半夏瀉心湯對高齡合并D-半乳糖誘導衰老模型大鼠的影響

李利民，潘嘉，劉潔，寧楠，黃利，鄧延莉，于婭，張吉仲

·藥理毒理·

半夏瀉心湯對高齡合并D-半乳糖誘導衰老模型大鼠的影響

李利民1，潘嘉1，劉潔1，寧楠1，黃利1，鄧延莉1，于婭1，張吉仲2

目的：研究半夏瀉心湯對衰老模型大鼠學習記憶能力和腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的影響。方法：高齡大鼠ip D-半乳糖125 mg·kg-1，每天1次，連續(xù)4周造成衰老模型動物，用水迷宮檢測衰老大鼠學習記憶能力，用Elisa法檢測腦組內(nèi)多巴胺（DA）、去甲腎上腺素（NE）和五羥色胺（5-HT）等的含量，用Elisa法檢測血清降鈣素相關基因肽（CGRP）、內(nèi)皮素-1（ET-1）的水平，用免疫組織化學方法檢測腦組織內(nèi)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）的表達。結(jié)果：半夏瀉心湯給藥組可明顯縮短逃避潛伏期；半夏瀉心湯10和5 g·kg-1給藥組海馬區(qū)腦組織內(nèi)DA和5-HT含量明顯升高，可明顯上調(diào)腦組織額葉皮層區(qū)BDNF的表達，但半夏瀉心湯對血清CGRP和ET-1未見明顯影響。結(jié)論：半夏瀉心湯對衰老模型大鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平與額葉皮層BDNF的表達有顯著影響。

半夏瀉心湯；衰老大鼠；單胺類神經(jīng)遞質(zhì)；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子

癡呆是一種以認知功能缺損為核心癥狀的獲得性智能損害綜合征，通常累及老年人，65歲以上的老人大約有7.8％患癡呆，年齡越大，危險性越高［1］。半夏瀉心湯始見于《傷寒論》，具有辛開苦降，和中消痞之功，臨床主要用于治療寒熱互結(jié)，氣機壅滯之痞證，如潰瘍性結(jié)腸炎、胃癌等。我們在過去的研究中，發(fā)現(xiàn)半夏瀉心湯對脾虛大鼠腦組織內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)有調(diào)節(jié)作用［2］，而腦組織內(nèi)各種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)是記憶形成和保持不可缺少的環(huán)節(jié)之一，老年癡呆又以認知功能缺損為核心癥狀，故而推測半夏瀉心湯可能對老年癡呆治療有一定作用。為了驗證上述設想，為臨床治療癡呆提供實驗依據(jù)，我們進行了半夏瀉心湯對衰老模型大鼠的影響實驗，報告如下。

1 材料

1.1試驗藥物

半夏瀉心湯各組成藥物均購自四川省中藥飲片有限責任公司，其中炙甘草產(chǎn)于新疆，黃芩產(chǎn)于河北，人參產(chǎn)于東北，干姜產(chǎn)于四川，黃連產(chǎn)于四川，法半夏產(chǎn)于四川，以上藥物均執(zhí)行2010年國家藥典標準，大棗產(chǎn)于新疆（自配）。按照生藥劑量比例根據(jù)文獻折算給藥量，依照人單位體重生藥量求得大鼠單位體重生藥量，并擴大5倍。全方由半夏12 g，干姜9 g，黃芩9 g，黃連3 g，人參9 g，甘草9 g，大棗4枚組成，精確稱取上述相應劑量的生藥，加入10倍量清水浸泡30 min（人參提前浸泡24 h），常規(guī)煎煮2次，30 min/次，100目濾布過濾藥液，2次濾液混合后，60℃水浴加熱濃縮為每1 mL藥液含1 g生藥的提取藥液供給藥用。

石杉堿甲片（哈伯因），河南太龍藥業(yè)股份有限公司。規(guī)格與包裝：50 μg/片×24片/盒，產(chǎn)品批號：130904，有效期至：2015/08。

1.2動物

SD 大鼠，SPF級，120只，全雌，由四川省中醫(yī)藥科學院實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2013-19號，所有動物于室溫18～22℃，相對濕度40％～70％，12h明暗交替環(huán)境中飼養(yǎng)至15月齡后進行實驗。另取6月齡大鼠20只作為對照組。

1.3試劑

大鼠降鈣素相關基因肽（CGRP）、內(nèi)皮素-1 （ET-1）Elisa試劑盒，上海西唐生物科技公司；D-半乳糖，上海金穗生物科技有限公司；Rat Dopamine （DA） ELISA Kit，Rat Noradrenaline （NE） ELISA Kit；，Rat 5-hydroxy tryptamine （5-HT） ELISA Kit均為USA MyBioSource， Inc出品；抗大鼠抗體腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（ brain derived neurotrophic factor，BDNF），多聚體抗兔IgG-HRP，DBA染色試劑盒等，均由武漢博士德生物工程有限公司出品。

1.4儀器

光譜掃描式多功能讀數(shù)儀，Thermo Fisher。酶標儀，洗板機，Denly Dragon；Discovry XT全自動免疫組化染色系統(tǒng)，Roche；Y型水迷宮，自制。

2 方法

2.1動物造模［3， 4］與分組

實驗動物適應1周后，Y型水迷宮實驗篩選動物，剔除學習記憶能力未明顯下降動物后，將動物隨機分成5組，每組10只：模型組，大、中、小劑量給藥組和石杉堿甲組；另取6月齡大鼠10只作為青年對照組。對照組皮下注射生理鹽水5 mL·kg-1，其余各組均皮下注射D-半乳糖125 mg·kg-1每天1次，連續(xù)4周。然后對照組和模型組灌胃生理鹽水10 mL· kg-1，給藥組分別ig給藥，連續(xù)6周。給藥最后一周進行歷時1周的Y型水迷宮實驗。 實驗過程中每周稱重一次，以便及時調(diào)整給藥量。

2.2Y型水迷宮對實驗動物學習記憶能力的測試

采用 Y 型水迷宮實驗監(jiān)測大鼠學習記憶能力，記錄大鼠平均逃避潛伏期（從入水起點至尋找到階梯出水的時間）和正確反應次數(shù)（以10s內(nèi)直接抵達平臺為正確反應）［5］，預訓練2 d，每天2次，每次訓練時間定為2 min，2 min仍未找到安全通道者以120 s計算；正式測試3 d，每天1次，每次測試時間定為2 min，2 min仍未找到安全通道者以120 s計算。

2.3大鼠海馬DA、NE和5-HT含量的測定

參照文獻［6］的方法 ，學習記憶測試結(jié)束后1 h，將動物切斷股動脈放血處死，迅速取腦，置于冰盒上，取出大腦，分離左側(cè)海馬區(qū)，腦組織稱重，按照重量和體積比1∶10的比例，加入生理鹽水冰浴勻漿，4℃，3500 r·min-1，離心10 min，取上清立即測定。采用Elisa方法DA、NE和5-HT含量，嚴格按試劑盒說明書進行。

2.4大鼠血清CGRP和ET-1含量的測定

取血后，3000 r·min-1離心10 min，取血清，采用Elisa方法測血清CGRP和ET-1含量，嚴格按試劑盒說明書進行。

2.5用免疫組織化學法測定大鼠額葉皮層BDNF的表達

學習記憶測試結(jié)束后1 h，將動物切斷股動脈放血處死，迅速取腦，置于冰盒上，取出大腦，迅速放入4％多聚甲醛固定液中，2 d后分離右側(cè)海馬和皮層，常規(guī)石蠟包埋、切片、Roche全自動免疫組化染色系統(tǒng)染色。應用彩色病理圖文分析系統(tǒng)獲得高清晰的免疫組化染色病理圖片。使用Image Pro Plus7.0分析測量BDNF的表達面積（Area）和累積光密度（IOD），用非參數(shù)法進行統(tǒng)計學分析。

3 結(jié)果

3.1Y型水迷宮檢測各組大鼠學習記憶能力

實驗動物造模后，AD模型大鼠在水迷宮的逃避潛伏期較青年對照組明顯延長；與模型組比較，在訓練后24、48和96 h測定，半夏瀉心湯給藥組能明顯縮短逃避潛伏期（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見表1。

表1　半夏瀉心湯對大鼠逃避潛伏期的影響

注：與模型組比較，* P＜0.05， ** P＜0.01

3.2半夏瀉心湯對海馬區(qū)DA、NE和5-HT含量的影響

與青年對照組比較，模型組動物海馬區(qū)組織內(nèi)DA和5-HT含量明顯降低（P＜0.01），NE含量也有一定降低，但NE含量的降低，與對照組比較并無統(tǒng)計學意義。與模型組比較，半夏瀉心湯給藥后，大、中劑量組海馬區(qū)腦組織內(nèi)DA和5-HT含量明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），石杉堿甲可升高海馬腦組織DA含量。結(jié)果見表3。

表3　半夏瀉心湯對海馬區(qū)DA、NE和5-HT含量的影響

3.3半夏瀉心湯對血清CGRP和ET-1的影響

與青年對照組比較，模型組動物血清CGRP含量明顯升高，ET-1含量也有一定升高，但ET-1含量的升高，與對照組比較并無統(tǒng)計學意義。與模型組比較，半夏瀉心湯給藥后，血清CGRP和ET-1含量未見明顯改變，石杉堿甲可降低血清ET-1含量（P＜0.05）。結(jié)果見表4。

表4　半夏瀉心湯對血清CGRP和ET-1的影響

3.4半夏瀉心湯對額葉皮層BDNF表達的影響

與青年對照組比較，模型大鼠腦組織皮層區(qū)BDNF表達的Area和IOD較青年對照組明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，半夏瀉心湯10 g·kg-1和5 g·kg-1給藥組BDNF表達Area和IOD明顯上調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見圖1。

圖1　半夏瀉心湯（bxxxt）對大鼠腦組織額葉皮層BDNF表達的影響

4 討論

已有研究證實D-半乳糖衰老模型具有與人類自然衰老相似的生化改變、免疫功能低下、基因表達與調(diào)控異常、細胞生長繁殖能力下降、細胞退行性改變及認知障礙［7］等表現(xiàn)。學習記憶能力與單胺類神經(jīng)遞質(zhì)DA、NE、5-HT及神經(jīng)肽密切相關，它們之間相互制約處于一種平衡狀態(tài)［8］。研究表明，NE在記憶保持方面起重要作用，而改善記憶與促進DA釋放有關，5-HT系統(tǒng)則參與調(diào)節(jié)情緒、動機和食欲等［9～10］。神經(jīng)遞質(zhì)NE、DA、5-HT等由神經(jīng)細胞合成后儲存于囊泡內(nèi)，當動作電位到達神經(jīng)末梢時，在Ca2+的參與下以胞吐的方式到達突觸間隙，發(fā)揮作用后通過酶解或再攝取被迅速清除。在正常情況下，中樞內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的分泌保持在一定水平，并且它們相互之間的比例協(xié)調(diào)，從而維持功能的穩(wěn)定；隨著機體的老化，會出現(xiàn)學習記憶能力的下降，同時腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的代謝亦發(fā)生紊亂，出現(xiàn)NE、DA、5-HT含量的下降，提示衰老過程中腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的平衡遭到破壞，并與一些老年性疾病如老年癡呆及腦功能的減退有關［11～12］。

在AD的發(fā)病過程中，突觸功能的紊亂通常早于突觸和神經(jīng)細胞數(shù)量的減少。在AD中晚期，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）在調(diào)節(jié)突觸可塑性方面扮演了很重要的角色。因此，BDNF與AD的關系受到了廣泛的矚目。

BDNF還可以增強神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，可能是阻止了持續(xù)高頻刺激引起的突觸勞損［13］。

本項研究發(fā)現(xiàn)：半夏瀉心湯能明顯縮短衰老模型大鼠在水迷宮中的逃避潛伏期，可增加腦組織中多巴胺（DA）和5羥色胺（5-HT）含量，還可提高額葉皮層BDNF的表達。但對血清CGRP與ET-1的水平無明顯影響。分析半夏瀉心湯可能對腦組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)有一定的調(diào)節(jié)作用，使衰老過程中腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的遭到破壞平衡狀態(tài)得到改善，同時增加BDNF表達，改善了神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，從而提高了衰老大鼠學習記憶能力。

［1］ 田金洲.中國癡呆診療指南［S］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：1.

［2］ 張吉仲，李利民，黃利，等.半夏瀉心湯及其拆方對脾虛大鼠下丘腦中多巴胺、去甲腎上腺素和5-羥色胺的影響［J］.華西藥學雜志，2014，29（3）： 286.

［3］ 龔國清，徐黻本.小鼠衰老模型研究［J］.中國藥科大學學報，1991，22（ 2）：101.

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［6］ 喬之龍，郭蕾，李菲.補腎益智湯對老年癡呆模型大鼠中樞神經(jīng)遞質(zhì)的影響［J］.中華中醫(yī)藥學刊， 2009， 27（12）：2565.

［7］ 郭宗君，金麗英，郭云良，等.三種化學物質(zhì)誘發(fā)大鼠認知障礙：優(yōu)化阿爾茨海默病模型的研究［J］.中國臨床康復， 2004，8 （25）： 5266.

［8］ 厚華剛，庫保善.膽堿系統(tǒng)和其它神經(jīng)遞質(zhì)/調(diào)質(zhì)系統(tǒng)在學習記憶中的作用及相互作用［J］.包頭醫(yī)學院學報，1998，14 （3）： 79.

［9］ White NM. Effect of nigrostriatal dopamine depletion on the post-training memory -improving action of amphetamine ［J］. Life Sci， 1998， 43 （1）：7.

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（責任編輯：陳思敏）

Effect of Banxiaxiexin Tang on aging rats induced by elderly merger D-galactose/

LI Li-min1， PAN Jia1， LIU Jie1， NING Nan1， HUANG Li1， DENG Yan-li1， YU Ya1， ZhANG Ji-zhong2//（1. Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 610041， Sichuan； 2. Ethnic Medicine Institute， Southwest University for Nationalities， Chengdu 610041， Sichuan）

Objective: To observe the influence of Banxiaxiexin Tang on learning and memory and neurotransmitters in aging model rats brain. Method: Elderly rats were subcutaneous injected of D-galactose 125 m g·kg-1， once a day for 4 weeks to establish aging animal model. Learning and memory ability was measured with water maze. The content of dopamine （DA）， norepinephrine （NE） and serotonin （5-HT） in the brain were tested with Elisa assay. The serum levels of calcitonin gene-related peptide （CGRP） and endothelin -1 （ET-1） were tested with Elisa assay. Brain-derived neurotrophic factor （BDNF） expression was detected in brain tissue with immunohistochemical method. Result: The escape latency was significantly shorten in Banxiaxiexin Tang group. Compared with model group， the contents of DA and 5-HT in hippocampus area of Banxiaxiexin Tang group （10 and 5 g·kg-1dose） was significantly increased. Banxiaxiexin Tang can significantly increase the expression of BDNF in brain tissue of frontal cortex， but had no significant effect on the serum levels of ET-1 and CGRP. Conclusion: Banxiaxiexin Tang has a significant effect on the levels of monoamine neurotransmitter in brain and BDNF expression in the frontal cortex of brain in aging model rat.

Banxiaxiexin Tang； aging rats； monoamine neurotransmitter； brain-derived neurotrophic factor

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R 285.5

A

1674-926X（2016）03-016-03

四川省應用基礎研究計劃項目（2013JY0190）；四川省省級公益性科研院所基本科研業(yè)務專項（A-2014N-12， A-2015N-5）

1.四川省中醫(yī)藥科學院藥理毒理所，四川 成都6100412；2.西南民族大學民族醫(yī)藥研究院，四川成都 610041

李利民，男，副研究員，主要從事中藥藥理毒理研究 Tel：13693496628 Email：llm_cd@163.com

張吉仲，男，副教授，主要從事中藥、民族藥復方藥理與毒理研究和教學Tel：13540891169 Email：daowen2005@126.com

2015-05-08