酶解乳清蛋白制備降膽固醇活性肽的工藝研究

蔣　琛，李曉東*，馬麗媛，杜玲玲，劉　璐

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.東北農業(yè)大學 食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；3.綏化學院 食品與制藥工程學院，黑龍江 綏化 152061）

酶解乳清蛋白制備降膽固醇活性肽的工藝研究

蔣琛1，李曉東2*，馬麗媛3，杜玲玲2，劉璐2

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.東北農業(yè)大學 食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；3.綏化學院 食品與制藥工程學院，黑龍江 綏化 152061）

利用生物酶技術酶解乳清蛋白，制備具有降膽固醇活性的多肽，通過響應面試驗、二次旋轉回歸設計建立回歸模型，以膽固醇膠束溶解度抑制率為評價指標，對乳清蛋白的酶解條件進行了優(yōu)化。結果表明，乳清蛋白的最佳酶解條件為：酶解時間8.5 h、酶解溫度55℃、酶解pH 8.0、加酶量4.7%、乳清蛋白含量5.8%，在此條件下，酶解乳清蛋白得到的活性肽的膽固醇膠束溶解度抑制率為18.21%。

乳清蛋白；降膽固醇活性肽；酶解；抑制率

乳清是生產干酪及干酪素過程中得到的大量液態(tài)副產物［1］，含有豐富的營養(yǎng)成分，其主要成分乳清蛋白的營養(yǎng)價值極高［2-3］。近年來的研究表明，乳清蛋白酶解物中含有多種生物活性肽，已成為人們的研究熱點［4-5］。目前，國內外有關降血壓肽的研究較多，而對降膽固醇肽的研究多是以大豆蛋白為原料［6-7］，而更具有研究價值的乳清蛋白源降膽固醇肽研究較少［8］。NAGAOKA S等［9］通過小鼠生物試驗研究表明，相比大豆蛋白或酪蛋白，牛乳清蛋白源生物活性肽具有更強地降低血液膽固醇的活性。

生物活性肽的制備方法有很多，酶解法是其中最常用的方法，它是通過適宜的生物酶制劑對蛋白質進行限制級水解，使其逐步釋放出活性多肽［10］。此法具有條件溫和、成本低、安全性高等特點，已經在生物活性肽的生產中得到廣泛應用。在生物活性肽的產業(yè)化進程中，針對不同蛋白來源的工具酶選擇、酶解蛋白肽類的專一性釋放等將是今后研究的主攻方向［11］。乳源生物活性肽因其安全性以及生理功能的多樣性，已成為醫(yī)療保健研究領域的熱點［12-13］。隨著人們健康意識的日益增強及對營養(yǎng)強化食品、保健功能食品和膳食補充劑需求的增長，生物活性肽的研究開發(fā)具有巨大的發(fā)展前景［14-15］。本研究采用響應面法對乳清蛋白酶解工藝條件進行了優(yōu)化，并利用體外檢測技術確定水解活性肽的降膽固醇活性。確定了乳清蛋白最佳酶解工藝條件，為酶解乳清蛋白制備降膽固醇活性肽提供了理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

乳清蛋白：新西蘭恒天然集團；胰蛋白酶：美國Sigma公司；膽固醇標準品：上?；菔郎噭┯邢薰荆慌；悄懰徕c：天津市光復精細化工研究所；甲醇（色譜純）：江蘇漢邦科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2儀器與設備

WIGGENS數字式攪拌器：澳大利亞新港科學儀器公司；DZW-4型恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；XP504電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；721型分光光度計：上海元析儀器有限公司；PHS-3C精密pH計：上海精密科學儀器有限公司；TDL-500B冷凍離心機：北京醫(yī)用離心機廠；LGJ-1型冷凍干燥機：北京醫(yī)用分析儀器廠；DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；KQ-500B型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1乳清蛋白活性肽的制備

取一定量的乳清蛋白配制成一定含量的水溶液，置于恒溫水浴鍋中90℃高溫滅酶活10 min后，冷卻至酶解溫度，用1.0 mol/L的氫氧化鈉溶液調節(jié)酶解液pH值至適宜條件，加入一定量的胰蛋白酶，用數字攪拌器進行攪拌，水解過程中不斷加入1.0 mol/L氫氧化鈉溶液以維持pH在適宜范圍內，水解結束時將水溫再次調至90℃高溫滅酶活10 min，4 000×g離心10 min，排除沉淀，上層清液即為乳清蛋白活性肽溶液。冷凍干燥，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2膽固醇標準曲線的繪制

按照丁卓平等［16］的方法略作修改。0.1 mg/mL膽固醇標準使用液的配制：準確稱量膽固醇標準品0.1 g溶于冰醋酸中，并定容至100 mL，吸取上述溶液10 mL用冰醋酸定容至100 mL，此溶液即為0.1 mg/mL膽固醇標準使用液。鐵礬顯色劑的配制：準確稱取硫酸鐵銨4.463 0 g，溶于100 mL 80%的磷酸中，吸取20 mL此溶液用硫酸定容至250 mL，貯存于硅膠干燥器中。膽固醇標準曲線的繪制：吸取膽固醇標準使用液0、1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL，分別置于25 mL具塞比色管中，在各管中分別加入冰醋酸8.0 mL、7.0 mL、6.0 mL、4.0 mL、2.0 mL、0，再分別加入4 mL鐵礬顯色劑，振蕩搖勻，在30～40min內，于波長560 nm處測定吸光度值，并繪制標準曲線，同時建立回歸方程。

1.3.3活性肽膽固醇膠束溶解度抑制率的測定

參照張曉梅等［17］的方法并略作修改。配制模擬膽汁膠束溶液包含：0.01 mol/L牛磺膽酸鈉，0.002 mol/L膽固醇，0.005 mol/L油酸，0.135 mol/L-氯化鈉，0.015 mol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.4），5 mg/mL乳清蛋白活性肽粉末，通過超聲波乳化，然后37℃培養(yǎng)24 h，100 000×g離心60 min后取上清液測定膽固醇含量。上清液中的膽固醇含量即為膽固醇膠束溶解度（mol/L），以不加活性肽的膠束溶液為空白，活性肽對膽固醇在模擬膽汁膠束溶液中的溶解度的抑制率計算公式如下：

1.3.4響應面優(yōu)化試驗設計

在單因素試驗的基礎上，選擇酶解溫度（A）、酶解時間（B）、pH值（C）、加酶量（D）和乳清蛋白含量（E）5個因素為試驗因子，以膽固醇膠束溶解度抑制率為響應值，采用Design-Expert 8.0.6軟件進行5因素二次旋轉回歸試驗設計，運用響應面分析法對乳清蛋白降膽固醇肽的酶解工藝條件進行優(yōu)化，響應面試驗因素與水平編碼見表1。

表1　響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

2　結果與分析

2.1膽固醇標準曲線的繪制

采用紫外分光光度法測定不同質量濃度的膽固醇在波長560 nm處的吸光度值，以膽固醇含量（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制出膽固醇標準曲線，結果如圖1所示。

圖1　膽固醇標準曲線Fig.1 Standard curve of cholesterol

由圖1可知，膽固醇標準曲線線性回歸方程為：y=0.012 1x-0.018 8，相關系數R2=0.998 1，表明二者線性關系良好，可用于計算樣品溶液中的膽固醇含量。

2.2響應面法優(yōu)化酶解工藝條件

采用響應面分析法對酶解時間（A）、酶解溫度（B）、酶解pH（C）、加酶量（D）、乳清蛋白含量（E）進行優(yōu)化，以膽固醇膠束溶解度抑制率（Y）為響應值，響應面分析方案及試驗結果見表2。

利用Design Expert 8.0.6軟件對表2進行回歸分析，經回歸擬合后，建立多元二次回歸方程如下：

表2　響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface experiments

對該模型進行方差分析和顯著性檢驗，結果如表3所示。

表3　回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3分析可知，模型P＜0.0001，判定系數R2為0.987 5，說明該回歸模型達到顯著水平，預測值與實測值之間具有極高的相關性，校正決定系數R2adj為0.939 0，說明該模型能解釋93.90%響應值的變化。模型失擬項P值為0.056 5＞0.05，此模型失擬不顯著，說明模型選擇合理。各因素對抑制率影響作用大小的順序依次是：D＞E＞A＞C＞B，即加酶量＞乳清蛋白含量＞酶解時間＞pH值＞酶解溫度。模型中D、E、DE、A2、E2、C2、D2、B2對響應變量的影響均極顯著，而A、C、AE影響顯著，其他不顯著，這表明試驗因素對響應值不是簡單的線性關系。失擬項不顯著，說明模型擬合度良好，此模型可用來對乳清蛋白酶解工藝條件進行分析和預測。

為進一步直觀分析響應面優(yōu)化效果，根據回歸模型繪制相應的響應曲面圖，結果見圖2。

圖2　酶解時間、加酶量和乳清蛋白含量交互作用對膽固醇膠束溶解度抑制率的響應曲面和等高線Fig.2 Response surface plots and contour line of effects of interaction between enzymolysis time，enzyme addition and whey protein content on cholesterol micelle solubility inhibition rate

由圖2可知，加酶量和乳清蛋白含量交互的等高線最密，響應面最陡，同時二者交互作用的F值大于其他因素兩兩交互作用的F值，且P值最小，因此二者交互對抑制率的影響最大；隨著乳清蛋白含量增大，加酶量增加，水解產物的抑制率先急速增加后緩慢降低；其次酶解時間和乳清蛋白含量的交互作用也較大，響應面較陡，并且二者交互作用的F值僅次于加酶量和乳清蛋白含量交互作用的F值，因此二者對抑制率的交互作用也比其他因素兩兩交互作用大；隨著乳清蛋白含量增大，酶解時間延長水解產物的抑制快速增加后緩慢降低；除此之外，其他因素的兩兩交互作用均不顯著，其中pH值和加酶量的交互作用最小，曲面較平緩，同時方差分析得到二者交互作用的F值最小，說明二者交互作用對抑制率的影響最小。

2.3驗證試驗

經Design Expert 8.0.6軟件的優(yōu)化預測并結合實際酶解情況，得到最佳酶解條件為酶解時間8.5 h、酶解溫度55℃、酶解pH 8.0、加酶量4.7%、乳清蛋白含量5.8%，此時抑制率為18.24%。按照上述條件進行驗證試驗，得到抑制率的實際值為18.21%。模型預測值與實際值相差較小，證明該模型對實際工藝操作具有一定的指導意義。

3　結論

本試驗采用響應面法研究了乳清蛋白的酶解工藝條件，確定了各工藝條件的最佳水平為酶解時間8.5 h、酶解溫度55℃、酶解pH 8.0、加酶量4.7%、乳清蛋白含量5.8%，在此條件下水解乳清蛋白得到的活性肽的膽固醇膠束溶解度抑制率為18.21%。各因素對降膽固醇活性的影響作用大小的順序依次是加酶量＞乳清蛋白含量＞酶解時間＞pH值＞酶解溫度。以此確定的乳清蛋白最佳酶解工藝條件，為酶解乳清蛋白制備降膽固醇活性肽的深入研究提供了理論基礎。

［1］齊海萍.乳清多肽的制備及乳清多肽酒的研制［J］.中國釀造，2006，25（4）：33-38.

［2］馮曉慧，蔡東聯.乳清蛋白在臨床營養(yǎng)中的應用［J］.氨基酸和生物資源，2010，32（2）：55-58.

［3］陳靜廷.乳清蛋白及其加工利用的研究進展［J］.中國奶牛，2013，13（2）：74-77.

［4］趙方新.乳清蛋白中生物活性肽對心血管的保護作用［J］.中國食物與營養(yǎng)，2010，65（2）：l-13.

［5］TAVARES T G，CONTRERAS M M，AMORIM M，et al.Optimisation，by response surface methodology，of degree of hydrolysis and antioxidant and ACE-inhibitory activities of whey protein hydrolysates obtained with cardoon extract［J］.Int Dairy J，2011，21（12）：926-933.

［6］禚同友，叢建民.大豆生物活性肽的制備及其生物活性研究［J］.中國釀造，2007，26（8）：6-9.

［7］王玲琴，王志耕，方玉明，等.雙酶法制備大豆降膽固醇活性肽的研究［J］.大豆科學，2010，29（1）：109-112.

［8］高學飛.乳清蛋白降膽固醇活性肽的制備及其生物學功能的研究［J］.中國乳業(yè)，2005（5）：41-42.

［9］NAGAOKA S，FUTAMURA Y，MIWA K，et al.Identification of novel hypocholesterolemic peptides derived from bovine milk β-lactoglobulin［J］.Biochem Bioph Res Co，2001，281（1）：11-17.

［10劉海軍，樂超銀，邵偉，等.生物活性肽研究進展［J］.中國釀造，2010，29（5）：5-8.

［11］KRISTINSSON H G，RASCO B A.Kinetics of hydrolysis of Atlantic salmon muscle proteins by alkaline proteases and a visceral serine protease mixture［J］.Process Biochem，2000，36（1）：131-139.

［12］徐靜波，張建友，孫培龍，等.乳蛋白源生物活性肽的研究現狀［J］.中國釀造，2007，26（7）：8-11.

［13］王竹清，李八方.生物活性肽及其研究進展［J］.中國海洋藥物雜志，2010，29（2）：60-68.

［14］ROCHAT F，CHERBUT C，BARCLAY D，et al.A whey-predominant formula induces fecal microbiota similar to that found in breastfed infants［J］.Nutr Res，2007，27（12）：735-740.

［15］蒲玲玲，郭長江.乳清蛋白的組成及其主要保健功能［J］.中國食物與營養(yǎng)，2011，17（6）：68-70.

［16］丁卓平，王明華，劉振華，等.食品中膽固醇含量測定方法的研究與比較［J］.食品科學，2004，25（1）：130-135.

［17］張曉梅，鐘芳，麻建國.大豆降膽固醇活性肽的初步分離純化［J］.食品與機械，2006，22（2）：33-37.

Technology of hypocholesterolemic active peptides from enzymatic hydrolysis of whey protein

JIANG Chen1，LI Xiaodong2*，MA Liyuan3，DU Lingling2，LIU Lu2
（1.College of pharmacy，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150030，China；2.College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；3.College of Food and Pharmaceutical Engineering，Suihua University，Suihua 152061，China）

The hypocholesterolemic active peptides were prepared from enzymatic hydrolysis of whey protein by biological enzyme technology.The regression model was established by response surface methodology and quadratic regression revolution design.Using inhibition rate of cholesterol micelle solubility as evaluation index，the enzymolysis condition of whey protein were optimized.The results showed that the optimum enzymolysis condition of whey protein were enzymolysis time 8.5 h，temperature 55℃，pH 8.0，enzyme 4.7%，whey protein content 5.8%.Under the conditions，the inhibition rate of cholesterol micelle solubility was 18.21%.

whey protein；hypocholesterolemic active peptides；enzymolysis；inhibition rate

R284.2

0254-5071（2016）03-0070-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.03.016

2015-09-23

黑龍江中醫(yī)藥大學科研基金（201418）

蔣琛（1980-），男，助理研究員，碩士，研究方向為乳品科學。

李曉東（1968-），男，教授，博士，研究方向為乳品加工。