18］ SUGIMOTO T， TANAKA K， KASAI Z. Improved extraction of rice prolamin. Agricultural and Biological Chemistry， 1986， 50（9）：2409-2411.

［19］ TORO-SIERRA J， SCHUMANN J， KULOZIK U， Impact of spraydrying conditions on the particle size of microparticulated whey protein fractions. Dairy Science and Technology， 2013， 93（4）： 487-503.

［20］ 周乃繼. 棉籽肽飼料開發(fā)與小肽的檢測［D］. 合肥： 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009. ZHOU N J. Exploitation and identification of small peptide from cotton seed meal［D］. Hefei： Anhui Agricultural University， 2009. （in Chinese）

［21］ 顏靜， 劉繼， 熊亞波， 李玉， 秦文. 川明參不同部位主要營養(yǎng)成分及氨基酸組成分析. 食品科學(xué)， 2015， 36（1）： 240-244. YAN J， LIU J， XIONG Y B， LI Y， QIN W. Analysis of nutritional components and amino acid composition of different parts of Chuanmingshen violaceum Sheh et Shan. Food Science， 2015， 36（1）：240-244. （in Chinese）

［22］ 陳倩倩， 佟立濤， 鐘葵， 劉麗婭， 周素梅， 錢海峰. 大米蛋白酶解物的ACE抑制活性研究. 現(xiàn)代食品科技， 2015， 31（3）： 91-96. CHEN Q Q， TONG L T， ZHONG K， LIU L Y， ZHOU S M， QIAN H F. Andiotensin-converting enzyme inhibition by rice protein hydrolysate. Modern Food Science and Technology， 2015， 31（3）： 91-96. （in Chinese）［23］ NIELSEN P M， PETERSEN D， DAMBMANN C. Improved method for determining food protein degree of hydrolysis. Journal of Food Science， 2001， 66（5）： 642-646.

［24］ 王娣， 許暉， 錢時權(quán)， 曹珂珂， 任茂生， 田長城. 麝香草酚對食品常見污染菌的抑菌作用. 食品科學(xué)， 2013， 34（3）： 119-122. WANG D， XU H， QIAN S Q， CAO K K， REN M S， TIAN C C. Antimicrobial activity of thymol against foodborne pathogenic bacteria. Food Science， 2013， 34（3）： 119-122. （in Chinese）

［25］ SU G W， REN J Y， ZHAO M M， SUN D W. Comparison of superdex peptide HR 10/30 column and TSK gel G2000 SWXL column for molecular weight distribution analysis of protein hydrolysates. Food and Bioprocess Technology， 2013， 6（12）： 3620-3626.

［26］ 謝麗蒙， 程凡升， 袁瑾， 樸美子. 食源性蛋白質(zhì)水解度常數(shù) h_（tot）值的測定. 氨基酸和生物資源， 2013， 35（1）： 15-18. XIE L M， CHENG F S， YUAN J， PIAO M Z. Study on the htot value of foodborne protein. Amino Acids and Biotic Resources， 2013， 35（1）：15-18. （in Chinese）

［27］ 王娟娟， 包永波， 王素芳， 林志華. 泥蚶血紅蛋白異源四聚體酶解多肽抗菌活性及其機(jī)理研究. 海洋學(xué)報， 2015， 37（12）： 106-115. WANG J J， BAO Y B， WANG S F， LIN Z H. Antibacterial activity and mechanisms of heterotetramer hemoglobin drrived polypeptide from Tegillarca granosa. Haiyang Xuebao， 2015， 37（12）：106-115. （in Chinese）

（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Preparation and Antimicrobial Activity of Cottonseed Protein Hydrolysate

HAN Xiao-yan1， BAO Yu-ming1， XIN Feng-jiao1， KONG Zhi-qiang1， Christophe Blecker2， DAI Xiao-feng1
（1Institute of Agro-Products Processing Science and Technology， Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of
Agro-Products Processing， Ministry of Agriculture， Beijing 100193， China；2Department of Food Science，University of Liège， Belgium）

【Objective】 In order to provide a theoretical basis and technical support for efficient utilization of cottonseed protein， two methods were used to prepare cottonseed protein， then the isolated proteins were compared and digested in vitro bypepsin and trypsin， lastly the hydrolysates were detected and selected in antibacterial activity. 【Method】 In this paper， cottonseed protein isolate was prepared by the traditional method which is alkali extraction and acid precipitation and Osborne fractionation method. The protein content and molecular weight of the obtained proteins were determined by the Kjeldahl method and Tricine-SDS-PAGE respectively， microstructure of the proteins were examined by scanning electron microscopy. Amino acid composition of cottonseed proteins were analyzed by automatic amino acid analyzer （L-8900）. And then proteins were digested by pepsin and trypsin in vitro in the process of digestination， the degree of hydrolysis （DH） of cottonseed protein isolate （CPI） and cottonseed globulin （CPG） hydrolysates were determined by ortho-phthalaldehyde （OPA）， and then kanamycin （Kan） and protein solution without hydrolysis were used as control to determine the antibacterial activity of protein hydrolysates with Staphylococcus aureus and Escherichia coli bacteria. Meanwhile， the molecular weight distribution of the hydrolysis products were detected by high performance liquid chromatography （HPLC）. 【Result】The extraction rate of CPI by the method of alkali extraction and acid precipitation was （70.52±2.40）% and its protein content reached （89.53±0.66）%. While the albumin， globulin， prolamin and glutelin were classified by Osborne fractionation method， and compared with the other three proteins， cottonseed globulin got the highest protein content that was （82.57±1.02）%. And there was no significant difference （P＞0.05） in protein extraction rate between the two preparation methods for the proteins extraction rate of Osborne fractionation method was （67.55±1.16）%. The Tricine-SDS-PAGE pattern showed that the subunits composition of CPG was more closely to CPI， compared to the other obtained proteins by Osborne fractionation method. The microstructures of the obtained proteins were different from each other. The structure of CPI showed a neat honeycomb structure， which was similar to glutenins’ microstructure， while the CPG showed a uneven granulated one. Amino acid composition analysis indicated that the amino acids of CPG were well maintained by Osborne method， compared to CPI. Cottonseed proteins were hydrolyzed by pepsin and trypsin simulated the digestive system in vitro. The hydrolysis degree of cottonseed protein hydrolysates was determined by microplate reader， and the result showed that the degree of hydrolysis of CPI hydrolysates was higher than CPG at the same amount of added enzyme， which indicated that CPI was easier to be hydrolysed than CPG. The molecular weight of cottonseed protein hydrolysates was measured by HPLC， and the result showed that the content of peptides （MW≤0.8 kDa） of CPI hydrolysates was significantly higher than CPG with the content of 70%-85% and 40%-60%，respectively. Results of antibacterial activity analysis showed that the antibacterial ability of these protein hydrolysates were strongest when the amount of pepsin-trypsin in digestion simulation system was 5 000-5 000 U （2-2）， and the degree of hydrolysis of these protein hydrolysates were （24.72±1.07）% and （19.26±0.39）%， respectively， under such digested conditions， and the ability of both digestions to against E. coli were higher than S. aureus. CPI was higher than CPG in antibacterial activity， while both of the original protein without digestion treatment showed no antibacterial ability. The molecular weight determination results showed that the molecular weight of antibacterial activity peptides of cottonseed protein isolate should be in 0.57-0.75 kDa while cottonseed globulins’ were in 0.66-0.78 kDa.【Conclusion】 There was no significant difference between the two methods in the extracted yield of protein （P＞0.05）， proteins classified by Osborne fractionation method showed an obvious difference in subunit composition， but the CPG and CPI showed a similarity. CPI is easier to be digested compared to the CPG and both of these two proteins’ hydrolysates showed an antibacterial activity， the hydrolysates of CPI is higher than CPGs’ in antibacterial activity.

cottonseed protein isolate； cottonseed globulin； in vitro digestion； antibacterial peptide； molecular weight distribution

2016-02-29；接受日期：2016-05-12

中國-阿根廷食品科學(xué)技術(shù)研究中心（阿根廷）項目

聯(lián)系方式：韓曉燕，E-mail：hanxiaoyan131@126.com。包郁明，E-mail：baoyuming@caas.cn。韓曉燕與包郁明為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者戴小楓，E-mail：daixiaofeng@caas.cn