不同藥物與消毒劑對兔球蟲卵囊孢子化的影響

溫福利， 張 嘉， 鄭和平， 馬 雷， 張詩蘭， 王壽昆（.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院比較醫(yī)學科， 福州 35005；.福建農(nóng)林大學動物科學學院， 福州 35000）

不同藥物與消毒劑對兔球蟲卵囊孢子化的影響

溫福利1， 張 嘉2， 鄭和平1， 馬 雷1， 張詩蘭1， 王壽昆2
（1.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院比較醫(yī)學科， 福州 350025；
2.福建農(nóng)林大學動物科學學院， 福州 350002）

目的 對比研究不同抗兔球蟲藥物與消毒劑對兔球蟲卵囊孢子化過程的抑殺效果，為兔球蟲病的防治提供參考。方法 分別選取5種抗球蟲藥物和消毒劑進行抑制試驗，觀察它們對兔球蟲卵囊體外孢子化過程的影響。結果 （1） 5種抗球蟲藥物對兔球蟲卵囊孢子化抑制率大小依次為： 百球清＞優(yōu)求樂＞球抑＞球腸清＞腸球雙效，半數(shù)效量（EC50）大小依次為： 腸球雙效＞球腸清＞球抑＞優(yōu)求樂＞百球清； （2） 5種消毒劑對兔卵囊孢子化抑制率大小依次為： 二硫化碳＞苯酚＞氨水＞三氯異氰尿酸＞碘酊，半數(shù)效量大小依次為： 碘酊＞三氯異氰尿酸＞氨水＞苯酚＞二硫化碳； 半數(shù)孢子化時間依次為： 二硫化碳＞氨水＞苯酚＞三氯異氰尿酸＞碘酊。（3） 毒力較強的幾種兔球蟲卵囊耐藥性大小依次為： 大型艾美耳球蟲＞斯氏艾美耳球蟲＞無殘艾美耳球蟲＞腸型艾美耳球蟲。結論 15 mL/L百球清體外作用8 h對兔球蟲卵囊孢子化抑制效果最強。體積分數(shù)6%二硫化碳作用于卵囊4 h，抑制兔球蟲卵囊孢子化效果最好。兔球蟲卵囊耐藥性與蟲體大小相關，較大蟲體對藥物敏感性高。

兔； 球蟲??； 抗球蟲藥； 消毒劑； 卵囊孢子化

國內(nèi)外文獻［1-3］報道兔球蟲由16種艾美耳屬球蟲（Eimeria）和1種等孢屬（Isospora）球蟲構成， 其中以穿孔艾美耳球蟲為我國共患優(yōu)勢種［4］， 寄生于肝臟膽囊的斯氏艾美耳球蟲致病性最強， 以混合寄生最為常見［5，6］。兔球蟲病危害巨大， 以幼兔感染最為嚴重， 常導致幼兔死亡［7］。臨床上檢測母兔雖感染強度不高，但其幼兔易誤食母兔糞便而感染兔球蟲病， 所以母兔作為傳染源嚴重危害兔群的健康［8，9］。卵囊是兔球蟲與外界環(huán)境產(chǎn)生聯(lián)系的主要方式， 只有在外界環(huán)境中發(fā)育的孢子化卵囊才具有感染宿主的能力。切斷外界環(huán)境中卵囊的孢子化發(fā)育能很好控制兔球蟲病在兔群中的傳播［10-12］。薛占永等［13］曾報道了消毒劑對兔球蟲卵囊抑制率的研究， 但未對兔球蟲各種類卵囊抑制率進行進一步研究。目前， 關于抗球蟲藥物和消毒劑對兔球蟲卵囊孢子化過程影響的報道很少。

1 材料與方法

1.1 兔球蟲卵囊的采集

福州郊區(qū)某新西蘭兔養(yǎng)殖場及某有生產(chǎn)許可證的新西蘭兔生產(chǎn)單位［SCXK（閩）2014-0001］，采集剛排出的新鮮糞便樣本587份，分別裝入干凈自封袋，標上采集信息，用保溫箱帶回實驗室，置于4℃冰箱備查。

1.2 抗球蟲藥物與試驗濃度梯度

球抑， 南京福斯特牧業(yè)科技有限公司生產(chǎn)， 生產(chǎn)批號： 20111116； 優(yōu)求樂，廣州華大實驗獸藥有限公司生產(chǎn)， 生產(chǎn)批號13061801； 百球清， 拜耳（四川）動物保健有限公司生產(chǎn)， 生產(chǎn)批號CN25266； 球腸清， 廣州市廣畜動物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號： 20130101； 腸球雙效， 南京龍馬動物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)， 生產(chǎn)批號： 20130903。分別各設7組藥物濃度， 濃度分別為口服推薦劑量的1/10倍、1/2倍、推薦劑量、2倍、10倍、30倍和60倍（表1）。1.3 消毒劑與試驗濃度梯度

表1 不同藥物試驗用量

氨水，西隴化工股份有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號： 1309111； 甲醛溶液，西隴化工股份有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號： 1309252； 二硫化碳，西隴化工股份有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號： 1309262； 碘酊，山東利爾康消毒科技股份有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：1304198； 苯酚，國藥集團化學試劑有限公司，生產(chǎn)批號： 20120315。設置成6～7個濃度梯度（表2）。

表2 不同消毒劑等藥物試驗用量

1.4 卵囊孢子化試驗

將富集到的新鮮卵囊加入一定量的超純水進行倍比稀釋， 然后取混勻后稀釋液1 mL， 加入9 mL飽和食鹽水中混勻，用膠頭滴管將勻液注入麥克馬斯特計數(shù)板的小室內(nèi)， 靜置5 min。在生物顯微鏡下（100×）統(tǒng)計卵囊數(shù)量。若10 mL飽和食鹽水中卵囊總數(shù)為N， 按照公式N=［（n1+n2）/（2×0.15）］×10計算（每片計數(shù)室中的容積1 cm×1 cm×0.15 cm=0.15 cm3）。為減少誤差，應確保每毫升卵囊數(shù)為1 000個以上。取1 mL卵囊液裝入10 mL離心管中，加純水離心，去上清。在離心管加入不同濃度梯度的藥物1 mL，消毒劑組在室溫下分別作用1 h，2 h，4 h，抗球蟲藥物組在室溫下分別作用4 h， 6 h， 8 h。卵囊在室溫下經(jīng)藥物作用后，加入清水3 000 r/min離心4次，洗去離心管中藥物，加入質(zhì)量分數(shù)2.5%重鉻酸鉀，120 r/min、28 ℃置于搖床上進行培養(yǎng)。分別在12 h，24 h，36 h，48 h，60 h，72 h統(tǒng)計兔球蟲卵囊的孢子化率。在設定時間段用膠頭滴管對離心管中溶液吹吸2次，混勻， 取1～2滴于載玻片上， 蓋上蓋玻片， 生物顯微鏡（100×）統(tǒng)計卵囊孢子化率，油鏡下觀察拍照。

1.5 統(tǒng)計方法和判定標準

（1） 將卵囊內(nèi)部清晰可見內(nèi)、外殘體，斯氏體作為球蟲卵囊孢子化評價標準，卵囊孢子化率=孢子化卵囊數(shù)/觀測總卵囊數(shù)；孢子化抑制率=（觀測抑制率-對照組抑制率）/（ 1-對照組抑制率）； （2） 用SPSS16.0的probit模板分析藥物的半數(shù)孢子化時間EH50和半數(shù)效量EC50，將兔球蟲卵囊的半數(shù)孢子化時間EH50和藥物半數(shù)效量EC50作為藥物效價的評判標準； （3） 隨機以各藥物組中100個孢子化卵囊為一組，觀察4組，以不同種類兔球蟲卵囊所占比例，作為該類卵囊耐藥性的評價標準。

2 結果

2.1 抗球蟲藥物對卵囊孢子化影響

兔球蟲卵囊經(jīng)抗球蟲藥物作用不同時間后，搖床培養(yǎng)72 h，觀測兔球蟲卵囊孢子化抑制率，并經(jīng)對照組數(shù)據(jù)校正（表3）。

表3 抗球蟲藥物對卵囊孢子化影響

2.1.1 球抑 兔球蟲卵囊經(jīng)不同濃度組球抑分別作用不同時間后，納格浦爾艾美耳球蟲卵囊受藥物濃度和作用時間影響最小，穿孔艾美耳球蟲在各藥物組中卵囊孢子化比例都很高，均在25.75%以上，新兔艾美耳球蟲、腸型艾美耳球蟲、盲腸艾美耳球蟲及松林艾美耳球蟲卵囊隨著藥物濃度和作用時間改變，卵囊的孢子化過程也先后受到抑制。

2.1.2 優(yōu)求樂 作用卵囊4 h， 大型艾美耳球蟲卵囊孢子化比例在各藥物組中均較高，僅次于穿孔艾美耳球蟲和納格浦爾艾美耳球蟲。作用卵囊6 h后，穿孔艾美耳球蟲卵囊孢子化在濃度15 g/L中孢子化比例為28.75%，其余藥物濃度孢子化比例均維持在30%以上。作用卵囊8 h后，穿孔艾美耳球蟲隨著藥物濃度增大，孢子化比例下降至25%以下。

2.1.3 百球清 作用卵囊4 h，穿孔艾美耳球蟲卵囊孢子化比例隨著藥物濃度增大而減小，藥物濃度為15 mL/L時，卵囊孢子化比例不到30%。百球清作用卵囊6 h，松林艾美耳球蟲、維氏艾美耳球蟲及中型艾美耳球蟲卵囊孢子化受到抑制的濃度分別為0.5 mL/L、7.5 mL/L和15 mL/L。百球清各濃度作用卵囊8 h后對孢子化過程的影響與作用6 h的效果無明顯差異。

2.1.4 球腸清 作用卵囊4 h， 穿孔艾美耳球蟲卵囊孢子化比例在各濃度組中維持在30%以上。作用卵囊6 h，濃度在5 g/L時，穿孔艾美耳球蟲卵囊孢子化比例小于30%，濃度為15 g/L時，中型艾美耳球蟲與無殘艾美耳球蟲卵囊孢子化受到抑制。作用卵囊8 h，穿孔艾美耳球蟲于1 g/L，隨著藥物濃度增大，卵囊孢子化比例下降。

2.1.5 腸球雙效 作用卵囊4 h，60 g/L的藥物濃度對松林艾美耳球蟲卵囊孢子化起到抑制作用，其余藥物濃度均不能完全抑制卵囊孢子化。穿孔艾美耳球蟲卵囊在該濃度下孢子化比例較高，達35%。若藥物作用時間增加至8 h，孢子化比例35%的藥物作用濃度降至10 g/L。

2.2 消毒劑對兔球蟲卵囊孢子化影響

兔球蟲卵囊經(jīng)消毒劑等5種藥物作用不同時間后，搖床培養(yǎng)72 h，觀測兔球蟲卵囊孢子化抑制率，并經(jīng)對照組數(shù)據(jù)校正（表4）。

表4 消毒劑對兔球蟲卵囊孢子化影響

2.2.1 氨水 作用卵囊1 h，體積分數(shù)8%的氨水對松林艾美耳球蟲卵囊孢子化起到完全抑制； 體積分數(shù)為20%時，能完全抑制維氏艾美耳球蟲與無殘艾美耳球卵囊孢子化。作用卵囊2 h，體積分數(shù)8%的氨水對腸型艾美耳球蟲卵囊孢子化受到完全抑制；體積分數(shù)為20%時，盲腸艾美耳球蟲與中型艾美耳球蟲卵囊孢子化受到完全抑制。穿孔艾美耳球蟲卵囊孢子化比例在氨水各體積分數(shù)中均維持在25%以上。作用卵囊4 h， 體積分數(shù)為8%時， 盲腸艾美耳球蟲、松林艾美耳球蟲和中型艾美耳球蟲卵囊孢子化受到完全抑制； 當體積分數(shù)為10%時， 無殘艾美耳球蟲卵囊孢子化受到完全抑制； 體積分數(shù)為20%時， 僅穿孔艾美耳球蟲、大型艾美耳球蟲、納格浦爾艾美耳球蟲和微小艾美耳球蟲卵囊發(fā)生孢子化。2.2.2 碘酊 作用卵囊1 h， 體積分數(shù)8%的碘酊濃度能完全抑制腸型艾美耳球蟲卵囊孢子化，而穿孔艾美耳球蟲卵囊孢子化比例最高，達34.50%； 體積分數(shù)為16%時，松林艾美耳球蟲卵囊孢子化受到完全抑制； 當?shù)怍w積分數(shù)增大至30%時，中型艾美耳球蟲與無殘艾美耳球蟲卵囊孢子化可完全抑制。作用卵囊2 h， 體積分數(shù)為16%時， 松林艾美耳球蟲卵囊孢子化受到完全抑制，當?shù)怍w積分數(shù)增大至30%時， 中型艾美耳與無殘艾美耳球蟲卵囊孢子化受到完全抑制。作用卵囊4 h，體積分數(shù)為8%時， 無殘艾美耳球蟲卵囊孢子化受到完全抑制； 體積分數(shù)為16%時， 松林艾美耳球蟲卵囊孢子化受到完全抑制； 體積分數(shù)為20%時， 穿孔艾美耳球蟲卵囊孢子化比例最低至25%； 當體積分數(shù)增大至30%，僅穿孔艾美耳球蟲、納格浦爾艾美耳球蟲、大型艾美耳球蟲和斯氏艾美耳球蟲卵囊發(fā)生孢子化。

2.2.3 二硫化碳 作用卵囊1 h， 體積分數(shù)為1%的二硫化碳可完全被抑制腸型艾美耳球蟲與松林艾美耳球蟲卵囊的孢子化過程，而穿孔艾美耳球蟲卵囊孢子化比例高達40%；體積分數(shù)為6%時，僅穿孔艾美耳球蟲、納格浦爾艾美耳球蟲、大型艾美耳球蟲和微小艾美耳球蟲卵囊發(fā)生孢子化。作用卵囊2 h， 體積分數(shù)為0.5%時，松林艾美耳球蟲卵囊孢子化受到完全抑制； 體積分數(shù)為6%時， 斯氏艾美耳球蟲卵囊孢子化受到完全抑制。作用卵囊4 h，體積分數(shù)為2%時，納格浦爾艾美耳球蟲、穿孔艾美耳球蟲、大型艾美耳球蟲和微小艾美耳球蟲卵囊仍有發(fā)生孢子化。

2.2.4 苯酚 作用卵囊1 h， 體積分數(shù)為4%的苯酚能完全抑制新兔艾美耳球蟲卵囊孢子化；體積分數(shù)為10%時，盲腸艾美耳球蟲、維氏艾美耳球蟲和中型艾美耳球蟲卵囊孢子化受到完全抑制。作用卵囊2 h，體積分數(shù)為4%時，無殘艾美耳球蟲卵囊孢子化受到完全抑制，斯氏艾美耳球蟲卵囊孢子化比例達10%； 當苯酚體積分數(shù)增大至10%時，能完全抑制兔球蟲卵囊孢子化。作用卵囊4 h，體積分數(shù)為4%時，維氏艾美耳球蟲與無殘艾美耳球蟲卵囊孢子化受到完全抑制； 體積分數(shù)為10%時，能完全抑制所有兔球蟲卵囊孢子化。

2.2.5 三氯異氰尿酸 作用卵囊1 h， 濃度為40 g/L時，穿孔艾美耳球蟲卵囊孢子化比例大于40%。作用卵囊2 h，濃度為10 g/L時，穿孔艾美耳球蟲卵囊孢子化比例達35%，隨著藥物濃度增大，孢子化比例呈下降趨勢； 作用卵囊4 h，無殘與維氏艾美耳球蟲卵囊孢子化分別在30 g/L與40 g/L時卵囊孢子化受到完全抑制。

3 討論

3.1 抗球蟲藥物及消毒劑對兔球蟲卵囊孢子化的抑制效果

通過試驗發(fā)現(xiàn)， 抗球蟲藥物對兔球蟲卵囊體外作用后的孢子化過程抑制效果欠佳， 消毒劑具有很好的抑殺效果?？骨蛳x藥物體外作用8 h， 以15 mL/L百球清對兔球蟲卵囊孢子化抑制效果最強。消毒劑中二硫化碳抑制兔球蟲卵囊孢子化效果最好，6%的二硫化碳濃度作用于卵囊4 h，能完全抑制兔球蟲卵囊的孢子化過程。5種藥物對兔球蟲卵囊孢子化抑制率大小依次為： 百球清＞優(yōu)求樂＞球抑＞球腸清＞腸球雙效，抗球蟲藥物半數(shù)效量大小依次為： 腸球雙效＞球腸清＞球抑＞優(yōu)求樂＞百球清。5種消毒劑藥物對兔球蟲卵囊孢子化抑制率大小依次為： 二硫化碳＞苯酚＞氨水＞三氯異氰尿酸＞碘酊； 消毒劑半數(shù)效量大小依次為： 碘酊＞三氯異氰尿酸＞氨水＞苯酚＞二硫化碳； 半數(shù)孢子化時間大小依次為： 二硫化碳＞苯酚＞氨水＞三氯異氰尿酸＞碘酊。

3.2 兔球蟲卵囊大小與消毒劑作用下孢子化率關系

本試驗研究表明， 在各類藥物不同濃度作用不同時間后，納格浦爾艾美耳球蟲卵囊受藥物濃度和作用時間影響較小，可見納格浦爾艾美耳球蟲卵囊耐藥性較強。當8%二硫化碳作用兔球蟲卵囊2 h時，僅穿孔艾美耳球蟲與納格浦爾艾美耳球蟲卵囊發(fā)生孢子化，納格浦爾艾美耳球蟲卵囊孢子化比例為96%，穿孔艾美耳球蟲卵囊孢子化比例為4%，穿孔艾美耳球蟲卵囊耐藥性僅次于納格浦爾艾美耳球蟲。體積分數(shù)為20%氨水作用卵囊1 h后，僅穿孔艾美耳球蟲、納格浦爾艾美耳球蟲、微小艾美耳球蟲和大型艾美耳球蟲卵囊發(fā)生孢子化，其中微小艾美耳球蟲和大型艾美耳球蟲卵囊孢子化比例分別為16.25%與6.5%，可見微小艾美耳球蟲卵囊對該藥物抵抗能力要強于大型艾美耳球蟲卵囊。穿孔艾美耳球蟲，納格浦爾艾美耳球蟲與微小艾美耳球蟲卵囊體積較小， 平均長度均在25 μm以下， 其余艾美耳球蟲卵囊長度均大于25 μm。通過對比表明，體積越小的兔球蟲卵囊越容易發(fā)生孢子化， 對藥物抵抗能力越強，而體積越大的兔艾美耳球蟲卵囊孢子化越易受到藥物影響，不容易發(fā)生孢子化。

3.3 氨水評價幾種兔球蟲卵囊的耐藥性

對比毒力較強艾美耳球蟲卵囊孢子化抑制率發(fā)現(xiàn)， 4%氨水作用4 h， 毒力極強的腸型艾美耳球蟲卵囊發(fā)生孢子化比例為2.75%； 8%氨水作用4 h，毒力較強的無殘艾美耳球蟲卵囊孢子化比例為2.00%；10%氨水作用4 h， 除毒力較強的大型艾美耳球蟲卵囊仍有發(fā)生孢子化外，毒力最強的斯氏艾美耳球蟲卵囊孢子化比例降為2.75%； 20%氨水作用4 h，毒力較強的大型艾美耳球蟲卵囊孢子化比例為6.5%，其余毒力較強的艾美耳球蟲卵囊孢子化均受到完全抑制?？梢姡玖^強的兔球蟲卵囊耐藥性大小依次為： 大型艾美耳球蟲＞斯氏艾美耳球蟲＞無殘艾美耳球蟲＞腸型艾美耳球蟲。在兔球蟲凈化過程中，應注意抗球蟲藥物和消毒劑的選擇，將抑殺重點放在毒力較大且耐藥性較強的卵囊上。

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Effects of Different Drugs and Disinfectants on Sporulation of Coccidian Oocysts in Rabbit

WEN Fu-li1， ZHANG Jia2， ZHENG He-ping1， MA Lei1， ZHANG Shi-lan1， WANG Shou-kun2
（1.Department of Comparative Medicine， Fuzhou General Hospital of Nanjing Command，PLA， Fuzhou 350025， China； 2.College of Animal Science，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002， China）

Objective To study inhibitory effect of different drugs and disinfectants on coccidian oocyst sporulated in rabbit， and to provide reference for the prevention and treatment of rabbit coccidiosis.Methods Selected 5 kinds of drugs and disinfectant for gradient test， respectively.To observe their effects on sporulation process of rabbit coccidia oocysts in vitro.Results （1） Inhibition test was performed under 5 kinds of anticoccidial drugs.The drugs of inhibition rate for coccidian oocyst sporulated were shown in turns： Toltrazuril Solution ＞ Decoquinate Premix ＞ Dinitolmide Premix ＞ Diclazuril Premix ＞ Amprolium Hydrochloride and sulfaquioxaline Sodium.The median effect concentration （EC50）were shown as follows： Amprolium Hydrochloride and sulfaquioxaline Sodium ＞ Diclazuril Premix ＞Dinitolmide Premix ＞ Decoquinate Premix ＞ Toltrazuril Solution.Take 15 mL/L Toltrazuril Solution effect of 8h has the strongest inhibitory on the sporulation of rabbit coccidian oocysts.（2） The rate of 5 kinds of disinfectants which inhibit rabbit coccidian oocyst from being sporulated was shown as follows：Carbon disulfide ＞ Phenol ＞ Ammonia ＞ Symclosene ＞ Tincture of iodine.The EC50were shown as follows：Tincture of iodine ＞ Symclosene ＞ Ammonia ＞ Phenol ＞ Carbon disulfide.The hours for 50% of maximal effect （EH50） were shown as follows：Carbon disulfide ＞ Phenol ＞ Ammonia ＞ Symclosene ＞Tincture of iodine.（3） The drug resistance of rabbit coccidiosis oocysts with strong toxicity were shown as follows： E.magna ＞ E.stieda ＞ E.irresidu ＞ E.intestinal.Conclusions The 15 mL/L toltrazuril solution with effect of 8 h has the strongest inhibitory on the sporulation of rabbit coccidian oocysts.Carbon disulfide at concentration of 6% with effect of 4 h can completely inhibit rabbit coccidian oocysts from being sporulated.Drug resistance to rabbit coccidia oocysts was associated with body size of the parasite， and the larger body size with high sensitivity.

Rabbit； Coccidiosis； Anticoccidial drugs； Disinfectants； Sporulated oocysts

R332， Q95-33

A

1674-5817（2016）04-0301-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.04.011

2016-05-30

福建省科技計劃引導性項目（2015Y0075）和南京軍區(qū)福州總醫(yī)院臨床應用研究專項（2015L01）

溫福利（1987-）， 男， 技師， 主要從事實驗動物寄生蟲研究。E-mail： wen_fuli@163.com

王壽昆（1956-）， 男， 漢族， 教授， 主要從事獸醫(yī)寄生蟲方面的研究。E-mail： wsk138@163.com