兔纖維環(huán)細(xì)胞培養(yǎng)及生物學(xué)特性的實(shí)驗(yàn)研究*

白亦光　陳巧玲　馮剛　劉康　肖東琴

(南充市中心醫(yī)院·川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院 1.骨科；2.腫瘤分院；3.組織工程與干細(xì)胞研究所，四川 南充 637000)

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·論著·

兔纖維環(huán)細(xì)胞培養(yǎng)及生物學(xué)特性的實(shí)驗(yàn)研究*

白亦光1陳巧玲2馮剛3劉康3肖東琴3

(南充市中心醫(yī)院·川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院 1.骨科；2.腫瘤分院；3.組織工程與干細(xì)胞研究所，四川 南充 637000)

目的建立兔椎間盤(pán)纖維環(huán)細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。方法采用酶消化法分離兔椎間盤(pán)纖維環(huán)細(xì)胞，進(jìn)行單層培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)在原代培養(yǎng)中使用體積分?jǐn)?shù)為20%FBS的DMEM培養(yǎng)基。倒置相差顯微鏡觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性，通過(guò)甲苯胺藍(lán)染色、免疫細(xì)胞化學(xué)染色和堿性磷酸酶染色等方法對(duì)其細(xì)胞表型進(jìn)行鑒定，MTT法繪制髓核細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。 結(jié)果在相差顯微鏡下，單層培養(yǎng)的椎間盤(pán)纖維環(huán)細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)的梭形或多角形細(xì)胞, 細(xì)胞具有甲苯胺藍(lán)異染性；Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原的表達(dá)陽(yáng)性；細(xì)胞堿性磷酸酶染色陽(yáng)性。結(jié)論采用酶消化法可成功培養(yǎng)兔椎間盤(pán)纖維環(huán)細(xì)胞，生物學(xué)特性鑒定符合纖維環(huán)細(xì)胞特征。

椎間盤(pán)；纖維環(huán)細(xì)胞；生物學(xué)特性；組織工程

椎間盤(pán)退行性變(intervertebral disc degeneration，IDD)是引起下腰痛的主要原因，它可引起一系列疾病如腰椎間盤(pán)突出癥、腰椎管狹窄癥、節(jié)段性腰椎不穩(wěn)和退變性腰椎側(cè)凸等。關(guān)于IDD的病因和病理生理機(jī)制尚未完全明確，一般認(rèn)為主要是椎間盤(pán)細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)(蛋白聚糖和膠原等)的丟失，改變了椎間盤(pán)生物力學(xué)機(jī)制。目前主要治療方法是外科手術(shù)治療，這些方法在解除病變節(jié)段的同時(shí)，又使鄰近節(jié)段發(fā)生退變，還降低了關(guān)聯(lián)運(yùn)動(dòng)階段的靈活性，增加了鄰近節(jié)段的負(fù)擔(dān)。椎間盤(pán)退變必然會(huì)伴隨其細(xì)胞學(xué)的改變，包括一些椎間盤(pán)細(xì)胞基因的異常表達(dá)及細(xì)胞外基質(zhì)成分發(fā)生改變等[1]。其中纖維環(huán)破裂被認(rèn)為是重要的誘發(fā)因素而使纖維環(huán)在臨床和基礎(chǔ)研究中倍受關(guān)注。纖維環(huán)結(jié)構(gòu)位于椎間盤(pán)髓核組織外周，由多層纖維板同心圓排列包繞凝膠狀的髓核組織，其纖維板層結(jié)構(gòu)的完整性對(duì)于維持整個(gè)椎間盤(pán)系統(tǒng)的正常功能具有十分重要的意義[2]。纖維環(huán)細(xì)胞位于膠原纖維束之間，合成和分泌纖維環(huán)細(xì)胞外基質(zhì)，維持正常的纖維環(huán)結(jié)構(gòu)和功能[3]。

本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)體外分離組織塊通過(guò)酶消化培養(yǎng)纖維環(huán)細(xì)胞，并通過(guò)多種細(xì)胞染色及免疫細(xì)胞化學(xué)方法綜合鑒定纖維環(huán)細(xì)胞，從而為體外培養(yǎng)纖維環(huán)細(xì)胞提供一個(gè)新方法，為研究椎間盤(pán)退變機(jī)制的研究提供細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料、儀器CO2孵箱(Thermo公司，美國(guó))，超凈工作臺(tái)(Airtech公司，美國(guó))，倒置相差顯微鏡(Nikon公司，日本)。甲苯胺藍(lán)染液(碧云天公司，中國(guó))，Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒(Chondrex公司，美國(guó))，Ⅰ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)一抗山羊抗兔(Novus-Bio公司，美國(guó))，Ⅰ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)二抗驢抗山羊(Novus-Bio公司，美國(guó))，DAB顯色試劑盒(碧云天公司，中國(guó))，胎牛血清(Hyclone公司，中國(guó))，DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司，中國(guó))，BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒(碧云天公司，中國(guó))。健康2周齡日本大耳白兔4只，體重0.5～1.0 Kg，雌雄不限，由川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2纖維環(huán)細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng)取4只日本大耳白兔，1%戊巴比妥鈉100 mL/Kg靜脈注射過(guò)量麻醉處死；取背部正中切口切開(kāi)皮膚，更換無(wú)菌手套和手術(shù)器械后沿棘突用剪剪開(kāi)兩旁肌肉，沿椎弓根剪斷橫突，盡量剝盡椎旁肌肉和椎間盤(pán)前緣所附著肌肉，無(wú)菌條件下將腰段脊柱整段取出；用含青、鏈霉素0.01 mol/L PBS液沖洗3 遍以上至無(wú)明顯血跡，移入超凈工作臺(tái)，用手術(shù)刀片切斷纖維環(huán)上下椎體，盡可能保留纖維環(huán)；用眼科鑷將膠凍狀椎間盤(pán)髓核組織完整剔除干凈，將環(huán)狀纖維環(huán)結(jié)構(gòu)放入含青、鏈霉素0.01 mol/L PBS液中，用眼科剪將纖維環(huán)剪成1 mm3的小塊，再用PBS 液漂洗2遍，800 r/min×2 min離心，收集沉淀。將沉淀組織放入50mL離心管，先用0.25%胰蛋白酶在37 ℃恒溫水浴箱中加熱消化預(yù)消化15 min，1000 r/min×2 min離心，去上清；然后加入0.2%的Ⅱ型膠原酶，在37 ℃恒溫水浴箱中加熱消化4 h，1000 r/min×5 min離心，收集絮狀沉淀以及未被消化的組織塊，用DMEM沖洗兩遍；再次離心后加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基，之后移至25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換1次液，倒置相差顯微鏡下逐日觀察細(xì)胞情況。

1.3纖維環(huán)細(xì)胞傳代培養(yǎng)原代細(xì)胞培養(yǎng)大約2周，鏡下可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)至近25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶底面積的90%時(shí)進(jìn)行傳代，將培養(yǎng)液倒掉，用0.01 mol/L PBS洗滌細(xì)胞2次，棄掉液體，加入體積分?jǐn)?shù)0.25%的胰蛋白酶(D-Hanks液稀釋)1 mL，晃動(dòng)培養(yǎng)瓶使胰酶與細(xì)胞充分接觸，鏡下觀察消化情況，可見(jiàn)細(xì)胞皺縮、變圓，當(dāng)有細(xì)胞漂浮時(shí)立即用含10% FBS的DMEM的培養(yǎng)液2 mL終止消化，再用移液管輕輕吹打細(xì)胞瓶底部數(shù)次制成細(xì)胞懸液，必要時(shí)再次鏡下觀察以確保細(xì)胞盡可能全部吹離細(xì)胞瓶底部，1000 r/min ×5 min離心棄上清液，加入上述培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液后按1∶2接種于75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶。

1.4纖維環(huán)細(xì)胞的生物學(xué)特性檢測(cè)

1.4.1光鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察將第3代傳代纖維環(huán)細(xì)胞按1×104個(gè)/mL接種至含蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中進(jìn)行細(xì)胞爬片。培養(yǎng)至細(xì)胞基本長(zhǎng)滿(mǎn)單層時(shí)取出蓋玻片，光鏡下觀察細(xì)胞大體形態(tài)。

1.4.2甲苯胺藍(lán)染色將上述細(xì)胞爬片取出進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色。染色步驟：細(xì)胞爬片PBS沖洗后4 多聚甲醛室溫固定30 min，PBS沖洗3次；1 甲苯胺藍(lán)染色10 min，PBS沖洗3次；樹(shù)脂封片光鏡下觀察。

1.4.3細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)將上述細(xì)胞爬片PBS沖洗后4 多聚甲醛室溫固定30 min。Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色步驟：2 牛透明質(zhì)酸酶封閉30 min，3 過(guò)氧化氫封閉10 min，PBS沖洗，添加block buffer室溫30 min，PBS沖洗，添加生物素一抗封閉(1∶250稀釋)4℃過(guò)夜，PBS沖洗，添加生物素二抗(1∶200稀釋)室溫1小時(shí)，PBS沖洗，DAB顯色1h，樹(shù)脂封片倒置顯微鏡下觀察。Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色步驟：2 牛透明質(zhì)酸酶封閉30 min，3 過(guò)氧化氫封閉10 min，PBS沖洗，添加block buffer室溫30 min，PBS沖洗，添加生物素一抗(采用Ⅰ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)一抗，山羊抗兔，1∶250稀釋)4℃過(guò)夜，PBS沖洗，添加二抗(Ⅰ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)二抗，驢抗山羊，1∶200稀釋)室溫1小時(shí)，PBS沖洗，DAB顯色1小時(shí)，樹(shù)脂封片倒置顯微鏡下觀察。

1.4.4堿性磷酸酶檢測(cè)將上述細(xì)胞爬片磷酸鹽緩沖液沖洗3～5遍，4%多聚甲醛固定30 min，蒸餾水沖洗3～5次，用新鮮配制的BCIP/NBT工作液37 ℃孵育1小時(shí)，蒸餾水沖洗3～5次，樹(shù)脂封片后倒置顯微鏡下觀察。

1.5MTT測(cè)定纖維環(huán)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線取原代細(xì)胞用含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基配成單個(gè)細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)1×104個(gè)/mL，以每孔體積200 μL加入96孔培養(yǎng)板中。分別于培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7、8 d，每孔加MTT溶液(5 mg/ mL)20 μL，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，棄上清液，每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min。選擇 490 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔吸光度(OD)值。

2　結(jié)果

2.1光鏡下纖維環(huán)細(xì)胞形態(tài)纖維環(huán)細(xì)胞輪廓清楚，多為長(zhǎng)梭形、多角形、梭形或不規(guī)則形狀，細(xì)胞核為圓形或橢圓形，胞漿內(nèi)可見(jiàn)較多空泡。原代培養(yǎng)時(shí)，倒置顯微鏡下觀察可見(jiàn)培養(yǎng)液中存在大量大小不等的圓形細(xì)胞懸浮，3d后細(xì)胞發(fā)生明顯變化，貼壁細(xì)胞伸出突起逐漸變?yōu)樗笮尾⑶逸^原代細(xì)胞體積增大，少數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)多角形，并開(kāi)始增殖以后細(xì)胞突起相互連接，高倍鏡下可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)豐富，細(xì)胞較大，輪廓清晰，核內(nèi)可見(jiàn)核仁存在。1w左右大部分細(xì)胞貼壁延伸，體積變大，數(shù)目增多，培養(yǎng)基中偶見(jiàn)懸浮死亡細(xì)胞，見(jiàn)圖1。

2.2甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果甲苯胺藍(lán)染色顯示細(xì)胞為梭形或多角形，細(xì)胞核完整，清晰可見(jiàn)，呈卵圓形，均一淡紫色，胞漿基質(zhì)染為深藍(lán)色，見(jiàn)圖2。

2.3纖維環(huán)細(xì)胞堿性磷酸酶表達(dá)細(xì)胞堿性磷酸酶染色陽(yáng)性，胞漿中可見(jiàn)棕黑色顆粒，見(jiàn)圖3。

2.4纖維環(huán)細(xì)胞Ⅰ，Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果兩組免疫細(xì)胞化學(xué)染色均可見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)，胞漿呈棕黃色，而胞核淡染，見(jiàn)圖4。

圖1原代培養(yǎng)兔椎間盤(pán)纖維環(huán)細(xì)胞(×100)

Figure1Primary culture of rabbit annulus fibrosus cells (×100)

圖2纖維環(huán)細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色 (×400)

Figure 2Toluidine blue staining of cultured annulus fibrosus cells

圖3單層培養(yǎng)纖維環(huán)細(xì)胞堿性磷酸酶染色(×400)

Figure3Alkaline phosphatase staining of annulus fibrosus cells cultured in monolayer

圖4纖維環(huán)細(xì)胞Ⅰ型(a)和Ⅱ型(b)膠原免疫組織化學(xué)染色(×200)

Figure4Collagen I and II immunocytochemical staining of cultured annulus fibrosus cells

a:Collagen type Ⅰ;b:Collagen type Ⅱ

圖5纖維環(huán)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

Figure5Growth curve of annulus fibrosus cells

2.5MTT測(cè)定纖維環(huán)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線將各孔每個(gè)時(shí)間點(diǎn)所測(cè)結(jié)果取均數(shù)，繪制的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線與體外細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)觀察的生長(zhǎng)過(guò)程相符，見(jiàn)圖5。

3　討論

椎間盤(pán)是連接兩椎體的緩沖裝置，主要由椎間盤(pán)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成，對(duì)于脊柱的活動(dòng)及保持穩(wěn)定的狀態(tài)起著重要的作用。椎間盤(pán)具有一定的壓縮、伸展和緩沖壓力的功能[4]。隨年齡的增加及各種因素的影響會(huì)逐漸發(fā)生退行性變化。椎間盤(pán)退變的病理改變之一為纖維環(huán)的應(yīng)力損傷，纖維環(huán)微斷裂, 導(dǎo)致髓核組織從纖維環(huán)損傷處突出[5]。退變的早期, 具有

修復(fù)能力的纖維環(huán)細(xì)胞上調(diào)蛋白多糖和其它間質(zhì)中的大分子, 內(nèi)部纖維環(huán)蛋白多糖含量的增加可在一定程度上彌補(bǔ)了早期髓核蛋白多糖的下降[6]。退變的晚期，椎間盤(pán)內(nèi)細(xì)胞含量明顯下降，導(dǎo)致椎間盤(pán)整體力學(xué)功能受損, 椎間盤(pán)內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)成分發(fā)生改變以致終板鈣化和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)受限。 隨纖維環(huán)細(xì)胞的自身修復(fù)能力的下降, 椎間盤(pán)發(fā)生不可逆的退變。

纖維環(huán)主要由纖維環(huán)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成。目前多種實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示纖維環(huán)細(xì)胞是一種纖維環(huán)軟骨細(xì)胞，表達(dá)Ⅱ型膠原和蛋白多糖等成分[6]，但對(duì)于其是否表達(dá)Ⅰ型膠原，學(xué)術(shù)界仍有爭(zhēng)議。有學(xué)者采用Northen blot等方法檢測(cè)培養(yǎng)的兔纖維環(huán)細(xì)胞mRNA 的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Ⅰ型膠原mRNA沒(méi)有表達(dá)或者表達(dá)量極為有限[7]。但是，Gruber等采用免疫組織化學(xué)方法，利用Ⅰ型膠原單克隆或多克隆抗體對(duì)培養(yǎng)的人纖維環(huán)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，則檢測(cè)到Ⅰ型膠原的陽(yáng)性表達(dá)[8]。在本實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果證明與Gruber等的研究結(jié)果一致。造成此種差異的原因可能有多方面的原因：如細(xì)胞培養(yǎng)方式的不同、所用檢測(cè)方法和手段不同、細(xì)胞種屬來(lái)源不同等。不同動(dòng)物纖維環(huán)中Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原的含量和分布存在差異[9]。另外，實(shí)驗(yàn)還對(duì)培養(yǎng)的纖維環(huán)細(xì)胞進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色，該細(xì)胞具有異染性，表明細(xì)胞可以合成分泌蛋白多糖，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]。

有些學(xué)者認(rèn)為含20%FBS的DMEM是椎間盤(pán)細(xì)胞體外培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基[11], 本實(shí)驗(yàn)在培養(yǎng)原代細(xì)胞時(shí)亦采用含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞傳代后使用10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)正常，可見(jiàn)采用此方法既保證了纖維環(huán)細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，又盡可能的節(jié)約資源。有學(xué)者采用Ⅱ型膠原和透明質(zhì)酸酶消化，有的采用膠原酶和蛋白酶消化，上述方法消化時(shí)間較長(zhǎng)。本研究先用0.25%胰蛋白酶預(yù)消化，然后加入0.02%膠原酶消化基質(zhì)，可見(jiàn)到組織塊變?yōu)樾鯛顟腋。瑯尤〉昧己孟Ч?，且操作時(shí)間較短，在三周內(nèi)能夠達(dá)到有效的細(xì)胞量。

4　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用酶消化法成功地分離培養(yǎng)了兔椎間盤(pán)纖維環(huán)細(xì)胞，通過(guò)對(duì)細(xì)胞形態(tài)的觀察、細(xì)胞外基質(zhì)免疫組化等檢測(cè)手段，證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞為纖維環(huán)細(xì)胞。為體外探討椎間盤(pán)退變等疾病的機(jī)制提供了可靠的細(xì)胞培養(yǎng)模型。但隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增多，不可避免的出現(xiàn)了去極化和纖維化改變。因此，如何更好地為體外細(xì)胞培養(yǎng)提供良好的生存環(huán)境以最大限度的保持良好的生長(zhǎng)狀態(tài)將是未來(lái)椎間盤(pán)細(xì)胞體外培養(yǎng)新的研究方向。

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Study of culture of rabbit annulus fibrosus cells and biological feature of annulus fibrosus cells in vitro

BAI Yiguang,CHEN Qiaoling,FENG Gang, et al

(1.DepartmentofOrthopaedic,TheSecondClinicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege·NanchongCentralHospital,Nanchong637000,Sichuan,China;2.DepartmentofOncology,TheSecondClinicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege·NanchongCentralHospital,Nanchong637000,Sichuan,China;3.TissueEngineeringandStemCellInstitute,TheSecondClinicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege·NanchongCentralHospital,Nanchong637000,Sichuan,China)

ObjectiveTo establish the culture system of the annulus fibrosus cells of rabbit in vitro and identify the cell phenotype. MethodsThe annulus fibrosus cells of rabbit were isolated by enzyme digestion and cultured in monolayer. DMEM containing 20% fetal bovine serum was used in the primary culture. The morphology, structure and biological characteristics of cells were detected by an inverted microscope. The cell phenotype was identified by toluidine blue staining, immunocytochemistry and alkaline phosphatase detection. The growth curve was drawn through MTT.Results Under inverted microscope, annulus fibrosus cells were polygonal and spindle-like in monolayer culture. The cells displayed intense toluidine blue metachromasia. The cells showed positive expression of collagen I and II as well as alkaline phosphatase. ConclusionThe enzyme digestion method can be successfully applied to culture of rabbit annulus fibrsus cells which are accordance with the characteristics of annulus fibrsus cells by phenotypic identification.

Intervertebral disc; Annulus fibrosus cells; Biological feature; Tissue engineering

四川省教育廳資助項(xiàng)目(15ZA0216、15ZB0201)；南充市科技支撐項(xiàng)目(14A0017、14A0022)；川北醫(yī)學(xué)院科研發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(CBY14-A-ZD02、CBY15-A-ZD02)

馮剛，教授，本刊副主編，E-mail: genecloner@163.com

R 392.12

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.08.003

2016-04-22； 編輯： 張文秀)