氟在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起原代培養(yǎng)成釉細(xì)胞自噬與凋亡中的作用

王　琳， 王丹楊， 王　峰， 謝　娜

(西安醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系，西安　710021；*通訊作者，E-mail：815365619@qq.com)

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氟在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起原代培養(yǎng)成釉細(xì)胞自噬與凋亡中的作用

王琳*， 王丹楊， 王峰， 謝娜

(西安醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系，西安710021；*通訊作者，E-mail：815365619@qq.com)

目的探討氟在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起原代培養(yǎng)成釉細(xì)胞自噬與凋亡中的作用及相關(guān)機(jī)制。方法分離SD大鼠上下頜磨牙牙胚中的成釉細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)。待細(xì)胞生長穩(wěn)定后，采用0.8 mmol/L、1.6 mmol/L NaF分別干預(yù)體外培養(yǎng)成釉細(xì)胞24 h和48 h，倒置顯微鏡及透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及其超微結(jié)構(gòu)。1.6 mmol/L NaF作用于成釉細(xì)胞24 h和48 h，利用real-time PCR和Western blot法分別檢測不同時間點(diǎn)下成釉細(xì)胞XBP1s mRNA、GRP78和CHOP蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果倒置顯微鏡下觀察，0.8 mmol/L NaF干預(yù)成釉細(xì)胞24 h和48 h，與對照組相比均未見明顯差異。1.6 mmol/L NaF作用于成釉細(xì)胞48 h凋亡細(xì)胞數(shù)明顯多于同濃度氟作用于細(xì)胞24 h時。透射電鏡結(jié)果顯示，NaF干預(yù)成釉細(xì)胞24 h，0.8 mmol/L NaF組細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池樣擴(kuò)張，線粒體腫脹，體積增大，電子密度降低，溶酶體豐富，自噬樣結(jié)構(gòu)可見。1.6 mmol/L NaF 組細(xì)胞內(nèi)自噬樣結(jié)構(gòu)明顯增加。1.6 mmol/L NaF作用下，成釉細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白XBP1s mRNA、GRP-78及CHOP蛋白表達(dá)水平48 h時間點(diǎn)較24 h 時間點(diǎn)均明顯增加(P<0.01)。結(jié)論氟可導(dǎo)致成釉細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，啟動自噬，隨著氟處理時間延長，激活凋亡信號通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

氟；成釉細(xì)胞；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；自噬；細(xì)胞凋亡

牙齒發(fā)育期間攝入過量的氟會影響釉質(zhì)的形成，導(dǎo)致氟牙癥。成釉細(xì)胞是釉質(zhì)發(fā)育過程中的主要細(xì)胞[1]。有研究表明，高劑量的氟會引起成釉細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[2,3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞膜蛋白和分泌蛋白加工成熟的主要場所[4]，在應(yīng)激狀態(tài)下會失去正確折疊的能力而導(dǎo)致未折疊或錯誤折疊蛋白的累積，進(jìn)一步激活未折疊蛋白反應(yīng) (unfolded protein response,UPR)，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對蓄積在網(wǎng)腔內(nèi)的未折疊或錯誤折疊蛋白質(zhì)的降解[5]或自噬[6]，以維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。

自噬是一種高度調(diào)節(jié)代謝過程，在許多細(xì)胞活動包括發(fā)育、分化、存活和維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)都是至關(guān)重要的[7]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬可以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)平衡，具有一定的保護(hù)性作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時未折疊蛋白反應(yīng)可以激活自噬，自噬又可以通過降解錯誤折疊或未折疊蛋白減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的負(fù)荷，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的過度激活，同時產(chǎn)生的降解產(chǎn)物也為機(jī)體細(xì)胞新蛋白質(zhì)的合成、細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重建以及ATP的生成提供原料。但過度激活的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬又能夠加重細(xì)胞損傷，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡[8]。

本研究將氟化鈉(NaF)作用于體外培養(yǎng)的大鼠原代成釉細(xì)胞(ameloblast)，探討氟在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起成釉細(xì)胞自噬與凋亡中的作用及相關(guān)機(jī)制。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗動物

4 d齡同批次SD大鼠(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實(shí)驗中心提供)。

1.2主要試劑和儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基(HyClone公司，美國)；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)(HyClone公司，美國)；Ⅰ型膠原酶(Sigma公司，美國)；牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)(Sigma公司，美國)；胰酶(Sigma公司，美國)；兔抗大鼠細(xì)胞角化蛋白14(cytokeratin14，CK14)單克隆一抗、兔抗大鼠成釉蛋白(ameloblastin，AMBN)單克隆一抗、免疫組化SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，中國)；兔抗大鼠葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein78，GRP78)一抗、小鼠抗大鼠C/EBP 同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)一抗(cell signaling公司，美國)；各型號培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶、離心管(Corning公司，美國)，Lab-TekTM腔室載玻片(NUNC公司，美國)等。

1.3原代成釉細(xì)胞的培養(yǎng)

4 d齡SD大鼠，脫頸處死，用75%乙醇浸泡10 min。無菌條件下解剖分離雙側(cè)上下頜骨內(nèi)磨牙牙胚，用含1%青-鏈霉素的磷酸鹽緩沖液(PBS)浸洗。將牙胚組織切碎，1 000 r/min離心5 min。棄上清，加入2.5 mg/LⅠ型膠原酶(含1% BSA)，37 ℃水浴箱內(nèi)消化1 h，適度吹打，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌，再次離心，棄上清，之后用新鮮配置的胰蛋白酶消化5 min，加入DMEM培養(yǎng)液終止消化。1 000 r/min離心5 min，棄上清，DMEM培養(yǎng)液洗滌后再次離心棄上清，加入含17% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液，將所有細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至多聚賴氨酸包被的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。置飽和濕度、含5% CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。首次72 h換液，以后每48 h換液。待單層細(xì)胞生長到覆蓋瓶底的80%時，胰蛋白酶消化，將細(xì)胞轉(zhuǎn)置6孔板及Lab-TekTM腔室載玻片內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)，每48 h換液1次，待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后，進(jìn)行細(xì)胞鑒定及指標(biāo)檢測。培養(yǎng)期間進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.4成釉細(xì)胞的鑒定

將成釉細(xì)胞接種于腔室載玻片的腔室內(nèi)，細(xì)胞接種密度為1×104/ml，待細(xì)胞生長穩(wěn)定后，95%乙醇固定細(xì)胞10 min，按照二步法抗兔/鼠通用型免疫組織化學(xué)檢測試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞角蛋白CK14和AMBN染色，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.5氟干預(yù)成釉細(xì)胞及形態(tài)觀察

待成釉細(xì)胞生長穩(wěn)定后，分別加入NaF濃度為0.8 mmol/L、1.6 mmol/L的含氟培養(yǎng)液，對照組為不含氟培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h、48 h，倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。

1.6氟作用下成釉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)觀察

待成釉細(xì)胞生長穩(wěn)定后，分別加入NaF濃度為0.8 mmol/L、1.6 mmol/L的含氟培養(yǎng)液，對照組為不含氟培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h，1 500 r/min離心10 min、固定及常規(guī)處理，透射電鏡下進(jìn)行細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察。

1.7實(shí)時定量PCR(real-time PCR)檢測XBP1s mRNA表達(dá)

成釉細(xì)胞經(jīng)1.6 mmol/L NaF分別處理24 h和48 h，收集細(xì)胞，按照RNeasy試劑盒的說明書提取細(xì)胞總RNA，Nanodrop 2000測量RNA的濃度，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照Starr等[9]條件將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于real-time PCR檢測剪接型X盒結(jié)合蛋白1(X-box binding protein 1 spliced，XBP1s)mRNA的表達(dá)。GAPDH為內(nèi)對照。所用引物如下：GAPDH 正向5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′；GAPDH 反向5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′；XBP1s 正向5′-TGCTGAGTCCGCAGCAGGTG-3′；XBP1s 反向5′-GCTGGCAGGCTCTGGGGAAG-3′。

1.8蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測蛋白含量

成釉細(xì)胞經(jīng)1.6 mmol/L NaF分別處理24，48 h，收集細(xì)胞并提取蛋白，通過BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白質(zhì)樣品經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離,轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜,室溫條件下5% 脫脂奶粉封閉2 h，加入含 5% BSA稀釋液稀釋的GRP78、CHOP和β-actin抗體(1∶1 000)，4 ℃過夜，加入稀釋的相應(yīng)二抗(1∶10 000)，室溫孵育1 h。洗膜后用 ECL顯色，化學(xué)發(fā)光拍照，用軟件進(jìn)行圖像灰度值分析。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用SigmaStat V3.5統(tǒng)計軟件。多組樣本間均數(shù)比較采用單因素方差(one-way ANOVA)分析，檢測水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1原代培養(yǎng)成釉細(xì)胞形態(tài)

當(dāng)細(xì)胞密度較低時，倒置顯微鏡下成釉細(xì)胞邊界整齊，呈多角形(圖1A)；當(dāng)細(xì)胞數(shù)量較多時，成釉細(xì)胞間連接緊密，細(xì)胞呈鋪路石樣(圖1B)。細(xì)胞核明顯，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有蛋白樣物質(zhì)。提示培養(yǎng)的細(xì)胞具有上皮來源細(xì)胞的典型形態(tài)特征。

2.2成釉細(xì)胞的免疫組織化學(xué)鑒定

免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，AMBN和CK14表達(dá)呈陽性(圖2)，且主要分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，提示培養(yǎng)的細(xì)胞為上皮來源并具有合成AMBN的功能，符合成釉細(xì)胞組織免疫學(xué)特征。

A. 低細(xì)胞密度　　　　　　　　　　　　　 B.高細(xì)胞密度圖1　原代培養(yǎng)大鼠成釉細(xì)胞形態(tài) (×10)Figure 1　Morphology of primary rat ameloblast under inverted phase contrast microscope (×10)

A. 陰性對照　　　　　　　B.AMBN染色(+)　　　　　　　C.CK14染色圖2　免疫組化顯示AMBN和CK14在大鼠成釉細(xì)胞中的表達(dá) (×10)Figure 2　Expression of CK14 and AMBN in rat ameloblast by IHC (×10)

2.3氟干預(yù)下成釉細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡下觀察不同濃度氟作用于成釉細(xì)胞不同時間細(xì)胞的形態(tài)及生長情況。對照組為不含氟培養(yǎng)液培養(yǎng)24，48 h，細(xì)胞呈多角形貼壁生長，突觸明顯(見圖3A，3B)。0.8 mmol/L NaF干預(yù)細(xì)胞24 h(見圖3C)、48 h(見圖3D)，與對照組相較未見明顯差異。1.6 mmol/L NaF干預(yù)細(xì)胞24 h，成釉細(xì)胞體積縮小，突觸變短，期間有少量凋亡細(xì)胞存在(見圖3E)。48 h時，部分細(xì)胞縮小、變圓，凋亡細(xì)胞增多(見圖3F)。

2.4氟干預(yù)下成釉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

對照組：培養(yǎng)細(xì)胞略呈圓形，表面可見少量的微絨毛樣突起；細(xì)胞核形狀不規(guī)則，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，常染色質(zhì)豐富，少量異染色質(zhì)沿核膜分布，核仁常見；細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)短管狀，部分粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池樣擴(kuò)張，線粒體圓形或桿狀，線粒體嵴結(jié)構(gòu)清晰，初級及次級溶酶體豐富，電子密度較高，可見少量自噬樣結(jié)構(gòu)(見圖4A)。

0.8 mmol/L NaF干預(yù)組：培養(yǎng)細(xì)胞體積較大，形態(tài)不規(guī)則；細(xì)胞核內(nèi)常染色質(zhì)豐富，核仁可見；細(xì)胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池樣擴(kuò)張，線粒體腫脹，體積增大，電子密度降低，溶酶體豐富，可見自噬樣結(jié)構(gòu)(見圖4B)。

1.6 mmol/L NaF干預(yù)組：部分培養(yǎng)細(xì)胞腫脹、壞死，細(xì)胞膜斷裂，連續(xù)性消失，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見到自噬樣結(jié)構(gòu)明顯增加，可見凋亡細(xì)胞(見圖4C)。

圖3　氟干預(yù)下成釉細(xì)胞的形態(tài)觀察 (×10)Figure 3　Morphology of ameloblast after treated with NaF (×10)

A.對照組　　　　　　　　B.0.8 mmol/L NaF組　　　　　　C.1.6mmol/L NaF組　圖4　氟干預(yù)下成釉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)觀察Figure 4　Changes of ultrastructures of ameloblast after treated with NaF

2.5氟引起成釉細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

1.6 mmol/L NaF分別處理成釉細(xì)胞24，48 h，qRT-PCR顯示24，48 h組XBP1s mRNA 表達(dá)水平顯著高于對照組(見圖5)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；Western blot顯示24 h組、48 h組GRP-78 和CHOP蛋白質(zhì)水平顯著提高(見圖6)，且表達(dá)隨著處理時間的延長而增加。

3　討論

原代培養(yǎng)大鼠成釉細(xì)胞較好地保存了原組織細(xì)胞的遺傳特征和生物學(xué)特性，是研究氟作用下成釉細(xì)胞的各種功能變化及氟斑牙發(fā)生相關(guān)分子機(jī)制的理想模型[10]。近年來發(fā)現(xiàn)在氟斑牙的形成過程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERs)發(fā)揮著重要的作用[11]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處于應(yīng)激狀態(tài)，會產(chǎn)生大量的錯誤折疊蛋白，而蛋白質(zhì)的降解對于維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定是十分重要的，自噬過程通過降解長周期蛋白和損傷的細(xì)胞器，來清除細(xì)胞內(nèi)的垃圾[12]。自噬發(fā)生時，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量的雙層膜性結(jié)構(gòu)，包裹即將被降解的蛋白質(zhì)或細(xì)胞器，形成自噬小體。自噬小體形成后即被運(yùn)送到液泡或溶酶體中被降解，其中的物質(zhì)被循環(huán)利用。這一過程可以協(xié)助細(xì)胞在各種壓力脅迫狀態(tài)下得到緩解。

與對照組比較，**P<0.01圖5　氟對成釉細(xì)胞XBP1s mRNA表達(dá)影響Figure 5　Effect of fluoride on XBP1s mRNA levels in ameloblast

圖6　氟對成釉細(xì)胞GRP-78和CHOP蛋白表達(dá)水平的影響Figure 6　Effect of fluoride on GRP-78 and CHOP protein levels in ameloblast

本研究通過不同濃度的NaF作用于原代大鼠成釉細(xì)胞，觀察氟對成釉細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的影響。透射電鏡結(jié)果顯示，0.8 mmol/L NaF組與對照組相較，細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池樣擴(kuò)張，線粒體腫脹，體積增大，電子密度降低，溶酶體豐富，可見自噬樣結(jié)構(gòu)。1.6 mmol/L NaF組自噬樣結(jié)構(gòu)明顯增加，表明自噬被活化。通過倒置顯微鏡觀察，1.6 mmol/L NaF作用于成釉細(xì)胞48 h時，凋亡細(xì)胞數(shù)明顯多于同濃度氟作用于細(xì)胞24 h時。

近年研究發(fā)現(xiàn)，過量的氟作用于成釉細(xì)胞，首先引起ERs，進(jìn)而導(dǎo)致UPR[11]。UPR通過啟動自噬清除錯誤折疊蛋白，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，保護(hù)細(xì)胞減輕外界刺激損傷，使細(xì)胞存活[13]；而當(dāng)這種應(yīng)激刺激延長達(dá)到一定的時間點(diǎn)時，UPR可能會促進(jìn)凋亡信號途徑的活化[12]。

Caspase-12是介導(dǎo)ERS凋亡的關(guān)鍵分子，活化的caspase-12激活 caspase 家族的caspase-9、caspase-3 等，引起caspase介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[14]。UPR啟動后可引起一系列的分子改變，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白GRP78/Bip、Calnexin、GRP94等的表達(dá)增加，CHOP表達(dá)增加，以及XBP1 mRNA的剪切等。GRP78/Bip參與并監(jiān)控蛋白質(zhì)折疊；CHOP則可以抑制 Bip和Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。Kubota 等[11]發(fā)現(xiàn)，過量氟能導(dǎo)致 LS8 細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子 GADD153、GRP-78、XBP-1 等的表達(dá)量升高。這些都為在氟斑牙的形成過程中，氟介導(dǎo)ERs并激活UPR提供了有力依據(jù)。本實(shí)驗通過對 XBP1s mRNA 和GRP78/Bip和CHOP蛋白水平檢測，結(jié)果表明隨著1.6 mmol/L NaF干預(yù)成釉細(xì)胞時間延長，XBP1s mRNA表達(dá)升高，GRP-78/Bip和CHOP蛋白表達(dá)量亦隨之升高，進(jìn)一步驗證了在氟斑牙的形成過程中，過量氟導(dǎo)致了ERs并激活了UPR，并有可能通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑引起成釉細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究應(yīng)用不同濃度的NaF作用于原代培養(yǎng)的成釉細(xì)胞，觀察其對細(xì)胞的影響。研究結(jié)果表明，氟可導(dǎo)致ERs，并進(jìn)一步激活UPR，啟動自噬，ERs和自噬通過相互調(diào)控發(fā)揮保護(hù)性的作用，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，當(dāng)氟濃度達(dá)到一定水平或處理時間延長后，UPR不足以維持ER穩(wěn)態(tài), 細(xì)胞啟動由 ERs 所介導(dǎo)的凋亡信號通路，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

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Roles of fluoride in autophagy and apoptosis of primary rat ameloblasts induced by endoplasmic reticulum stress

WANG Lin*，WANG Danyang，WANG Feng，XIE Na

(DepartmentofStomatology,Xi’anMedicalUniversity,Xi’an710021,China;*Correspondingauthor,E-mail: 815365619@qq.com)

ObjectiveTo investigate the effects and mechanisms of fluoride on endoplasmic reticulum(ER) stress-induced autophagy and apoptosis of primary rat ameloblastsinvitro.MethodsAmeloblasts were isolated from tooth germ of maxillomandibular molar and culturedinvitro. Ameloblasts were treated with 0.8 mmol/L and 1.6 mmol/L NaF for 24 h and 48 h, respectively. Cell morphology and ultrastructure were observed under phase contrast microscopy and TEM after the cell growth reached to a stable stage. After ameloblasts were treated with 1.6 mmol/L NaF for 24 h and 48 h,XBP1s mRNA levels, expression of GRP78 and CHOP proteins were measured by real-time PCR and Western blot at each time point.ResultsUnder the phase contrast microscope, the cell morphology showed no obvious difference after treated with 0.8 mmol/L NaF between 24 h and 48 h. After treated with 1.6 mmol/L NaF, the number of apoptotic cells statistically higher at 48 h than that at 24 h. The TEM results showed the extension of rough endoplasmic reticulum cistern, swelling of mitochondria, enlarged cell body, decreased electron density, increased lysosome, and appearance of autophagic structure after treated with 0.8 mmol/L NaF for 24 h. Compared with 0.8 mmol/L NaF group, autophagic structures increased in 1.6 mmol/L NaF group. After treated with 1.6 mmol/L NaF, ER stress-related XBP1s mRNA, GRP-78, and CHOP proteins were significantly higher at 48 h than that at 24 h (P<0.01).ConclusionThe results suggest that fluoride could cause ER stress of ameloblast and induce the autophagy, thus lead to apoptosis as the treatment continues.

fluoride；ameloblast；endoplasmic reticulum stress;autophagy;apoptosis

陜西省教育廳專項科研計劃資助項目(2013JK0784)；西安醫(yī)學(xué)院口腔臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科支持項目

王琳，女，1980-04生，碩士，講師，E-mail：815365619@qq.com

2016-01-11

R363

A

1007-6611(2016)03-0242-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.03.011