愛羅咳喘寧對COPD穩(wěn)定期大鼠白細(xì)胞介素-6、髓過氧化物酶及肺組織結(jié)構(gòu)的影響※

陳曉輝　尚立芝　謝文英　高妙然　劉　坦　張　靜　趙曉云（河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，鄭州　450046）

愛羅咳喘寧對COPD穩(wěn)定期大鼠白細(xì)胞介素-6、髓過氧化物酶及肺組織結(jié)構(gòu)的影響※

陳曉輝尚立芝*謝文英高妙然劉坦張靜趙曉云
（河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，鄭州450046）

目的 探討愛羅咳喘寧方對慢性阻塞性肺疾病（COPD）的抗炎機(jī)制，觀察愛羅咳喘寧對COPD大鼠模型支氣管肺泡灌洗液和肺勻漿中白細(xì)胞介素-6（IL-6）和髓過氧化物酶（MPO）的影響。方法 制備COPD穩(wěn)定期大鼠模型，隨機(jī)分為正常對照組、病理模型組、急支糖漿組，愛羅咳喘寧高、中、低劑量組。正常組、模型組灌胃蒸餾水（15.52 mL/（kg·d），急支糖漿組愛羅咳喘寧口服液高、中、低劑量組分別灌胃（31.04，15.52，7.75 g/（kg·d），連續(xù)14 d。酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定各組大鼠BALF和肺組織勻漿中IL-6含量，比色法測定MPO活性。結(jié)果 與正常對照組比較，模型組BALF和肺組織勻漿IL-6和MPO均顯著升高（均P＜0.05）；與模型組相比，愛羅咳喘寧中劑量組IL-6和MPO均顯著降低（均P＜0.05）。結(jié)論 愛羅咳喘寧對COPD有抗炎作用，其機(jī)制可能與減少IL-6的釋放、抑制MPO的活性有關(guān)。

慢性阻塞性肺疾?。话准?xì)胞介素-6；巨噬細(xì)胞；髓過氧化物酶；肺脹；痰飲；動物實(shí)驗(yàn)

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）以慢性非特異性炎癥為主要特征，由多種炎癥細(xì)胞及炎癥介質(zhì)參與且相互作用所致，發(fā)病率和病死率隨著年齡的增長而增加［1］。COPD屬中醫(yī)“痰飲”“咳嗽”等范疇。中醫(yī)認(rèn)為本病肺、脾、腎均虛。本課題組依據(jù)方證相關(guān)理論，自擬愛羅咳喘寧方，兼顧宣肺化痰、止咳平喘、健脾固腎。臨床觀察十多年，發(fā)現(xiàn)愛羅咳喘寧能顯著提高COPD患者肺功能，但其作用機(jī)制有待研究［2-7］。本研究自2012年8月—2015年8月，制備COPD穩(wěn)定期大鼠模型，觀察愛羅咳喘寧對COPD大鼠肺泡灌洗液 （bronchoalveolar lavage fluid，BALF）和肺組織勻漿中白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）含量、髓過氧化物酶 （myeloperoxidase，MPO）活性及肺組織結(jié)構(gòu)的影響，探討愛羅咳喘寧對COPD抗炎的機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 6月齡SD大鼠60只，SPF級，雄雄各半，體質(zhì)量（250±20）g。鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號SCXK（豫）2012-0001。

1.1.2藥物 愛羅咳喘寧方藥組成：炙麻黃6 g（批號1403125），苦杏仁10 g（批號1402001w），姜半夏10 g（批號1404001s），麥芽20 g（批號1312001s），黨參15 g（批號1407002w），白術(shù)12 g（批號1403003s），葶藶子10 g（批號1308001s），蒼術(shù)10 g（批號1405001w）、山藥15 g（批號1405002S）等均為中藥配方顆粒，由三九醫(yī)藥生產(chǎn)。急支糖漿（太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠有限公司，國藥準(zhǔn)字Z500206151，00 ml/瓶，批號141111020571）。1.1.3試劑與儀器 IL-6 ELISA試劑盒 （CK-E30646R）、MPO活性測定試劑盒 （A044）均購于南京建成生物工程有限公司。紅旗渠牌香煙 （河南安陽卷煙廠，烤煙型，尼古丁含量1.1 mg/支，焦油含量14 mg/支），VIS-7220型分光光度儀（北京第二光學(xué)儀器廠），318C酶標(biāo)儀（上海精密科學(xué)儀器有限公司），全波長掃描酶標(biāo)儀（Powerwave XS，美國Bio-tek），全自動酶標(biāo)洗板機(jī)（伯樂1575，美國伯樂公司）。顯微攝像儀OLYMPUS TOKYO（JAPAN）等。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動物分組 大鼠被分為正常組，COPD穩(wěn)定期模型組，急支糖漿組，愛羅咳喘寧高、中、低劑量組，每組10只。

1.2.2模型制備 參照文獻(xiàn)［7，8］，以煙熏加滴菌的方法制備COPD穩(wěn)定期大鼠模型。大鼠吸氣時(shí)滴入鼻腔內(nèi)肺炎克雷伯桿菌菌液0.l mL（6×108CFU/mL），每5天一次，持續(xù)12周。大鼠置于3.6 L的密閉煙室，煙熏，2次/d，30 min/次，2次煙熏間隔3 h，持續(xù)12周。

1.2.3給藥方案 參考文獻(xiàn)［9］，各組于第13周的第1天開始灌胃。正常組、模型組灌胃生理鹽水 ［15.52 mL/ （kg·d）］，急支糖漿組給予急支糖漿口服液每天3 ml（稀釋成6 ml），2次/d灌胃，愛羅咳喘寧高、中、低劑量組分別灌胃 ［31.04，15.52，7.75 g/（kg·d）］，稀釋成6 ml，灌胃2次/d，連續(xù)14 d。

1.2.4BALF制備 參考文獻(xiàn)及前期研究制備支氣管肺泡灌洗液。原液計(jì)數(shù)細(xì)胞后，取BALF 1 ml以2000 r/min離心5 min后，將上清液置入EP管保存于-20℃冰箱中待檢。按試劑盒說明書操作檢測BALF上清液中IL-6濃度。

1.2.5肺組織勻漿中IL-6濃度及MPO活性測定［10］取右肺組織1.0 g，用冷鹽水制備成10%的肺勻漿，-20℃凍存待測。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定上清液IL-6質(zhì)量濃度。根據(jù)MPO測定試劑盒說明書測定MPO活性。

1.2.6HE染色標(biāo)本制備 取肺組織，10%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色。

2　結(jié)果

2.1大鼠一般情況 正常組和急支糖漿組無死亡，體重增長，一般狀況好。模型組，低劑量組體重下降，各死亡2只。愛羅咳喘寧中、高劑量組大鼠體重增加，各死亡1只。

2.2肺泡灌洗液和肺勻漿中IL-6和MPO變化 模型組肺泡灌洗液中IL-6和MPO都顯著高于正常組 （均P＜0.05）；愛羅咳喘寧高、中劑量組和急支糖漿組IL-6含量、MPO活性均顯著低于模型組 （均P＜0.05）。與正常組比較，模型組肺勻漿中IL-6和MPO均顯著升高 （均P＜0.05）；與模型組相比，愛羅咳喘寧中、高劑量組，急支糖漿組IL-6和MPO均顯著降低 （均P＜0.05，表1，表2）。

表1　愛羅咳喘寧對各組COPD大鼠肺泡灌洗液中IL-6含量、MPO活性的影響　?。ā纒）

表1　愛羅咳喘寧對各組COPD大鼠肺泡灌洗液中IL-6含量、MPO活性的影響　　（±s）

注：與正常組比較，t=2.876，aP=0.02；t=3.356，bP=0.005；與模型組比較 ，IL-6：（t=2.897、2.762、2.842、2.766），cP=0.02；MPO：t=2.852，cP=0.02；t=4.502、4.298、4.586，dP=0.001、0.005、0.001

組別　　例數(shù)　劑量（g/kg）　IL-6（ng/L）正常模型愛羅咳喘寧10--急支糖漿組8 8 9 9 1 0 7.75 15.52 30.04 12 205.05±0.12 338.18±0.52a251.24±1.34c242.15±1.22c245.32±0.36c240.11±0.24cMPO（U/L）72.57±21.35 156.37±11.39b155.42±12.42d101.21±14.05d127.31±4.22c100.31±3.52d

表2　愛羅咳喘寧對各組COPD大鼠肺組織勻漿中IL-6含量、MPO活性的影響　?。ā纒）

表2　愛羅咳喘寧對各組COPD大鼠肺組織勻漿中IL-6含量、MPO活性的影響　?。ā纒）

注：與正常組比較，t=2.876，aP=0.02；t=3.354，bP=0.005；與模型組比較，IL-6：（t=2.889、.875、2.822、2.764），cP=0.02；MPO：t=2.852，cP=0.02；t= 3.689、4.784、4.589，dP=0.001、0.005、0.001

組別　　例數(shù)　劑量（g/kg）　IL-6（ng/g）正常模型愛羅咳喘寧10--急支糖漿組8 8 9 9 1 0 7.75 15.52 30.04 12 142.16±0.51 293.31±1.26a165.18±1.49c150.48±0.25c161.21±0.37c147.34±0.35cMPO（U/L）80.21±16.13 168.27±12.46b113.13±15.22d98.27±13.21d117.47±8.49c100.36±3.62d

2.3肺組織結(jié)構(gòu)改變（HE染色） 光鏡下顯示，正常組氣道管腔內(nèi)無滲出物，氣管、支氣管黏膜結(jié)構(gòu)完整，上皮細(xì)胞排列整齊，管壁各層均無炎細(xì)胞浸潤、無腺體和纖維組織增生；肺泡結(jié)構(gòu)正常，無肺氣腫以及炎性滲出（圖1）。模型組管壁上皮多處脫落，黏膜下層黏液腺增生，管壁各層炎細(xì)胞彌漫浸潤細(xì)支氣管腔內(nèi)有滲出物積聚（圖2）；部分血管周圍水腫，局部細(xì)支氣管管壁因間質(zhì)水腫而增厚，在病變較重的細(xì)支氣管周圍可見肺大泡，局限性肺不張；肺泡壁血管擴(kuò)張充血，肺泡隔明顯增厚，其中可見炎細(xì)胞浸潤，肺泡腔內(nèi)有滲出液、炎細(xì)胞（圖3）。高劑量組多數(shù)細(xì)支氣管壁周圍有淋巴細(xì)胞及淋巴濾泡（圖4）。

圖1　正常組細(xì)支氣管、肺組織（HE，×100）

圖2　模型組支氣管（HE，×100）

圖3　急支糖漿組肺組織（HE，×100）

圖4　愛羅咳喘寧30.04 g·kg-1組支氣管（HE，×100）

與模型組比較，愛羅咳喘寧中劑量組見細(xì)支氣管內(nèi)少量滲出物，細(xì)支氣管黏膜上皮趨于完整，肺泡內(nèi)出現(xiàn)少量巨噬細(xì)胞和紅細(xì)胞、肺泡有部分?jǐn)U張，肺組織結(jié)構(gòu)基本正常（圖5）。低劑量組與模型組接近，療效較差（圖6）。

圖5　愛羅咳喘寧15.52g·kg-1組肺組織（HE，×100）

圖6　愛羅咳喘寧7.75 g·kg-1肺組織（HE，×100）

3　討論

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD），是以持續(xù)氣流受限為特征的可以預(yù)防和治療的疾病，氣流受限多呈進(jìn)行性發(fā)展。其發(fā)病與理化因素（吸煙、空氣污染、寒冷等）、感染因素、過敏反應(yīng)及內(nèi)在體質(zhì)有關(guān)。病理改變包括慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺氣腫、支氣管哮喘、肺動脈高壓及慢性肺源性心臟病。臨床以咳嗽、咯痰、喘息或胸悶為主要表現(xiàn)，合并右心衰竭后表現(xiàn)為體循環(huán)淤血。

COPD屬中醫(yī)“咳嗽”“痰飲”“喘證”等范疇。愛羅咳喘寧方由炙麻黃、苦杏仁、半夏、蒼術(shù)、葶藶子、干姜、山藥等藥物組成。有祛痰止咳，溫肺化飲、活血祛瘀、健脾益肺、養(yǎng)肺固腎之功效。

COPD的發(fā)病機(jī)制目前不清，其特征性病理改變是氣管、支氣管及肺組織的慢性炎癥，常急性發(fā)作。病變部位以中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤為主，炎細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)。在COPD患者的氣道、肺實(shí)質(zhì)和肺血管中均存在著巨噬細(xì)胞、嗜酸細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞增加，本研究組織病理也予以證實(shí)，參與COPD反應(yīng)的炎癥細(xì)胞釋放多種炎癥介質(zhì)［11］，導(dǎo)致肺實(shí)質(zhì)破壞，引起氣道狹窄。炎癥可刺激氣道、肺泡、血管壁結(jié)構(gòu)重建，肺功能下降。對C0PD積極有效的抗炎治療，將起到預(yù)防和治療肺心病的作用。

在COPD炎癥中IL-6升高［12-14］，是COPD嚴(yán)重程度的重要標(biāo)志［15］。MPO是中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的過氧化物酶，MPO可作為中性粒細(xì)胞的活化標(biāo)志物［16］。氣道內(nèi)中性粒細(xì)胞的聚集和活化與特異性的趨化因子密切相關(guān)［17］，本研究結(jié)果顯示，模型組BALF和肺組織勻漿中MPO較正常組顯著增高，與文獻(xiàn)［18，19］報(bào)道結(jié)果相一致，提示MPO誘導(dǎo)了氣道炎癥。COPD大鼠肺組織內(nèi)存在中性粒細(xì)胞的聚集、活化，中性粒細(xì)胞釋放過量髓過氧化物酶、蛋白酶、彈性酶等溶解細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而炎細(xì)胞浸潤，誘發(fā)小氣道和肺組織炎癥反應(yīng)［20-22］。

本研究結(jié)果顯示，BALF和肺組織勻漿中，模型組較正常組IL-6、MPO均顯著增高，與文獻(xiàn)報(bào)道［23，24］相近，提示IL-6和MPO均參與COPD穩(wěn)定期的炎癥反應(yīng)。與模型組比較，BALF和肺組織勻漿在愛羅咳喘寧中、高劑量組，急支糖漿組IL-6水平、MPO活性均顯著低于模型組，提示愛羅咳喘寧可減低BALF和肺組織勻漿中IL-6水平、抑制MPO活性，肺組織病理形態(tài)證實(shí)忠告劑量治療組和急支糖漿組的炎細(xì)胞浸潤明顯減輕，這可能是愛羅咳喘寧治療COPD的作用機(jī)制之一［25-28］。

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［28］尚立芝，謝文英，張良芝，等.愛羅咳喘寧對COPD大鼠肺組織炎癥因子及氧化應(yīng)激的影響［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（24）:168-171.

Effect of Ailuokechuanning on IL-6 and Myeloperoxidase Inflammatory Cells in Rats with Chronic Obstructive Pulmonarydisease

CHEN Xiaohui，SHANG Lizhi*，XIE Wenying，GAO Miaoran，LIU Tan，ZHANG Jing，ZHAO Xiaoyun （School of Basic Medicine Science，Henan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450046，China）

Objective To study the effect of Ailuokechuanning on interleukin-6（IL-6），myeloperoxidase（MPO）and inflammatory cells in rats with chronic obstructive pulmonary disease（COPD）.Methods The method of smoke add drops of bacteria preparation was used to rat model COPD with stabilization，the rats were randomly divided into normal control group，model group，Ailuokechuanning group（31.04，15.52，7.75 g/（kg·d），euzyme-linked immunosorbent assay was used to determine the change of IL-6 level，and colorimetric was used to determine the activity of MPO in BALF and Lung homogenates in the rats of all groups before and after treatment.Results The levels of IL-6 and MPO in BALF and lung homogenates of the model group were significantly higher than those in the normal control group，comparing with the model group，the levels of IL-6 and MPO in BALF and lung homogenates of the rats treated with Ailuokechuanning（15.52 g/（kg·d）significantly decreased.Conclusion The mechanism of Ailuokechuanning for treatment of COPD may be related to the inhibition of IL-6 and MPO release.

chronic obstructive pulmonary disease；interleukin-6（IL-6）；macrophage；myeloperoxidase；lung-distention；retention of phlegm and fluid；animal experiment

10.3969/j.issn.1672-2779.2016.16.061

1672-2779（2016）-16-0141-04

??張文娟 本文校對：呂翠田

2015-12-29）

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（No：81573881）；河南省科重點(diǎn)技攻關(guān)（No：152102310337）；河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目 （No：15A360030）；河南中醫(yī)學(xué)院研究生教育研究課題（No：2014YJX001）；河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教學(xué)項(xiàng)目（No：2015JCJX10）；河南中醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新學(xué)習(xí)項(xiàng)目（No：CXXM ［2015］0017，CXXM［2015］0063）；鄭州市科技領(lǐng)軍人才項(xiàng)目（No：121PLJRC535）

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