臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對難治性腎病綜合征的療效觀察

李俊霞周欣諭丘美蘭陳建譚建明

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臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對難治性腎病綜合征的療效觀察

李俊霞1周欣諭1丘美蘭2陳建1譚建明3

目的 探討臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UCMSC）治療難治性原發(fā)性腎病綜合征（PNS）的初步療效與安全性。方法 選取2010年8月至2015年1月難治性PNS患者30例，自愿接受UCMSC治療，所有患者符合難治性PNS診斷標(biāo)準(zhǔn)，且均經(jīng)腎活檢證實(shí)病理類型，免疫抑制治療未緩解或反復(fù)復(fù)發(fā)。分析UCMSC治療PNS的療效、不良反應(yīng)及復(fù)發(fā)率情況。采用單因素重復(fù)測量方差分析和廣義線性混合模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較治療前后差異。結(jié)果 經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后得出:（1）UCMSC治療前后24h尿蛋白定量比較顯示:治療前0周（3.84g/d）與治療后4周（2.53g/d）、8周（1.12g/d）、16周（0.66g/d）、24周（0.57g/d）之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）；血漿白蛋白比較顯示:治療前0周［（24.07±7.30）g/L］與治療后4周［（29.50±7.92）g/L］、8周［（31.58±7.94）g/L］、16周［（33.43±7.86）g/L］、24周［（35.57±7.68）g/L］之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）；總蛋白比較顯示:治療前0周［（50.03±7.82）g/L］與治療后4周［（56.83±8.82）g/L］、8周［（58.9±7.94）g/L］、16周［（60.93±8.25）g/L］、24周［（64.6±8.52）g/L］之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜.01）；治療前后膽固醇的比較顯示，UCMSC治療前0周［（8.62±2.94）mmol/L］與治療后8周［（8.0±2.91）mmol/L］、16周［（7.31±2.58）mmol/L］、24周［（6.60±2.07）mmol/L］之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。（2）完全緩解15例，50%；部分緩解6例，20%；無效9例，30%。（3）在整個(gè)UCMSC輸注過程及觀察過程中并發(fā)癥輕，對癥處理后均痊愈。結(jié)論 本研究表明UCMSC對改善難治性PNS病情及防止PNS的復(fù)發(fā)有積極作用，臨床緩解率高、起效較快且并發(fā)癥較少，其遠(yuǎn)期療效仍需進(jìn)一步觀察。

腎病綜合征；臍帶；間充質(zhì)干細(xì)胞；治療結(jié)果

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2010年8月至2015年1月我院自愿接受UCMSC治療的難治性PNS患者30例，均符合激素治療依賴或抵抗的難治性腎病綜合征診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］，方案呈報(bào)倫理通過，入選前簽署知情同意書。排除以下情況:（1）血肌酐大于265.2μmol/L；（2）嚴(yán)重心肺功能障礙；（3）伴有嚴(yán)重感染；（4）肝酶顯著異常，超過正常值2倍；（5）其他:血壓顯著升高，治療后仍控制不佳或血糖明顯異常等；（6）妊娠。

二、治療方案

1、UCMSC來源:同種異體UCMSC來源于我院福建省移植生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。取新鮮足月產(chǎn)新生兒臍帶，磷酸鹽緩沖液沖洗，分離出沃頓膠，消化過夜，離心洗滌，LG-DMEM培養(yǎng)基接種，培養(yǎng)［5］。鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原。

2、UCMSC輸注:外周靜脈輸注，治療前半個(gè)小時(shí)予緩慢靜推地塞米松5mg，肌肉注射異丙嗪25mg，皮下注射低分子肝素2500U，采取外周靜脈輸注途徑，每隔1周輸注1次，輸注量為這（1～2）×106個(gè)/kg/次，4次為一療程，輸注體積約30～50ml。輸注中及輸注后12h觀察患者有無過敏、寒戰(zhàn)、心悸、胸悶、發(fā)熱、皮膚瘙癢、皮疹、抽搐、惡心嘔吐等，出現(xiàn)不良反應(yīng)者給予對癥處理。

3、激素及其他免疫抑制劑的應(yīng)用:口服醋酸潑尼松，0.8～1.0mg?kg-1?d-1服用8周，逐漸減量，每兩周減5mg，減量至10mg/d維持。其中膜性腎病患者在激素減量至0.5mg?kg-1?d-1時(shí)加用雷公藤多苷口服20mg，每天3次。同時(shí)所有患者均給予對癥處理［6］。

4、觀察指標(biāo):于治療前（0周），治療后第4、8、16、24周幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)，測定以下指標(biāo)，包括:血常規(guī)、尿常規(guī)；血清白蛋白、總蛋白、腎功能指標(biāo)［血清肌酐（serum creatinine，SCr）和尿素氮］、膽固醇；并留取24h小便測定尿蛋白定量。根據(jù)EPI公式計(jì)算腎小球?yàn)V過率（estimated glomerular fltration rate，eGFR）。完成4次UCMSC治療后，繼續(xù)隨訪1年，觀察復(fù)發(fā)情況。

日本雕塑家新宮(SusumuShingu)是一位自上世紀(jì)70年代以來一直活躍在動(dòng)態(tài)雕 塑領(lǐng)域的藝術(shù)家，他的作品大都從大自然中來。他是一位仍然堅(jiān)持用最簡單、 原始的一套動(dòng)態(tài)藝術(shù)原理制作動(dòng)態(tài)雕塑的藝術(shù)家。并且，與考爾德雕塑的強(qiáng)大自然動(dòng)力形式不同的是新宮晉的動(dòng)態(tài)雕塑中所體現(xiàn)出的“自然哲思”（見圖6）。

三、療效評價(jià)

（1）完全緩解:24h尿蛋白＜0.5g/L，血漿白蛋白正常范圍，SCr穩(wěn)定（升高不超過15%）；（2）部分緩解:尿蛋白減少≥50%，且血漿白蛋白≥30g/L，Scr穩(wěn)定（升高不超過15%）；（3）無效:尿蛋白定量≥3.5g/24h；或尿蛋白定量在0.3～3.0g/24h，但血漿白蛋白＜30g/L；或SCr升高＞30%?？偩徑饴蕿橥耆徑夂筒糠志徑庵汀?/p>

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS18.0進(jìn)行處理，接受UCMSC治療的患者基線特征及各項(xiàng)臨床指標(biāo)正態(tài)分布通過±s表示，非正態(tài)分布通過中位數(shù)表示，患者治療前后各項(xiàng)指標(biāo)比較正態(tài)分布采用單因素重復(fù)測量方差分析，非正態(tài)分布采用廣義線性混合模型；UCMSC治療后患者療效、復(fù)發(fā)率和并發(fā)癥發(fā)生率通過百分比（%）表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、研究對象的基線特征

患者行UCMSC治療前的基線特征見表1，30例患者中男23例，女7例，激素抵抗型12例，激素依賴型18例。病理類型:系膜增生性腎小球腎炎15例，微小病變6例，膜增殖性腎小球腎炎2例，局灶節(jié)段腎小球硬化2例，膜性腎病5例。

表1 30例患者UCMSC治療前基線特征

二、UCMSC治療前后各項(xiàng)臨床指標(biāo)比較（見表2）

表2 UCMSC治療前后各項(xiàng)生化指標(biāo)變化（中位數(shù)，± s）

表2 UCMSC治療前后各項(xiàng)生化指標(biāo)變化（中位數(shù)，± s）

注:與治療前比較，aP＜0.05；與治療后4周比較；bP＜0.05；與治療后8周比較cP＜0.05；與治療后16周比較dP＜0.05

時(shí)間　　例數(shù)　24 h尿蛋白定量（g/d）總蛋白（g/L）白蛋白（g/L）肌酐（μmol/L）eGFR（ml/min ·1.73m2）膽固醇（mmol/L）治療前　30　3.48　24.07 ± 7.30　50.03 ± 7.82　81.53 ± 29.14　108.35 ± 29.57　8.62 ± 2.94治療后4周　30　 2.53a　29.50 ± 7.92a　56.83 ± 8.82a　75.70 ± 25.66　114.17 ± 30.19　8.33 ± 2.97治療后8周　30　 1.12ab　31.58 ± 7.94ab　58.90 ± 7.94ab　77.27 ± 22.97　111.72 ± 26.92 　8.00 ± 2.91ab治療后16周　30　 0.66abc　33.43 ± 7.86abc60.93 ± 8.25abc　77.30 ± 17.74　110.77 ± 22.22　7.31 ± 2.58abc治療后24周　30　 0.57abcd　35.57 ± 7.68abcd64.60 ± 8.52abcd　74.47 ± 16.40　113.63 ± 24.05　6.60 ± 2.07abcdF 值　13.200　43.938　46.972　1.322　1.091　23.621 P 值　 0.000　 0.000　 0.000　0.275　0.349　 0.000

治療前后24h尿蛋白定量、血漿白蛋白、總蛋白的比較顯示，UCMSC治療前（0周）與治療后4周、8周、16周、24周比較，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；膽固醇治療前后比較顯示，UCMSC治療前（0周）與治療后8周、16周、24周差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。治療前（0周）與治療后4周之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。SCr與eGFR治療前后均無明顯差異（P＞0.05）。

三、療效分析（表3）

表3 各時(shí)間點(diǎn)療效分析

四、復(fù)發(fā)情況

30例治療后隨訪12個(gè)月，復(fù)發(fā)5例，復(fù)發(fā)率16.7%。其中激素抵抗型2例，激素依賴型3例。病理類型分別為微小病變2例，系膜增生性腎小球腎炎1例，膜性腎病2例。復(fù)發(fā)5例中2例因上呼吸道感染，1例因激素停用，1例因腹瀉，1例無特殊原因?qū)е?4h尿蛋白定量增加≥1.0g。復(fù)發(fā)后及時(shí)調(diào)整激素用量、對癥處理，4例均再次緩解，僅有1例膜性腎病方案調(diào)整為激素再次加至足量，并聯(lián)合雷公藤口服20mg，每天3次，患者24h尿蛋白定量仍＞3.5g/d，效果不佳。

五、UCMSC治療并發(fā)癥

UCMSC治療過程中發(fā)熱2例（6.7%），惡心、嘔吐3例（10%），皮疹1例（3.3%），腹瀉2例（6.7%），肝功能異常1例（3.3%），均表現(xiàn)較輕微，給予對癥處理后痊愈。

討 論

PNS是腎科常見的疾病，但目前PNS發(fā)病機(jī)理尚未完全闡明，難治性腎病綜合征占腎病綜合征的30%～50%，一般指的是激素抵抗型、激素依賴型、復(fù)發(fā)型或者激素使用禁忌、激素不耐受的腎病綜合征。難治性腎病綜合征對藥物治療反應(yīng)較差，遷延不愈，最終導(dǎo)致終末期腎病。難治性腎病綜合征目前治療手段有限，且副作用較大。UCMSC具有自我更新、分化潛能、調(diào)節(jié)免疫的特點(diǎn)，并能改善足突損傷，加速足突和裂孔間隙的恢復(fù)，提供的新的治療路徑［7］。

Hualin等［8］研究發(fā)現(xiàn)SD大鼠阿霉素腎病模型靜脈輸注UCMSC，可減慢或阻止大鼠FSGS的進(jìn)程。機(jī)制可能與調(diào)節(jié)炎性介質(zhì)的合成、釋放和抑制炎性細(xì)胞的浸潤有關(guān)。國內(nèi)孫洞簫等［9］報(bào)道了IgA腎病模型小鼠輸注UCMSC后，與對照組和模型組比較，蛋白尿明顯減少，并發(fā)現(xiàn)腎功能明顯改善，腎小球系膜增生程度減輕，認(rèn)為其機(jī)制可能與上調(diào)腎組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial cell growth factor，VEGF）表達(dá)有關(guān)。吳銀等人研究微小病變型腎病大鼠［10］，證實(shí)UCMSC可修復(fù)足突病變，減少大鼠模型的尿蛋白量，上調(diào)nephrin mRNA表達(dá)，可能機(jī)制為UCMSC的旁分泌作用、直接分化或改善腎血管管周微環(huán)境等。

UCMSC具有來源廣泛，便于取材的優(yōu)點(diǎn)，可以大規(guī)模培養(yǎng)獲取，無倫理的限制，適合臨床的推廣及應(yīng)用。隨著UCMSC的優(yōu)越性不斷被發(fā)掘，應(yīng)用于腎臟病的研究也逐漸增加［11-13］。UCMSC在腎臟病領(lǐng)域的研究，目前主要集中在急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）方面，在慢性腎臟病中的應(yīng)用，主要包括繼發(fā)性腎病，如狼瘡性腎炎等較為多見。原發(fā)性慢性腎病的相關(guān)研究多為動(dòng)物模型，在微小病變、IgA腎病及局灶節(jié)段性腎小球硬化癥等方面已經(jīng)取得一定的成果，但相關(guān)研究較少，有待進(jìn)一步完善。本研究就靜脈輸注UCMSC治療難治性腎病綜合征作一療效觀察。所有患者在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上增加UCMSC治療，治療前后24h尿蛋白定量、血漿白蛋白、總蛋白的比較顯示，UCMSC治療前（0周）與治療后4周、8周、16周、24周之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，患者經(jīng)過UCMSC治療4周左右，24h尿蛋白定量即發(fā)現(xiàn)顯著減輕，血中白蛋白，總蛋白均得到改善。4周的總緩解率達(dá)到46.67%，隨訪到24周，患者的總緩解率升至70.0%，說明UCMSC對腎病綜合征病情的改善有積極的作用，起效快。UCMSC治療難治性腎病綜合征的主要可能機(jī)制包括:（1）有分化潛能，并有歸巢效應(yīng)，具有選擇性的體內(nèi)分布特點(diǎn)，作用于受損的腎臟組織；（2）UCMSC可以調(diào)節(jié)免疫，改變Thl/Th2的免疫平衡狀態(tài)，使Thl7含量下降，上調(diào)Treg細(xì)胞［14］；（3）上調(diào)nephrin mRNA表達(dá)，促進(jìn)足細(xì)胞的修復(fù)；（4）UCMSC還有旁分泌的作用，可以分泌VEGF等因子，VEGF在改善腎組織炎性反應(yīng)、缺氧、組織纖維化均有一定作用。

在治療過程中患者的尿素氮、血肌酐均在正常范圍內(nèi)波動(dòng)，個(gè)別合并AKI的患者還可發(fā)現(xiàn)腎功能恢復(fù)快，相關(guān)文獻(xiàn)亦有報(bào)道UCMSC可改善腎功能，尤其有助于AKI的修復(fù)及改善預(yù)后［12］。

在所有患者完成4次UCMSC治療后，繼續(xù)隨訪1年，復(fù)發(fā)5例，復(fù)發(fā)率16.7%。UCMSC治療過程中發(fā)熱2例，惡心、嘔吐3例，皮疹1例，腹瀉2例、肝功能異常1例，均表現(xiàn)較輕微，給予對癥處理后痊愈。

本研究關(guān)于UCMSC治療難治性腎病綜合征的研究初步證實(shí)UCMSC具有一定療效，可以顯著改善難治性腎病綜合征患者的蛋白尿，增加臨床緩解率，并且安全性高，提供了治療上可供選擇的新手段，但仍存在很多不足:回顧性研究，樣本量較少，缺乏隨機(jī)對照；治療劑量單一，未達(dá)到患者個(gè)體化。UCMSC治療的機(jī)制并不明確，需要進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究證實(shí)其在PNS治療中的作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，UCMSC應(yīng)用于難治性腎病綜合征患者，可減少其蛋白尿，增加血漿白蛋白，增加緩解率，降低復(fù)發(fā)，為UCMSC臨床應(yīng)用于慢性腎臟病提供了一定依據(jù)。

1 Chen Y， Schieppati A， Chen X， et al. Immunosuppressive treatment for idiopathic membranous nephropathy in adults with nephrotic syndrome［J］. Cochrane Database Syst Rev，2014， 10:CD004293.

2 Chen Y， Qian H， Zhu W， et al. Hepatocyte growth factor modification promotes the amelioration effects of human umbilical cord mesenchymal stem cells on rat acute kidney injury［J］. Stem Cells Dev， 2011， 20（1）:103-113.

3 Huang DL， Yi ZW. Application of stem cell transplantation in kidney diseases［J］. Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi，2012， 14（2）:154-160.

4 李炳徳，張樂文.難治性腎病綜合征的研究現(xiàn)狀與進(jìn)展［J］. 中國醫(yī)學(xué)工程， 2016， 24（1）:19-21.

5 林娜， 陳津， 付云烽， 等. 溫度和二氧化碳變化對大規(guī)模培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的影響［J/CD］. 中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志:電子版， 2012， 2（1）:20-23.

6 葉任高， 陳裕盛， 方敬愛. 腎臟病診斷與治療及療效標(biāo)準(zhǔn)專題討論紀(jì)要［J］. 中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志， 2003，4（5）:249-251.

7 Beyth S， Borovsky Z， Mevorach D， et al. Human mesenchymal stem cells alter antigen-presenting cell maturation and induce T-cell unresponsiveness［J］. Blood，2005， 105（5）:2214-2219.

8 Ma H， Wu Y， Xu Y， et al. Human umbilical mesenchymal stem cells attenuate the progression of focal segmental glomerulosclerosis［J］. Am J Med Sci， 2013，346（6）:486-493.

9 孫洞簫， 王志奇， 周盾. 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植對IgA腎病小鼠腎功能的影響［J］. 山東醫(yī)藥， 2012，52（26）:36-38.

10 吳銀， 郭明好， 曹毓林， 等. 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞干預(yù)微小病變型腎病大鼠的實(shí)驗(yàn)研究［J］. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013， 30（9）:712-715.

11 Choi S， Park M， Kim J， et al. The role of mesenchymal stem cells in the functional improvement of chronic renal failure［J］. Stem Cells Dev， 2009， 18（3）:521-529.

12 Fang TC， Pang CY， Chiu SC， et al. Renoprotective effect of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in immunodeficient mice suffering from acute kidney injury［J］. PLoS One， 2012， 7（9）:e46504.

13 楊桂鮮， 潘麗萍， 周巧艷， 等. 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植輔助治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的療效觀察［J］. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）， 2014， 45（2）:338-341， 350.

14 丘美蘭. 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療原發(fā)性腎病綜合征的臨床療效研究［D］. 福州:福建醫(yī)科大學(xué)， 2013.

（本文編輯:蔡曉珍）

Clinical efficacy of umbilical cord mesenchymal stem cells in the treatment of refractory nephrotic syndrome

Li Junxia1， Zhou Xinyu1， Qiu Meilan2， Chen Jian1， Tan Jianming3.1Nephrology Department，3Urology Department， Fuzhou General Hospital of Second Military Medical University， Fuzhou 350025， China；2Nephrology Department， The Second Hospital of Longyan City， Longyan 364200， China
Correspondence Author: Tan Jianming， tanjm156@xmu.edu.cn

Objective To probe into the primary efficacy and safety of umbilical cord mesenchymal stem cell（UCMSC）on the treatment of refractory primary nephrotic syndrome（PNS）. Methods Thirty patients with refractory PNS who voluntarily received the treatment of UCMSC from August 2010 to January 2015 were selected. All patients were in accordance to with the diagnostic criteria of refractory PNS. Their pathological types were confirmed by renal biopsy. No remission was achieved by the immunosuppressive therapy and no repeated recurrence of PNS was found in the patients. The curative effect， adverse reactions and recurrence rate of UCMSC on the treatment of PNS were analyzed. Single factor repeated measure variance analysis and generalized linear mixed model was used to analyze thedifference before and after treatment. Results The statistical analysis showed that:（1）The comparison of 24-hour urinary protein before and after the treatment of UCMSC showed that statistically significant differences were found before treatment（3.84g/d）and after treatment 4W（2.53g/d），8W（1.12g/d），16W（0.66g/d），24W（0.57g/d）.The comparison of serum albumin showed that there were statistically significant differences before treatment［（24.07±7.30）g/L］and after treatment 4W［（29.50±7.92）g/L］，8W［（31.58±7.94）g/L］，16W［（33.43±7.86）g/L］，24W［（35.57±7.68）g/L］.Thecomparison of total protein showed that there were statistically significant differences before treatment ［（50.03±7.82）g/L］ and after treatment 4W ［（56.83±8.82）g/L］，8W［（58.9±7.94）g/L］，16W［（60.93±8.25）g/L］，24W［（64.6±8.52）g/L］.The comparison of cholesterol before and after treatment showed that there were statistically significant differences before treatment of UCMSC［（8.62±2.94）mmol/L］ and after treatment 8W ［（8.0±2.91）mmol /L］， 16W［（7.31±2.58）mmol /L］，24W［（6.60±2.07）mmol/L］.（2）Complete remission: 15 cases，50%； Partial remission: 6 cases， 20%； No remission: 9 cases， 30%.（3）Fewer complications in the whole injection and observation process were found and all patients were cured after treatment. Conclusion The study showed that UCMSC has positive effects on improving refractory PNS disease and preventing the recurrence of PNS. UCMSC has a high rate of clinical remission， fast action and fewer complications. However， its long-term effect still needs to be further observed.

Nephrotic syndrome； Umbilical cord； Mesenchymal stem cells，Treatment outcome

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.02.004

350025 福州，第二軍醫(yī)大學(xué)福州總醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)院腎內(nèi)科1，泌尿外科3；364200 龍巖市第二醫(yī)院腎內(nèi)科2

譚建明，Email: tanjm156@xmu.edu.cn

2016-01-31）