小鼠顯微外科血管插管活體手術(shù)模型使用與維護操作

蘇 紅， 王亞飛， 谷元亮， 趙進順， 鄒寶波（寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系， 寧波 315211）

小鼠顯微外科血管插管活體手術(shù)模型使用與維護操作

蘇 紅， 王亞飛， 谷元亮， 趙進順， 鄒寶波
（寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系， 寧波 315211）

小鼠顯微外科血管插管手術(shù)模型是一種用途廣泛的實驗研究模型， 與體外細胞實驗相比，更接近人體的實際狀況。但在動物模型制作與使用過程中，相對標準的操作規(guī)程可以確保動物模型在統(tǒng)一的標準下制作、使用與維護，這樣可以使不同實驗室之間的實驗結(jié)果具有可比性。因此，在建立活體動物模型的同時，對模型制作與使用過程中的操作規(guī)程進行優(yōu)化研究，對該類模型的推廣使用具有十分重要的意義。

小鼠； 血管插管； 手術(shù)模型； 操作規(guī)程

在生命科學(xué)中，人類的健康和福利研究都離不開動物實驗。醫(yī)學(xué)史上許多科學(xué)家采用動物模型獲得重大發(fā)現(xiàn)，如早在1912年Carrel通過動物實驗，開創(chuàng)了血管與器官移植的實驗研究，并因此獲得諾貝爾生理學(xué)與醫(yī)學(xué)獎。然而，很多動物模型的制作離不開顯微外科技術(shù)［1］。近年來，顯微外科手術(shù)技術(shù)已經(jīng)在大動物（如豬、犬、兔等）［2-4］的活體模型建立中得到了廣泛應(yīng)用，利用大鼠制作動物模型的顯微外科手術(shù)研究也很多［5-8］。但是由于大動物價格昂貴，純系品種來源困難，使其應(yīng)用受到了限制。而小鼠因為具有品系較純、來源廣、價格便宜、試劑來源多、免疫學(xué)檢測方便，且其在食物結(jié)構(gòu)、生理、生化和發(fā)育過程與人類較為接近，小鼠基因和人類基因有大于80%的同源性等優(yōu)點，利用小鼠制作活體動物模型進行器官移植及心肌梗死等研究的越來越普遍［9-12］。

作者采用顯微外科技術(shù)， 已建立多種小鼠血管內(nèi)活體插管手術(shù)實驗?zāi)Ｐ停?3，14］， 本文探討在手術(shù)模型使用與維護過程中的標準化操作及實驗適用條件。

1 手術(shù)后插管的連接

手術(shù)后將動脈、靜脈的血管插管分別與微分析旋轉(zhuǎn)輸液閥（美國 Instech laboratories， Inc，型號375/d/22qm）（圖1）的下端、側(cè)端導(dǎo)管連接。旋轉(zhuǎn)輸液閥上端、側(cè)端再與微量輸液泵（美國 Braintree Scientific， Inc，型號BS-8000）（圖2）上的注射器相連接。手術(shù)后通過輸液泵持續(xù)不斷地輸入20單位肝素，以保證動脈、靜脈插管的通暢。

從旋轉(zhuǎn)輸液閥上引出的動脈導(dǎo)管先與一個Y型導(dǎo)管的下端連接（圖3），導(dǎo)管Y頭一端與微量輸液泵連接，另一端與信號轉(zhuǎn)換系統(tǒng)（美國DATAG Instruments， Inc.型號DI720系列）連接。信號通過軟件轉(zhuǎn)換在計算機屏幕上顯示出小鼠的血壓、心率（圖4）。而通過軌跡信號放大系統(tǒng)則可以顯示動脈導(dǎo)管的通暢程度。若發(fā)現(xiàn)軌跡變窄或成一條直線，說明動脈導(dǎo)管即將或堵塞。

2 手術(shù)后從動脈插管獲取血液標本

模型建立后，從靜脈導(dǎo)管注射營養(yǎng)成分、藥物與毒物后，需要從動脈導(dǎo)管采集血液樣本進行分析。通過采集血液標本，分離血清檢測血液中各種成分的變化，分析研究因素的作用。采血方法：用一個小的血管夾夾住靠近旋轉(zhuǎn)輸液閥插管的一端，將動脈插管與旋轉(zhuǎn)輸液閥分開，并與26G針頭的1 mL注射器（內(nèi)含20 U肝素）連接。松開血管夾回抽血液，待血液到達針頭處停止，再用血管夾夾住插管， 更換另一個干凈的注射器，松開血管夾回抽100 μL血液（用于實驗研究）。再次夾住插管， 更換先前的注射器，并將血液推還回血管中。最后一次夾住插管，將插管與旋轉(zhuǎn)輸液閥上的導(dǎo)管連接， 即完成了1次從動脈插管采血。作者在動物手術(shù)后2 d開始從動脈導(dǎo)管中采集血液，每日1次，每次100 μL，連續(xù)5 d，觀察小鼠均無異常。

圖1 微分析旋轉(zhuǎn)輸液閥

圖2 微量輸液泵

圖3 Y型導(dǎo)管

圖4 信號顯示器

3 動脈導(dǎo)管采血間隔時間與采血量

由于小鼠體型較小， 血容量也只有1 mL左右，如果需每日多次采血，又不影響動物的健康及實驗結(jié)果的準確性，最佳的采血方法為： 采血后，將離心取得血漿后的血細胞再用肝素稀釋后重新輸回小鼠體內(nèi)，以免多次抽血而引起動物貧血。即在當(dāng)日不同時間點采血，每次100 μL，分離血漿保存（用于危險因素的研究等）。分離的血細胞用20 μL （100 U/mL）肝素生理鹽水混懸后，再回輸?shù)叫∈篌w內(nèi)。作者在用小鼠做糖鉗夾實驗時，每10 min采血1次，均按上述方法進行，實驗持續(xù)4 h，結(jié)果顯示小鼠活動均正常。

4 動脈管堵塞的相關(guān)因素

動物模型建立后最易發(fā)生動脈導(dǎo)管堵塞， 其影響因素為： 動脈導(dǎo)管的粗細、導(dǎo)管固定的牢固程度、肝素的給予量和微量注射泵系統(tǒng)是否有氣泡等。

作者在手術(shù)過程中使用不同粗細的導(dǎo)管，結(jié)果表明內(nèi)徑0.30 mm，外徑0.64 mm的導(dǎo)管較好，太粗不易插入； 太細雖然方便插入，但易堵塞。

手術(shù)后， 通過輸液泵持續(xù)輸入不同濃度（10 U/mL、20 U/mL、30 U/mL）肝素，以流速12～15 μL/h輸送入動脈插管內(nèi)各12例，觀察動脈管的堵塞時間及手術(shù)部位的出血情況，結(jié)果表明，使用濃度為10 U/mL肝素， 動脈導(dǎo)管易堵塞； 使用濃度為30 U/mL肝素，手術(shù)部位易出血。使用20 U/mL肝素的條件下，動脈導(dǎo)管可以暢通使用6.0±2.5 d。

任何時間都要注意保持輸液系統(tǒng)管路內(nèi)沒有氣泡。因此，需每日2次檢查計算機屏幕，若發(fā)現(xiàn)軌跡變窄或成一條細線（如圖4屏幕上顯示的第2條細線），說明該小鼠的動脈插管已經(jīng)狹窄或堵塞。若發(fā)現(xiàn)較早，立即用連接26G針頭的1 mL注射器（內(nèi)含20 U肝素）人工沖洗，可能使插管重新通暢，計算機屏幕上顯示的壓力軌跡又變寬（如圖4顯示的第1條軌跡）。

5 靜脈導(dǎo)管持續(xù)工作時間影響因素

待小鼠恢復(fù)正?；顒雍螅ㄒ话闱闆r下，術(shù)后2 d即恢復(fù)），用注射泵通過股靜脈持續(xù)注入研究因素。作者分別給予0.9%生理鹽水（200 μL/h）、50%葡萄糖（100 μL/h）和脂肪乳（100 μL/h），觀察3組靜脈導(dǎo)管工作時間。結(jié)果表明，第1組維持時間最長（3周），第3組最短（僅1周），說明靜脈導(dǎo)管持續(xù)工作時間的長短與輸入液體的粘稠度有關(guān)。另外，靜脈導(dǎo)管極易因感染而滲漏，從而影響靜脈導(dǎo)管工作時間。

6 導(dǎo)管系統(tǒng)細菌污染相關(guān)因素

進行該類手術(shù)，最易發(fā)生血液系統(tǒng)的感染。手術(shù)時無菌程度及術(shù)后旋轉(zhuǎn)輸液閥、微量注射泵系統(tǒng)的潔凈程度，手術(shù)后通過輸液泵持續(xù)輸入液體的無菌狀況等，均是導(dǎo)致感染的危險因素。

理論上，一例動物實驗結(jié)束后，應(yīng)全面更換輸液系統(tǒng)的管路，這是確保系統(tǒng)無菌的最佳辦法。但在實際工作中，通常難以做到。因為更換一套系統(tǒng)需要增加很多工作量，且更換后的管路經(jīng)常有氣泡存在，管路中的氣泡極易造成動脈管的堵塞，使手術(shù)模型失去使用價值。

因此，在按嚴格無菌操作技術(shù)規(guī)范進行系統(tǒng)處理的狀態(tài)下，觀察管路無菌持續(xù)的時間，以尋找最佳的管路更換時間。實驗方法為采集手術(shù)后不同時間點的旋轉(zhuǎn)輸液閥動、靜脈插管連接處管路中的液體（0.2 mL）進行細菌培養(yǎng)（采用涂擦法）， 37 ℃，18～24 h觀察細菌生長情況，在一切均按嚴格無菌操作情況下，導(dǎo)管通?？梢猿掷m(xù)工作4周而沒有污染（即所有管路均無細菌生長）。

7 導(dǎo)管、管路消毒與保潔

手術(shù)前， 對已經(jīng)制成J型的塑料導(dǎo)管［13，14］以及其他輸液管路的塑料導(dǎo)管用環(huán)氧乙烷（EO）滅菌。對固定設(shè)備如旋轉(zhuǎn)輸液閥的處理方法為： 先用500 mg/L含氯消毒劑沖洗一遍，再用體積分數(shù)75%乙醇沖洗，最后用0.9%無菌生理鹽水沖洗。每例實驗前，對旋轉(zhuǎn)輸液閥按上述方法處理以備使用。每4周對所有管路及微量注射泵系統(tǒng)按同樣方法進行清洗消毒。處理后的導(dǎo)管晾干，放入專用包裝袋中EO消毒。

作者的經(jīng)驗表明，血液系統(tǒng)的感染多與旋轉(zhuǎn)輸液閥及微量注射泵系統(tǒng)污染有關(guān)。若嚴格按規(guī)定操作，手術(shù)后小鼠血液系統(tǒng)的感染率較低。若為免疫低下動物或手術(shù)后給予免疫抑制劑者，在采血過程中更要嚴格按無菌技術(shù)操作。

8 小結(jié)與展望

小鼠顯微外科血管插管活體手術(shù)模型是一種用途廣泛的實驗研究模型， 與體外細胞實驗相比， 其更接近人體的實際狀況。目前， 國外研究機構(gòu)已經(jīng)開始采用該模型進行多方面的醫(yī)學(xué)實驗研究［15-17］，但國內(nèi)少見該手術(shù)實驗?zāi)Ｐ图夹g(shù)建立和應(yīng)用的研究報道。

1990年代以來，隨著顯微外科技術(shù)發(fā)展，一些以大動物為對象的動物模型正在逐漸被小動物模型取代［18，19］，以小鼠為實驗?zāi)Ｐ偷娘@微外科實驗研究正在逐年增加。尤其是近年來，小鼠活體血管插管顯微外科技術(shù)已經(jīng)在藥物代謝、糖尿病與肥胖機理研究中得到應(yīng)用［19，20］。值得注意的是，盡管國外已經(jīng)有學(xué)者用小鼠活體血管插管手術(shù)模型進行醫(yī)學(xué)研究，但尚缺乏模型標準化操作規(guī)程及實驗適用條件方面的研究。各實驗室都是按照自己的方法進行手術(shù)、術(shù)后維護及模型動物的使用等。鑒于該類模型動物是在清醒、自由活動與進食狀態(tài)下進行的連續(xù)動態(tài)實驗，手術(shù)的麻醉方式、手術(shù)過程中的失血量多少、手術(shù)中的保暖措施、手術(shù)過程中的無菌技術(shù)、手術(shù)所用的導(dǎo)管粗細及材質(zhì)材料等均可能對模型動物產(chǎn)生影響。因此，相對標準的操作規(guī)范可以確保動物模型在統(tǒng)一的標準下制作、維護與使用，這樣可以使不同實驗室間的實驗結(jié)果具有可比性。在建立活體動物模型的同時，對模型制作過程中的操作規(guī)程進行優(yōu)化研究，對該類模型的推廣使用具有十分重要的意義。

在醫(yī)學(xué)研究飛速發(fā)展的今天， 新的藥物和食物不斷開發(fā)成功， 而新的或潛在的毒物也在不斷產(chǎn)生。為確保人類的健康與安全， 研究者需要通過活體動物模型對藥物、毒物、營養(yǎng)物等在體內(nèi)的代謝、生理和病理作用進行動態(tài)連續(xù)觀察，以探索人類疾病的發(fā)病機理、藥物的作用機制、疾病預(yù)防的效果等。隨著我國科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，醫(yī)學(xué)研究要達到或趕超國際先進水平，建立活體血管插管動物模型，提供科研實驗平臺顯得尤為重要與迫切。

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B

1674-5817（2016）04-0310-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.04.013

2016-03-07

國家自然科學(xué)基金（81273111）， 浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計劃項目（2015C37117， 2015C33148）

蘇 紅（1991-）， 女， 碩士研究生， 研究方向： 勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)。E-mail： suhong0908@126.com

鄒寶波， 副主任技師。E-mail： zoubaobo@nbu.edu.cn