人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及軟瓊脂克隆形成的影響

曾桂芳謝長(zhǎng)峰徐紹坤杜杰李嬋李陶左叢林劉沐蕓胡祥

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人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及軟瓊脂克隆形成的影響

曾桂芳1謝長(zhǎng)峰1徐紹坤1杜杰2李嬋1李陶1左叢林2劉沐蕓1胡祥1

目的 研究人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hUCMSC）體外共培養(yǎng)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響以及在軟瓊脂中形成克隆的可能性，從而評(píng)價(jià)其體外促瘤性和致瘤性，為其體內(nèi)致瘤性研究及臨床應(yīng)用提供安全性數(shù)據(jù)。方法 剝?nèi)∧殠A通氏膠，剪碎，組織塊貼壁法獲得貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)傳代，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞表型，檢測(cè)誘導(dǎo)成脂肪和成骨及成軟骨分化的能力，鑒定是否為hUCMSC。然后，通過(guò)體外軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察hUCMSC形成集落的能力；hUCMSC分別與人白血病細(xì)胞株K562和人結(jié)腸癌細(xì)胞株Colo-205體外共培養(yǎng)，MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖，并以腫瘤細(xì)胞的增殖指數(shù)（PI）值來(lái)判定hUCMSC是否對(duì)腫瘤細(xì)胞體外增殖有影響 。結(jié)果 人臍帶華通氏膠分離培養(yǎng)的細(xì)胞具有成纖維細(xì)胞樣的細(xì)胞形態(tài)，具有向成脂肪和成骨及成軟骨方向分化的能力，表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞指標(biāo)CD73、CD90、CD105，低表達(dá)CD34、CD45、CD19，符合間充質(zhì)干細(xì)胞特點(diǎn)。軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示hUCMSC未表現(xiàn)出在阻力介質(zhì)中的克隆生長(zhǎng)能力。hUCMSC分別與人白血病細(xì)胞K562和人結(jié)腸癌Colo-205細(xì)胞共培養(yǎng)，PI值顯示hUCMSC對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖沒(méi)有影響。結(jié)論 hUCMSC體外培養(yǎng)不具有致瘤性，同時(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖無(wú)影響。

臍帶； 間質(zhì)干細(xì)胞； 細(xì)胞分化； 致瘤性

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）是一種能夠自我更新，具有多向分化潛能的祖細(xì)胞［1］。人們已經(jīng)在人多種組織內(nèi)分離出MSC并在體內(nèi)體外分化得到多種終末分化細(xì)胞，如骨［2-4］、軟骨［5-6］、肌腱［7-9］、肌肉［10-12］、脂肪［13，4］、造血支持細(xì)胞［14］等。骨髓來(lái)源的MSC由于其免疫調(diào)節(jié)的特性，是用于治療免疫性疾病的主要候選細(xì)胞［15］。但由于骨髓源性MSC取材時(shí)對(duì)供者有侵入性損傷，給供者帶來(lái)痛苦，并且存在病毒污染的可能，所以研究者希望能找到替代骨髓MSC，彌補(bǔ)其缺陷的MSC來(lái)源。人們?cè)囍鴱钠渌M織中獲得MSC，比如從臍血和外周血中獲得細(xì)胞，但是具有一定難度，且在足月分娩的臍血或動(dòng)員的外周血中MSC的數(shù)量尚存在爭(zhēng)議［16-18］。近年較多學(xué)者從娩后的廢棄組織臍帶中分離和培養(yǎng)MSC，臍帶中的華通氏膠不但含有豐富的MSC，且其來(lái)源的細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、擴(kuò)增能力、分化功能，以及表面標(biāo)志物等生物學(xué)鑒定結(jié)果都符合間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)［19］，為MSC的基礎(chǔ)和臨床研究提供了新材料來(lái)源和基礎(chǔ)資料［17］。臍帶取材對(duì)供者不具有侵入性損傷和倫理道德的問(wèn)題，被認(rèn)為是代替骨髓來(lái)源MSC最佳材料［15］。

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cordderived mesenchymal stem cell，hUCMSC）缺乏HLA-Ⅱ類分子和共同刺激分子的表達(dá)，具有特殊的免疫學(xué)表型，不引起同種異體淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)［20］。由于其免疫學(xué)特性，移植入宿主體內(nèi)的MSC不引起宿主的免疫排斥反應(yīng)，通過(guò)細(xì)胞間的相互作用以及旁分泌等方式抑制T細(xì)胞的增殖及其過(guò)度免疫反應(yīng)，從而發(fā)揮免疫重建作用［21］。

目前hUCMSC臨床應(yīng)用的最大憂慮依然是其安全性，其中致瘤性又是其安全性中的關(guān)注重點(diǎn)。本文旨在通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究hUCMSC是否具有致瘤性，為體內(nèi)致瘤性實(shí)驗(yàn)及其臨床使用提供安全性數(shù)據(jù)。

材料和方法

一、材料

在產(chǎn)婦及家屬知情并同意捐贈(zèng)的情況下，獲取足月妊娠剖腹產(chǎn)分娩的胎兒臍帶；CO2恒溫培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；酶標(biāo)儀（MODEL 1550，日本BIO RAD公司）；倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；DMEM/F12培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司）；人胚肺成纖維細(xì)胞（MRC-5）、人宮頸癌細(xì)胞（Hela）、人白血病細(xì)胞株K562和人結(jié)腸癌細(xì)胞株Colo-205均購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所細(xì)胞中心；低熔點(diǎn)瓊脂糖（美國(guó)Amresco公司）。

二、方法

（一）hUCMSC分離培養(yǎng)

取合適的剖腹產(chǎn)嬰兒臍帶，用手術(shù)線將準(zhǔn)備采集的臍帶兩端結(jié)扎，剪取已經(jīng)結(jié)扎的臍帶放入無(wú)菌的臍帶采集瓶中，盡快運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室處理。實(shí)驗(yàn)室接受臍帶后，無(wú)菌操作分離培養(yǎng)Wharton'sjelly源性間充質(zhì)干細(xì)胞。先用無(wú)菌PBS洗去臍帶殘存血液及雜質(zhì)后，將臍帶剪成2～3cm的小段，用有齒鑷子輕輕撕開每小段臍帶，暴露出臍帶里面的華通氏膠以及血管。剝除臍帶里面的兩條靜脈及一條動(dòng)脈后，輕輕撕下華通氏膠，羊膜廢棄。將獲得華通氏膠剪碎至1mm3大小，加入含10%FBS（Gibco）DMEM/F12（Hyclone）于恒溫37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5～6天后進(jìn)行首次換液，以后每隔3d進(jìn)行換液1次。細(xì)胞長(zhǎng)到70%～80%融合時(shí)使用0.25%胰酶進(jìn)行消化傳代。

（二）hUCMSC細(xì)胞表面抗原分析

取至少1×106個(gè)細(xì)胞樣品移入相應(yīng)流式管內(nèi)，加入PBS充分混勻，離心洗滌2次；加入適量PBS混懸細(xì)胞，過(guò)濾，計(jì)數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)整為（2.0～6.0）×106個(gè)/ml待用；每個(gè)抗原檢測(cè)需同時(shí)設(shè)1支同型對(duì)照管，并用記號(hào)筆在試管外壁上標(biāo)記清楚抗體及同型對(duì)照信息，按照管上標(biāo)記抗體及同型信息加入相應(yīng)抗體及同型對(duì)照試劑；然后將準(zhǔn)備好的細(xì)胞樣品混勻后，取100μl細(xì)胞懸液至已加入抗體試劑的流式管內(nèi)，將細(xì)胞懸液與抗體試劑充分混勻，孵育30min；孵育完成后每管加入PBS，充分混勻，洗滌1次，調(diào)整細(xì)胞懸液體積至200μl左右，準(zhǔn)備上機(jī)檢測(cè)。檢測(cè)細(xì)胞的陽(yáng)性抗原表達(dá)CD73、CD90、CD105不低于95%，陰性抗原表達(dá)CD14、CD19、CD34、CD45、HLADR不得過(guò)2%。

（三）hUCMSC多向誘導(dǎo)分化

取需要檢測(cè)分化的細(xì)胞鋪板于6孔板中，用含10%FBS的DMEM/F12的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)70%～80%融合度時(shí)，將培養(yǎng)基更換為成脂、成骨、成軟骨的定向分化誘導(dǎo)液進(jìn)行培養(yǎng)，并定期進(jìn)行換液。各組誘導(dǎo)分化細(xì)胞均另設(shè)含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)的細(xì)胞為對(duì)照。

1.向成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化:在細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)70%～80%融合時(shí)加入脂肪細(xì)胞分化誘導(dǎo)液（GIBCO），對(duì)照為10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，每隔3～4d進(jìn)行換液1次。每天使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)的狀況以及形態(tài)的變化，當(dāng)脂滴出現(xiàn)后（約3周后）用4%多聚甲醛固定細(xì)胞10min，PBS洗滌，1%油紅O染色15min，PBS洗滌后在光學(xué)顯微鏡下觀察脂肪滴的現(xiàn)象，并拍照。

2.向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化:在細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)70%～80%融合時(shí)加入成骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)液對(duì)照為10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，每3～4d全量換液1次。每天使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)的狀況以及形態(tài)的變化，觀察出現(xiàn)鈣化結(jié)晶及結(jié)節(jié)后（約4周）用4%多聚甲醛固定細(xì)胞10min，PBS洗滌，用1%茜素紅染30min后光鏡下觀察有無(wú)鈣化基質(zhì)沉淀的現(xiàn)象并拍照。

3.向成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化:取一定細(xì)胞加入到15ml離心管中離心，加入成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)液，對(duì)照為10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，每3～4d全量換液1次。誘導(dǎo)2～3周后，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋切片，1%阿爾新藍(lán)染色，光鏡下觀察軟骨細(xì)胞。

（四）軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)

在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)無(wú)菌操作鋪備0.6%底層瓊脂，待室溫凝固后，將培養(yǎng)板置于2℃～8℃保存?zhèn)溆?。在使用前，先將培養(yǎng)板置于37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行復(fù)溫。收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，按不同密度配成0.35%上層瓊脂。根據(jù)文獻(xiàn)［22］將受試細(xì)胞hUCMSC終濃度分別設(shè)定為500、1000、2000個(gè)/孔。同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照孔（Hela細(xì)胞，1000個(gè)/孔）和陰性對(duì)照（MRC-5，1000個(gè)/孔）以及空白對(duì)照孔，每組設(shè)3個(gè)平行孔。待培養(yǎng)基在室溫凝固后，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)21d。培養(yǎng)結(jié)束后，顯微鏡下觀察，16個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)計(jì)為1個(gè)集落，計(jì)算細(xì)胞集落總數(shù)。

（五）MTT法檢測(cè)hUCMSC體外對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響

采用人白血病細(xì)胞株K562和人結(jié)腸癌細(xì)胞株Colo-205，實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組（無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基組）、陽(yáng)性對(duì)照組（腫瘤細(xì)胞+順鉑組）、hUCMSC對(duì)照組（單純hUCMSC組）、hUCMSC實(shí)驗(yàn)組（hUCMSC+腫瘤細(xì)胞組）。K562細(xì)胞濃度分別為1.25×104，2.5×104，5.0×104個(gè)/ml；Colo-205細(xì)胞濃度分別為1.25×104，2.5×104，5.0×104，1.0×105，2.0×105個(gè)/ml，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行孔。順鉑濃度為4μg/ml，于腫瘤細(xì)胞接種1h后加入。hUCMSC細(xì)胞1.0×105個(gè)/ml接種于96孔培養(yǎng)板，24h后經(jīng)60Co12.5Gy照射后作為共培養(yǎng)鋪層細(xì)胞，照射后4h接種腫瘤細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)72h后MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，并計(jì)算腫瘤細(xì)胞的增殖指數(shù)（proliferation index，PI）。PI=（實(shí)驗(yàn)組或陽(yáng)性對(duì)照組吸光度（A）值－空白對(duì)照（A）值）/（陰性對(duì)照組（A）值－空白對(duì)照（A）值）。將各組PI進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，比較不同濃度下的腫瘤細(xì)胞增殖情況，以PI值在（1.0±0.3）之內(nèi)為對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)影響。

結(jié) 果

一、hUCMSC的分離、擴(kuò)增及鑒定

用組織塊貼壁法分離hUCMSC，1周后于組織塊間隙已可見(jiàn)散在分布的長(zhǎng)條索狀紡錘形細(xì)胞（圖1）。貼壁細(xì)胞多為長(zhǎng)梭形或扁平形的成纖維樣細(xì)胞，折光度好，核仁明顯。

圖1 倒置顯微鏡下觀察貼壁生長(zhǎng)的hUCMSC（×40）

二、細(xì)胞免疫表型檢測(cè)

流式細(xì)胞儀檢測(cè)表明:貼壁細(xì)胞均強(qiáng)表達(dá)CD73、CD90、CD105，不表達(dá)造血細(xì)胞表型CD34、CD45、CD19、CD14和HLA-DR（圖2）。

圖2 hUCMSC細(xì)胞表面抗原分析細(xì)胞流式圖

三、體外誘導(dǎo)分化檢測(cè)

脂肪誘導(dǎo)第14天倒置顯微鏡下即可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)脂滴形成，第21天油紅O染色呈強(qiáng)陽(yáng)性（圖3a），未加脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基的對(duì)照組細(xì)胞無(wú)脂滴形成，油紅O染色陰性（圖3b）。成骨誘導(dǎo)第28天，實(shí)驗(yàn)組茜素紅染色可見(jiàn)細(xì)胞間紅色鈣化基質(zhì)沉積（圖3c），未加成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的對(duì)照組細(xì)胞茜素紅染色未見(jiàn)紅色礦化物沉積（圖3d）成軟骨誘導(dǎo)第21天，實(shí)驗(yàn)組阿爾新藍(lán)染色可見(jiàn)明顯藍(lán)色斑塊沉積（圖3e），對(duì)照組則不明顯（圖3f）。

四、軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)

陽(yáng)性對(duì)照組1周時(shí)有110.7個(gè)集落出現(xiàn)，2周時(shí)為379.7個(gè)，3周時(shí)為501.7個(gè)（圖4）?？瞻讓?duì)照組、陰性對(duì)照組及供試品低、中、高劑量組在培養(yǎng)后3周內(nèi)均未見(jiàn)細(xì)胞集落產(chǎn)生。

五、hUCMSC體外對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響

體外細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果表明，將1.0×105個(gè)/ml的hUCMSC與1.25×104、2.5×104、5.0×104個(gè)/ml濃度的懸浮生長(zhǎng)人白血病細(xì)胞K562共培養(yǎng)，即其相應(yīng)細(xì)胞比例為1:8、1:4、1:2時(shí)，與順鉑陽(yáng)性對(duì)照組相比，對(duì)K562細(xì)胞增殖無(wú)明顯作用（表1）。1.0×105個(gè)/ml的hUCMSC與1.25×104、2.5 ×104、5.0×104個(gè)/ml、1.0×105個(gè)/ml和2.0×105個(gè)/ml濃度的貼壁生長(zhǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞Colo-205共培養(yǎng)，即其相應(yīng)細(xì)胞比例為1:8、1:4、1:2、1:1和2:1時(shí)，與順鉑陽(yáng)性對(duì)照組相比，hUCMSC共培養(yǎng)對(duì)Colo-205細(xì)胞增殖無(wú)明顯作用（表2）。

討 論

圖3 倒置顯微鏡下觀察hUCMSC誘導(dǎo)分化結(jié)果

圖4 光學(xué)顯微鏡下觀察軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)細(xì)胞接種第3周時(shí)細(xì)胞形態(tài)（×20）

MSC來(lái)源于中胚層間充質(zhì)，主要存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，目前研究較多的MSC主要來(lái)源于骨髓、臍血、臍帶、外周血和脂肪組織。臍帶是胎兒分娩后廢棄組織，獲取過(guò)程對(duì)供者無(wú)不利影響，經(jīng)產(chǎn)婦自愿捐贈(zèng)，不存在倫理道德風(fēng)險(xiǎn)，且所獲細(xì)胞增殖、分化能力強(qiáng)，適合體外大規(guī)模培養(yǎng)，產(chǎn)品化前景較強(qiáng)，因此臍帶MSC逐漸成為MSC移植的主要來(lái)源，也成為國(guó)內(nèi)外商業(yè)開發(fā)的熱點(diǎn)。hUCMSC具有特殊的免疫學(xué)表型，不表達(dá)HLA-Ⅱ類分子和共同刺激分子，不會(huì)引起同種異體淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。移植入宿主體內(nèi)的MSC可避免宿主的免疫排斥反應(yīng)，通過(guò)細(xì)胞間的相互作用及旁分泌作用等機(jī)制抑制過(guò)度活躍的T細(xì)胞的增殖及自身免疫反應(yīng)，從而發(fā)揮免疫重建的功能，進(jìn)而有可能在自身免疫疾病方面取得較好的療效。南京鼓樓醫(yī)院孫凌云教授將hUCMSC應(yīng)用于難治性系統(tǒng)性紅斑狼瘡的治療，發(fā)現(xiàn)hUCMSC治療安全、耐受，通過(guò)糾正患者失衡的免疫系統(tǒng)、減少自身抗體產(chǎn)生，改善病人病情活動(dòng)度和器官功能，取得了較好的治療效果并能維持較長(zhǎng)時(shí)間療效［23-29］。但hUCMSC的安全性，尤其干細(xì)胞被廣泛關(guān)注的致瘤性仍然沒(méi)有得到充分研究。本研究通過(guò)hUCMSC軟瓊脂克隆以及腫瘤細(xì)胞增殖來(lái)評(píng)價(jià)其體外致瘤性，為進(jìn)一步的體內(nèi)致瘤性研究及臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

表1 hUCMSC共培養(yǎng)對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響

表2 hUCMSC共培養(yǎng)對(duì)Colo-205細(xì)胞增殖的影響

自臍帶剝離得到的華通氏膠組織塊貼壁培養(yǎng)，長(zhǎng)出貼壁細(xì)胞鏡下觀察為梭形，與成纖維細(xì)胞形態(tài)相似。流式分析表明該方法分離培養(yǎng)的細(xì)胞高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞陽(yáng)性指標(biāo)CD73、CD90、CD105，低表達(dá)血液系統(tǒng)來(lái)源細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、CD45、CD19；具有向成脂肪和成骨及成軟骨方向分化的能力，符合ISCT關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)［19］。

軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以看出，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組均無(wú)克隆形成，說(shuō)明試驗(yàn)無(wú)外源性污染，陰性對(duì)照細(xì)胞MRC-5為正常組織細(xì)胞，沒(méi)有在阻力培養(yǎng)下生成克隆的能力。陽(yáng)性對(duì)照宮頸癌細(xì)胞Hela為腫瘤細(xì)胞，增殖能力強(qiáng)，具有阻力培養(yǎng)條件下生成克隆的特性，并隨著時(shí)間延長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞克隆增加，說(shuō)明試驗(yàn)系統(tǒng)可信。hUCMSC屬于人體正常組織細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中軟瓊脂培養(yǎng)無(wú)細(xì)胞克隆形成，證實(shí)體外培養(yǎng)時(shí)hUCMSC無(wú)致瘤性。

hUCMSC分別與人白血病細(xì)胞K562和人結(jié)腸癌Colo-205細(xì)胞體外共培養(yǎng)的促瘤性研究實(shí)驗(yàn)中，和對(duì)照組相比，hUCMSC對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖均無(wú)明顯影響，證實(shí)體外培養(yǎng)時(shí)hUCMSC無(wú)促瘤性。

hUCMSC體外培養(yǎng)不具有軟瓊脂克隆形成能力，同時(shí)對(duì)人白血病細(xì)胞K562和人結(jié)腸癌Colo-205細(xì)胞的增殖無(wú)影響，為其進(jìn)一步體內(nèi)致瘤性研究提供了數(shù)據(jù)，并為其臨床安全使用提供了部分證據(jù)。

關(guān)于hUCMSC在動(dòng)物體內(nèi)的致瘤性及臨床應(yīng)用的安全性，尚需開展更多的進(jìn)一步研究。

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（本文編輯:李少婷）

Clony formation capability of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cell in soft agar and its effects on tumor cell proliferation in vitro

Zeng Guifang， Xie Changfeng，Xu Shaokun， Du Jie， Li Chan， Li Tao， Zuo Conglin， Liu Muyun， Hu Xiang.1Shenzhen Beike Bio-Technology Company Limited， Shenzhen 518062， China；2JOINN Laboratories， Incorporated，Beijing 100176， China
Corresponding author: Liu Muyun， Emai:muyun@beike.cc
Zeng Guifang and Xie Changfeng are the first authors who contributed equally to the article

Objective To study whether human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells（hUCMSC）promoted tumor cell growth and formed clones in vitro and to provide safety data for future clinical use. Methods Wharton's jelly was stripped from human umbilical cord and cut into pieces；the adherent cells were collected using tissue explant method and subcultured. The morphology of hUCMSC was observed under microscope. The phenotype of hUCMSC was determined by flow cytometry. The osteogenesis， adipogenesis and chondrogenesis capability were tested by differentiation induction. The clone formation capability was evaluated on soft agar. Cells proliferation was evaluated by proliferation index（PI）through MTT methods after hUCMSC were co-cultured with K562 and colo-205. Results Fibroblasts-like morphology was observed in cells derived from Wharton's jellyof human umbilical cord. The capabilities of osteogenesis， adipogenesis and chondrogenesis differentiation were confirmed. Cells were positive for surface markers of mesenchymal stem cells such as CD73， CD90， CD105 and negative for CD34， CD45 and CD19. These results indicated they were mesenchymal stem cells. Soft agar colony formation assay showed hUCMSC did not exhibit clonal growth. hUCMSC had no effect on tumor cell proliferation when co-cultured with K562 and colo-205 tumor cells in vitro. Conclusion hUCMSCs has neither tumorigenicity nor effects on tumor cell proliferation in vitro.

Umbilical cord； Mesenchymal stem cell； Cells differentiation，；Tumorigenicity； Tumor enhancement

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.02.005

廣東省科技計(jì)劃（2013B070704118）；深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（JSGG20130917151830203、CXZZ20150430152511042）

518062 深圳市北科生物科技有限公司1；100176 北京昭衍新藥研究中心有限公司2

劉沐蕓，Email: muyun@beike.cc

前兩位作者對(duì)本文有同等貢獻(xiàn)，均為第一作者

2016-01-11）