王歡,黃嫣,吳瑩,李希,,馮建安,王佳
·炮制制劑·
超聲波輔助提取白花蛇舌草中齊墩果酸和熊果酸工藝研究
王歡1,黃嫣2,吳瑩1,李希1,2,馮建安2,王佳1
目的:優(yōu)化并確定白花蛇舌草的最佳超聲提取工藝。方法:采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),考察超聲提取工藝中乙醇濃度、溶劑用量及提取時(shí)間三個(gè)主要因素對齊墩果酸和熊果酸提取效率的影響。結(jié)果:超聲提取的最佳提取條件為:用40 mL的100 %乙醇超聲提取30 min。結(jié)論:超聲波輔助提取工藝穩(wěn)定可行,可用于白花蛇舌草中齊墩果酸和熊果酸的提取。
白花蛇舌草;超聲提取;正交設(shè)計(jì);齊墩果酸;熊果酸
白花蛇舌草為茜草科一年生草本植物白花蛇舌草(Hedyotis diffusa Willd.)的干燥全草[1]。我國大部分地區(qū)均有分布,主產(chǎn)于廣西、廣東。本品具有清熱解毒,消癰止痛之功效,常主治癰瘡毒、咽喉腫痛、毒蛇咬傷及熱淋[2]?,F(xiàn)代藥理表明該藥具有抗菌、消炎、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫功能,臨床上廣泛用于各類腫瘤,如肺癌、直腸癌,肝癌,胃癌等[3]。白花蛇舌草中主要含有蒽醌類、萜類、黃酮類、甾醇類、烷烴類、有機(jī)酸類、多糖類、生物堿、白花蛇舌草素、強(qiáng)心苷等成分,還含有一些微量元素、氨基酸及揮發(fā)性成分[4]。其中有機(jī)酸類齊墩果酸(OA)和熊果酸(UA)為其活性成分,二者互為五環(huán)三萜類同分異構(gòu)體,其中OA具有消炎和抑菌,降轉(zhuǎn)氨酶保肝作用,UA有抗糖尿病、抗?jié)兗敖档脱淖饔?,對多種致癌、促癌物有抵抗作用,對多種惡性腫瘤細(xì)胞有抑制生長作用[5]。
白花蛇舌草中OA和UA的提取多采用醇提,超聲波輔助同時(shí)提取OA和UA的報(bào)道研究甚少。超聲波提取是利用超聲波具有的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)和熱效應(yīng),通過增大介質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)速度、增大介質(zhì)的穿透力以提取中藥的有效成分。超聲波輔助提取具有提取效率高,時(shí)間短,適應(yīng)性廣,成本低,操作簡單易行等優(yōu)點(diǎn)。本文擬采用超聲法從白花蛇舌草中提取OA和UA,用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法對其工藝條件進(jìn)行研究,以確定白花蛇舌草的最佳提取工藝。
白花蛇舌草藥材(購自四川省新荷花中藥飲片股份有限公司,產(chǎn)地:四川,批號:1403020),齊墩果酸對照品(OA,中國食品藥品檢定研究院,批號:110709-201206),熊果酸對照品(UA,中國食品藥品檢定研究院,批號:110742-201220),甲醇(色譜純,美國Fisher公司),三乙胺(色譜純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司),水為超純水(實(shí)驗(yàn)室自制),其余試劑均為分析純。
Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司),DAD檢測器(美國安捷倫科技有限公司),KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),BT 125D型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司),艾科浦分析型AUP-2-35G-1實(shí)驗(yàn)室純化水機(jī)(頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司)。
2.1色譜條件
Spursil C18色譜柱(4.6 ×250 mm,5 μm),流動(dòng)相為甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(90:10:0.03:0.06),流速0.5 mL·min-1,柱溫35 ℃,檢測波長210 nm,進(jìn)樣量10 μL。對照品和供試品色譜圖如圖1所示。
圖1 對照品和供試品色譜圖
2.2溶液的制備
對照品溶液的制備 精密稱取OA和UA對照品適量,用甲醇分別配制成含OA1.08 mg·mL-1,UA2.12 mg·mL-1的對照品儲(chǔ)備液,精密量取對照品儲(chǔ)備液適量制成含OA0.108 mg·mL-1,UA0.424 mg·mL-1的對照品混合溶液。
供試品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取白花蛇舌草粉末約1.00 g, 置于100 mL具塞錐形瓶中,加入40 mL100%乙醇溶液,超聲提取30 min,過濾,水浴蒸干,取適量甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中,定容,用0.45 μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液即得。
2.3方法學(xué)考察
2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 取對照品混合溶液,梯度稀釋,得OA濃度為108,54,27,13.5,6.75,3.375 μg·mL-1,和UA濃度依次424,212,106,53,26.5,13.25 μg·mL-1的一系列對照品混合液。分別精密吸取對照品混合溶液10 μL,按上述色譜條件進(jìn)行測定,以對照品質(zhì)量濃度X(μg·mL-1)為橫坐標(biāo),峰面積Y為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,得OA和UA的回歸方程分別為Y=15.042 9X+8.1005(R2=0.999 8),Y=10.056 8X+16.582 6(R2=0.999 5),線性范圍分別為3.375~108 μg·mL-1,13.25~424 μg·mL-1。
2.3.2精密度 精密吸取對照品溶液10 μL,按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次,計(jì)算OA和UA的峰面積RSD分別為1.57%,0.79%,表明儀器精密度良好。
2.3.3重復(fù)性 取同一批白花蛇舌草樣品,制備6份供試品溶液,分別進(jìn)樣分析,記錄OA、UA的峰面積,計(jì)算含量。OA、UA的含量平均值分別為0.498 7,2.214 4 mg·g-1,RSD分別為2.12%,1.97%。結(jié)果表明,本方法的重復(fù)性良好。
2.3.4穩(wěn)定性 分別精密吸取對照品溶液及供試品溶液各10 μL,于0,2,4,8,12,24 h時(shí)進(jìn)行測定,以O(shè)A和UA的峰面積計(jì)算RSD,結(jié)果OA和UA的RSD分別為1.75%、1.13 %,表明在24 h內(nèi)對照品和供試品穩(wěn)定性良好。
2.3.5加樣回收率 精密稱取白花蛇舌草樣品約0.3 g,按供試品含量的80%,100%,120%,精密加入相應(yīng)的對照品溶液,每種濃度平行3份,測定含量,計(jì)算平均回收率及RSD,見表1。
表1 OA和UA加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果
2.4超聲提取條件的考察
2.4.1提取溶劑的考察 根據(jù)OA和UA易溶于乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮,不溶于水的理化性質(zhì),考察不同的提取溶劑對提取結(jié)果的影響。精密稱定白花蛇舌草粉末2.00 g,分別加入60 mL乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮,超聲提取60 min,過濾,水浴蒸干,取適量甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中,定容,用0.45 μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液10 μL進(jìn)樣分析。由試驗(yàn)結(jié)果可知,采用甲醇、乙醇、丙酮提取率較高,考慮到溶劑的安全性及原料成本問題,最終采用乙醇作為提取溶劑。
表2 提取溶劑考察試驗(yàn)結(jié)果
2.4.2正交試驗(yàn) 本試驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)方法,以提取液中OA和UA含量的綜合評分作為評判指標(biāo),乙醇濃度(A)、溶劑用量(B)和提取時(shí)間(C)為考察因素,每個(gè)因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平,選擇 L9(34)進(jìn)行試驗(yàn),各因素的水平設(shè)計(jì)見表3。
表3 L9(34)因素水平表
準(zhǔn)確稱取白花蛇舌草藥材約1.00 g,按L9(34)正交設(shè)計(jì)表中各試驗(yàn)條件進(jìn)行超聲提取,收集提取液,過濾,水浴蒸干,取適量甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中,定容,用0.45 μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液即得。并按前述色譜條件進(jìn)行測定,采用DPS數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表4。
表4 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果
注:綜合評分=(OA含量/最大OA含量×0·5+UA含量/最大UA含量×0·5) ×100
表5 正交設(shè)計(jì)方差分析表(完全隨機(jī)模型)
直觀方差分析結(jié)果可知,三個(gè)因素的影響大小順序?yàn)锳>B>C,即乙醇濃度為最大影響因索,其他依次為乙醇用量和提取時(shí)間,其中,A和B因素有顯著性差異。根據(jù)極差分析C2>C1>C3,綜合考慮提取液中OA和UA的含量越高,白花蛇舌草的提取工藝越理想,因此,C因素選取提取時(shí)間較短且OA和UA含量較高的水平,白花蛇舌草中OA和UA的最佳提取工藝為A3B3C2,即40 mL100%乙醇超聲提取30 min。
2.4.3驗(yàn)證試驗(yàn) 為進(jìn)一步考察優(yōu)選工藝,以所得最佳工藝條件提取3批白花蛇舌草樣品,測得提取液中
OA和UA的含量結(jié)果見表6。
表6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果
采用二極管陣列檢測器對檢測波長進(jìn)行考察,在190-400 nm下對對照品和供試品進(jìn)行全波長掃描,結(jié)果顯示在在205 nm處,OA和UA有最大吸收,考慮到溶劑峰的影響,最終確定210 nm作為檢測波長。實(shí)驗(yàn)中曾采用甲醇-水系統(tǒng)作為流動(dòng)相,加入少量醋酸調(diào)節(jié)pH,結(jié)果保留時(shí)間長,拖尾嚴(yán)重,且pH值對分離度的影響較敏感。在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上[5],采用甲醇-水-冰醋酸-三乙胺系統(tǒng),既改善了峰形,保留時(shí)間也相對減少了。分別考察了不同的流速1,0.8,0.6,0.5 mL·min-1,結(jié)果表明流速快,出峰時(shí)間早,但分離度差,低流速能提高OA和UA間的分離度,最終選擇流速為0.5 mL·min-1。對于不同的柱溫,溫度越高,出峰時(shí)間也短,峰形好但分離度差,通過對不同的柱溫20,25,30,35,40 ℃的考察,綜合考慮,選擇35 ℃。
超聲提取具有高效、快速、節(jié)能、環(huán)保等特點(diǎn),本實(shí)驗(yàn)通過考察影響超聲提取的各個(gè)因素,最終確定了白花蛇舌草的最佳超聲提取工藝為40 mL體積分?jǐn)?shù)為100%的乙醇,提取30 min。白花蛇舌草中化學(xué)成分復(fù)雜,缺乏系統(tǒng)性研究,指標(biāo)性成分或有效成分對照品的制備及含量測定指標(biāo)尚未建立,本研究以O(shè)A和UA為指標(biāo)成分,對白花蛇舌草的含量測定的建立具有一定的指導(dǎo)意義。
[1] 四川省食品藥品監(jiān)督管理局.四川省中藥材標(biāo)準(zhǔn)[S].成都:四川科學(xué)技術(shù)出版社,2010,180-182.
[2] 吳柏林,徐燕.白花蛇舌草抗腫瘤藥理研究近況[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2008,17(9):1451-1452.
[3] 孫巖,李潔.白花蛇舌草抗腫瘤作用的研究進(jìn)展[J]. 食品與藥品,2012(5):210-211.
[4] 覃驪蘭,鄧家剛.中藥白花蛇舌草化學(xué)成分及有效成分藥理活性的研究進(jìn)展[J]. 內(nèi)蒙古中醫(yī)藥,2008,27(4):42-45.
[5] 周先明,呂美紅.高效液相色譜法測定中草藥中齊墩果酸熊果酸含量的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 安徽醫(yī)學(xué),2011,32(11):1950-1951.
(責(zé)任編輯:傅舒)
Ultrasonic assisted extraction of oleanolic acid and ursolic acid from Baihuasheshecao/
WANG Huan1, HUANG Yan2, WU Ying1, LI Xi1, 2, FENG Jian-an2, WANG Jia1//(1.School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan; 2.Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine Sciences, Institute of TCM, Chengdu 610031, Sichuan)
Objective: To optimize the ultrasonic extraction conditions of Baihuasheshecao. Method: The concentration of ethanol, ratio of material to liquid, ultrasonic time, which effected the extraction efficiency of oleanolic acid and ursolic acid,were evaluated by L9(34) orthogonal experiment design. Result: The best extraction conditions were: ultrasonic extraction 30 min with 40 mL 100% ethanol. Conclusion: The ultrasonic assisted extraction process is stable and feasible, which can be used for extracting oleanolic acid and ursolic acid from Baihuasheshecao.
Baihuasheshecao; ultrasonic extraction; orthogonal experiment design; oleanolic acid; ursolic acid
R 284.2
A
1674-926X(2016)03-010-04
四川省省級公益性科研院所基本科研項(xiàng)目(14-4-422)
1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,成都 611137 2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)研究所,成都 610031
王歡,女(1989-),在讀碩士研究生,從事中藥新制劑、新技術(shù)、新工藝的研究Tel:18380228305 Email:928451725@qq.com
李希,女(1969-),碩士,教授,從事中藥新制劑、新技術(shù)、新工藝的研究工作Tel:18030897734 Email:1836820767@qq.com
2015-06-30