超聲波輔助提取白花蛇舌草中齊墩果酸和熊果酸工藝研究

王歡，黃嫣，吳瑩，李希，，馮建安，王佳

·炮制制劑·

超聲波輔助提取白花蛇舌草中齊墩果酸和熊果酸工藝研究

王歡1，黃嫣2，吳瑩1，李希1，2，馮建安2，王佳1

目的：優(yōu)化并確定白花蛇舌草的最佳超聲提取工藝。方法：采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察超聲提取工藝中乙醇濃度、溶劑用量及提取時(shí)間三個(gè)主要因素對齊墩果酸和熊果酸提取效率的影響。結(jié)果：超聲提取的最佳提取條件為：用40 mL的100 ％乙醇超聲提取30 min。結(jié)論：超聲波輔助提取工藝穩(wěn)定可行，可用于白花蛇舌草中齊墩果酸和熊果酸的提取。

白花蛇舌草；超聲提取；正交設(shè)計(jì)；齊墩果酸；熊果酸

白花蛇舌草為茜草科一年生草本植物白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd.）的干燥全草［1］。我國大部分地區(qū)均有分布，主產(chǎn)于廣西、廣東。本品具有清熱解毒，消癰止痛之功效，常主治癰瘡毒、咽喉腫痛、毒蛇咬傷及熱淋［2］?，F(xiàn)代藥理表明該藥具有抗菌、消炎、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫功能，臨床上廣泛用于各類腫瘤，如肺癌、直腸癌，肝癌，胃癌等［3］。白花蛇舌草中主要含有蒽醌類、萜類、黃酮類、甾醇類、烷烴類、有機(jī)酸類、多糖類、生物堿、白花蛇舌草素、強(qiáng)心苷等成分，還含有一些微量元素、氨基酸及揮發(fā)性成分［4］。其中有機(jī)酸類齊墩果酸（OA）和熊果酸（UA）為其活性成分，二者互為五環(huán)三萜類同分異構(gòu)體，其中OA具有消炎和抑菌，降轉(zhuǎn)氨酶保肝作用，UA有抗糖尿病、抗?jié)兗敖档脱淖饔?，對多種致癌、促癌物有抵抗作用，對多種惡性腫瘤細(xì)胞有抑制生長作用［5］。

白花蛇舌草中OA和UA的提取多采用醇提，超聲波輔助同時(shí)提取OA和UA的報(bào)道研究甚少。超聲波提取是利用超聲波具有的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)和熱效應(yīng)，通過增大介質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)速度、增大介質(zhì)的穿透力以提取中藥的有效成分。超聲波輔助提取具有提取效率高，時(shí)間短，適應(yīng)性廣，成本低，操作簡單易行等優(yōu)點(diǎn)。本文擬采用超聲法從白花蛇舌草中提取OA和UA，用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法對其工藝條件進(jìn)行研究，以確定白花蛇舌草的最佳提取工藝。

1 材料與儀器

白花蛇舌草藥材（購自四川省新荷花中藥飲片股份有限公司，產(chǎn)地：四川，批號：1403020），齊墩果酸對照品（OA，中國食品藥品檢定研究院，批號：110709-201206），熊果酸對照品（UA，中國食品藥品檢定研究院，批號：110742-201220），甲醇（色譜純，美國Fisher公司），三乙胺（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），水為超純水（實(shí)驗(yàn)室自制），其余試劑均為分析純。

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司），DAD檢測器（美國安捷倫科技有限公司），KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），BT 125D型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司），艾科浦分析型AUP-2-35G-1實(shí)驗(yàn)室純化水機(jī)（頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件

Spursil C18色譜柱（4.6 ×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（90：10：0.03：0.06），流速0.5 mL·min-1，柱溫35 ℃，檢測波長210 nm，進(jìn)樣量10 μL。對照品和供試品色譜圖如圖1所示。

圖1　對照品和供試品色譜圖

2.2溶液的制備

對照品溶液的制備 精密稱取OA和UA對照品適量，用甲醇分別配制成含OA1.08 mg·mL-1，UA2.12 mg·mL-1的對照品儲(chǔ)備液，精密量取對照品儲(chǔ)備液適量制成含OA0.108 mg·mL-1，UA0.424 mg·mL-1的對照品混合溶液。

供試品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取白花蛇舌草粉末約1.00 g， 置于100 mL具塞錐形瓶中，加入40 mL100％乙醇溶液，超聲提取30 min，過濾，水浴蒸干，取適量甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，定容，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液即得。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 取對照品混合溶液，梯度稀釋，得OA濃度為108，54，27，13.5，6.75，3.375 μg·mL-1，和UA濃度依次424，212，106，53，26.5，13.25 μg·mL-1的一系列對照品混合液。分別精密吸取對照品混合溶液10 μL，按上述色譜條件進(jìn)行測定，以對照品質(zhì)量濃度X（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得OA和UA的回歸方程分別為Y=15.042 9X+8.1005（R2=0.999 8），Y=10.056 8X+16.582 6（R2=0.999 5），線性范圍分別為3.375～108 μg·mL-1，13.25～424 μg·mL-1。

2.3.2精密度 精密吸取對照品溶液10 μL，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算OA和UA的峰面積RSD分別為1.57％，0.79％，表明儀器精密度良好。

2.3.3重復(fù)性 取同一批白花蛇舌草樣品，制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣分析，記錄OA、UA的峰面積，計(jì)算含量。OA、UA的含量平均值分別為0.498 7，2.214 4 mg·g-1，RSD分別為2.12％，1.97％。結(jié)果表明，本方法的重復(fù)性良好。

2.3.4穩(wěn)定性 分別精密吸取對照品溶液及供試品溶液各10 μL，于0，2，4，8，12，24 h時(shí)進(jìn)行測定，以O(shè)A和UA的峰面積計(jì)算RSD，結(jié)果OA和UA的RSD分別為1.75％、1.13 ％，表明在24 h內(nèi)對照品和供試品穩(wěn)定性良好。

2.3.5加樣回收率 精密稱取白花蛇舌草樣品約0.3 g，按供試品含量的80％，100％，120％，精密加入相應(yīng)的對照品溶液，每種濃度平行3份，測定含量，計(jì)算平均回收率及RSD，見表1。

表1　OA和UA加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4超聲提取條件的考察

2.4.1提取溶劑的考察 根據(jù)OA和UA易溶于乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮，不溶于水的理化性質(zhì)，考察不同的提取溶劑對提取結(jié)果的影響。精密稱定白花蛇舌草粉末2.00 g，分別加入60 mL乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮，超聲提取60 min，過濾，水浴蒸干，取適量甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，定容，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液10 μL進(jìn)樣分析。由試驗(yàn)結(jié)果可知，采用甲醇、乙醇、丙酮提取率較高，考慮到溶劑的安全性及原料成本問題，最終采用乙醇作為提取溶劑。

表2　提取溶劑考察試驗(yàn)結(jié)果

2.4.2正交試驗(yàn) 本試驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)方法，以提取液中OA和UA含量的綜合評分作為評判指標(biāo)，乙醇濃度（A）、溶劑用量（B）和提取時(shí)間（C）為考察因素，每個(gè)因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平，選擇 L9（34）進(jìn)行試驗(yàn)，各因素的水平設(shè)計(jì)見表3。

表3　L9（34）因素水平表

準(zhǔn)確稱取白花蛇舌草藥材約1.00 g，按L9（34）正交設(shè)計(jì)表中各試驗(yàn)條件進(jìn)行超聲提取，收集提取液，過濾，水浴蒸干，取適量甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，定容，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液即得。并按前述色譜條件進(jìn)行測定，采用DPS數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。

表4　L9（34）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：綜合評分=（OA含量/最大OA含量×0·5+UA含量/最大UA含量×0·5） ×100

表5　正交設(shè)計(jì)方差分析表（完全隨機(jī)模型）

直觀方差分析結(jié)果可知，三個(gè)因素的影響大小順序?yàn)锳＞B＞C，即乙醇濃度為最大影響因索，其他依次為乙醇用量和提取時(shí)間，其中，A和B因素有顯著性差異。根據(jù)極差分析C2＞C1＞C3，綜合考慮提取液中OA和UA的含量越高，白花蛇舌草的提取工藝越理想，因此，C因素選取提取時(shí)間較短且OA和UA含量較高的水平，白花蛇舌草中OA和UA的最佳提取工藝為A3B3C2，即40 mL100％乙醇超聲提取30 min。

2.4.3驗(yàn)證試驗(yàn) 為進(jìn)一步考察優(yōu)選工藝，以所得最佳工藝條件提取3批白花蛇舌草樣品，測得提取液中

OA和UA的含量結(jié)果見表6。

表6　驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

采用二極管陣列檢測器對檢測波長進(jìn)行考察，在190-400 nm下對對照品和供試品進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果顯示在在205 nm處，OA和UA有最大吸收，考慮到溶劑峰的影響，最終確定210 nm作為檢測波長。實(shí)驗(yàn)中曾采用甲醇-水系統(tǒng)作為流動(dòng)相，加入少量醋酸調(diào)節(jié)pH，結(jié)果保留時(shí)間長，拖尾嚴(yán)重，且pH值對分離度的影響較敏感。在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上［5］，采用甲醇-水-冰醋酸-三乙胺系統(tǒng)，既改善了峰形，保留時(shí)間也相對減少了。分別考察了不同的流速1，0.8，0.6，0.5 mL·min-1，結(jié)果表明流速快，出峰時(shí)間早，但分離度差，低流速能提高OA和UA間的分離度，最終選擇流速為0.5 mL·min-1。對于不同的柱溫，溫度越高，出峰時(shí)間也短，峰形好但分離度差，通過對不同的柱溫20，25，30，35，40 ℃的考察，綜合考慮，選擇35 ℃。

超聲提取具有高效、快速、節(jié)能、環(huán)保等特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)通過考察影響超聲提取的各個(gè)因素，最終確定了白花蛇舌草的最佳超聲提取工藝為40 mL體積分?jǐn)?shù)為100％的乙醇，提取30 min。白花蛇舌草中化學(xué)成分復(fù)雜，缺乏系統(tǒng)性研究，指標(biāo)性成分或有效成分對照品的制備及含量測定指標(biāo)尚未建立，本研究以O(shè)A和UA為指標(biāo)成分，對白花蛇舌草的含量測定的建立具有一定的指導(dǎo)意義。

［1］ 四川省食品藥品監(jiān)督管理局.四川省中藥材標(biāo)準(zhǔn)［S］.成都：四川科學(xué)技術(shù)出版社，2010，180-182.

［2］ 吳柏林，徐燕.白花蛇舌草抗腫瘤藥理研究近況［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2008，17（9）：1451-1452.

［3］ 孫巖，李潔.白花蛇舌草抗腫瘤作用的研究進(jìn)展［J］. 食品與藥品，2012（5）：210-211.

［4］ 覃驪蘭，鄧家剛.中藥白花蛇舌草化學(xué)成分及有效成分藥理活性的研究進(jìn)展［J］. 內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2008，27（4）：42-45.

［5］ 周先明，呂美紅.高效液相色譜法測定中草藥中齊墩果酸熊果酸含量的應(yīng)用進(jìn)展［J］. 安徽醫(yī)學(xué)，2011，32（11）：1950-1951.

（責(zé)任編輯：傅舒）

Ultrasonic assisted extraction of oleanolic acid and ursolic acid from Baihuasheshecao/

WANG Huan1， HUANG Yan2， WU Ying1， LI Xi1， 2， FENG Jian-an2， WANG Jia1//（1.School of Pharmacy， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， Sichuan； 2.Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine Sciences， Institute of TCM， Chengdu 610031， Sichuan）

Objective: To optimize the ultrasonic extraction conditions of Baihuasheshecao. Method: The concentration of ethanol， ratio of material to liquid， ultrasonic time， which effected the extraction efficiency of oleanolic acid and ursolic acid，were evaluated by L9（34） orthogonal experiment design. Result: The best extraction conditions were： ultrasonic extraction 30 min with 40 mL 100％ ethanol. Conclusion: The ultrasonic assisted extraction process is stable and feasible， which can be used for extracting oleanolic acid and ursolic acid from Baihuasheshecao.

Baihuasheshecao； ultrasonic extraction； orthogonal experiment design； oleanolic acid； ursolic acid

R 284.2

A

1674-926X（2016）03-010-04

四川省省級公益性科研院所基本科研項(xiàng)目（14-4-422）

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 611137 2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)研究所，成都 610031

王歡，女（1989-），在讀碩士研究生，從事中藥新制劑、新技術(shù)、新工藝的研究Tel：18380228305 Email：928451725@qq.com

李希，女（1969-），碩士，教授，從事中藥新制劑、新技術(shù)、新工藝的研究工作Tel：18030897734 Email：1836820767@qq.com

2015-06-30