基于UPLC/Q-TOF MS代謝組學(xué)技術(shù)分析影響遠(yuǎn)志商品藥材質(zhì)量的關(guān)鍵因素

許曉雙， 張艷花， 王丹丹，張福生， 秦雪梅， 彭　冰， 曾祖平

(1山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，太原　030006; 2山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院； 3北京市中醫(yī)研究所, 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院； *通訊作者，E-mail：ample1007@sxmu.edu.cn)

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基于UPLC/Q-TOF MS代謝組學(xué)技術(shù)分析影響遠(yuǎn)志商品藥材質(zhì)量的關(guān)鍵因素

許曉雙1,2， 張艷花1,2， 王丹丹1,2，張福生1*， 秦雪梅1， 彭冰3， 曾祖平3

(1山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，太原030006;2山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院；3北京市中醫(yī)研究所, 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院；*通訊作者，E-mail：ample1007@sxmu.edu.cn)

目的針對(duì)性地分析了產(chǎn)地、生長(zhǎng)方式、藥用部位等因素對(duì)山西產(chǎn)遠(yuǎn)志商品藥材質(zhì)量的影響，并找出關(guān)鍵影響因素。 方法首先將樣品進(jìn)行超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜分析，并采用主成分分析及聚類(lèi)分析等多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，分別比較了產(chǎn)地、生長(zhǎng)方式、藥用部位等因素對(duì)山西產(chǎn)遠(yuǎn)志商品藥材質(zhì)量的影響。結(jié)果①產(chǎn)地因素是影響現(xiàn)有遠(yuǎn)志商品藥材質(zhì)量的關(guān)鍵因素，指標(biāo)性成分3,6’-二芥子?；崽桥c遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ的含量高低可以間接反映出遠(yuǎn)志藥材整體質(zhì)量。②山西石樓、靜樂(lè)、盂縣的野生遠(yuǎn)志質(zhì)量較優(yōu)，而襄汾、聞喜的栽培遠(yuǎn)志質(zhì)量較好。③遠(yuǎn)志筒中化合物的相對(duì)含量高于根，根與筒間的主要差異物質(zhì)為Sibiricoses A6，3,6’-二芥子?；崽牵琓enuifoliose C，遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ，遠(yuǎn)志根與筒的選擇依據(jù)應(yīng)充分考慮臨床所治療疾病的特性，而不能一概而論。 結(jié)論產(chǎn)地因素是影響現(xiàn)有遠(yuǎn)志商品藥材質(zhì)量的關(guān)鍵因素，本研究為今后指導(dǎo)遠(yuǎn)志規(guī)范化種植以及產(chǎn)地粗加工和臨床精確用藥提供了科學(xué)依據(jù)。

遠(yuǎn)志；代謝組學(xué)；UPLC/Q-TOF MS；商品藥材；質(zhì)量

遠(yuǎn)志是我國(guó)常用的大宗藥材之一，主產(chǎn)于山西、陜西、河北等地[1]，為多年生草本植物遠(yuǎn)志(PolygalatenuifoliaWilld.)或卵葉遠(yuǎn)志(P.SibiricaL.)的干燥根[2]。目前，山西產(chǎn)栽培遠(yuǎn)志(P.tenuifolia)為市售遠(yuǎn)志商品藥材的主要來(lái)源。由于中藥材藥效的強(qiáng)弱與藥材質(zhì)量的優(yōu)劣密切相關(guān)，而藥材質(zhì)量的優(yōu)劣與藥材中所含主要化學(xué)成分含量的高低緊密相關(guān)。遠(yuǎn)志具有安神益智、祛痰消腫等功效[3]，其主要化學(xué)成分為皂苷類(lèi)、口山酮類(lèi)、糖酯類(lèi)等物質(zhì)，而產(chǎn)地(生長(zhǎng)環(huán)境)、生長(zhǎng)方式(野生、栽培)、生長(zhǎng)年限、藥用部位(根-未抽心、筒-抽心)等因素又會(huì)對(duì)上述化學(xué)成分的含量產(chǎn)生或大或小的影響，但關(guān)鍵影響因素至今仍尚未闡明，這已嚴(yán)重制約了現(xiàn)有遠(yuǎn)志商品藥材的生產(chǎn)與流通。

由于現(xiàn)有遠(yuǎn)志藥材質(zhì)量?jī)?yōu)劣評(píng)價(jià)體系仍存在著明顯不足[4,5]，而植物代謝組學(xué)技術(shù)(LC、GC、NMR等)可對(duì)植物提取物進(jìn)行無(wú)差別代謝成分的高通量全分析，擅長(zhǎng)尋找不用樣品間的差異代謝物。超高液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC/Q-TOF MS)技術(shù)是將液相的高分離效能與質(zhì)譜的強(qiáng)大結(jié)構(gòu)鑒定功能結(jié)合起來(lái)，是一項(xiàng)使中草藥中復(fù)雜化學(xué)成分得到快速分析的重要技術(shù)，且該技術(shù)在遠(yuǎn)志化學(xué)成分的分析中已得到了成功應(yīng)用[6-9]。因此，基于UPLC/Q-TOF MS的代謝組學(xué)技術(shù)具有備樣時(shí)間短、分析時(shí)間短、適用范圍廣且既可定性又可半定量等優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)了現(xiàn)有藥材質(zhì)量?jī)?yōu)劣化學(xué)評(píng)價(jià)體系中的諸多不足[10]。本課題組前期[11]已成功采用UPLC/Q-TOF MS代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)不同生長(zhǎng)年限遠(yuǎn)志藥材中的次級(jí)代謝物進(jìn)行了比較，客觀、全面地揭示生長(zhǎng)年限對(duì)遠(yuǎn)志藥材質(zhì)量的影響，也為現(xiàn)有中藥材質(zhì)量?jī)?yōu)劣評(píng)價(jià)方法提供一種新的思路。鑒于目前遠(yuǎn)志商品藥材的生長(zhǎng)年限較為統(tǒng)一且藥材主要來(lái)源于山西，因此，本研究采用UPLC/Q-TOF MS代謝組學(xué)技術(shù)，針對(duì)性地分析產(chǎn)地、生長(zhǎng)方式、用藥部位等因素對(duì)山西產(chǎn)遠(yuǎn)志商品藥材質(zhì)量的影響，并找出關(guān)鍵影響因素，以期為今后指導(dǎo)遠(yuǎn)志的規(guī)范化種植以及產(chǎn)地粗加工和臨床精確用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1儀器與材料

ACQUITY UPLC I-Class/ Xevo G2 Q TOF(美國(guó)Waters公司)，色譜柱：Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm × 50 mm，1.7 μm，美國(guó)Waters公司)，BSA124S電子天平(德國(guó)sartorius公司)，KQ5200E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，甲醇(色譜純，Tedia.美國(guó))，乙腈(色譜純，Tedia.美國(guó))，甲醇(分析純≥99.5%，北京化工廠)，純凈水(杭州娃哈哈公司集團(tuán)有限公司)。遠(yuǎn)志藥材收集于山西臨汾的襄汾、石樓，運(yùn)城的聞喜、夏縣，忻州的定襄、河曲、靜樂(lè)，陽(yáng)泉的盂縣8個(gè)產(chǎn)地(見(jiàn)表1)，經(jīng)山西大學(xué)秦雪梅教授鑒定為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志(P.tenuifoliaWilld.)的干燥根。上述遠(yuǎn)志樣品分別經(jīng)人工去心后，得到遠(yuǎn)志筒，每個(gè)產(chǎn)地有根、筒2份樣品(見(jiàn)表1)。憑證標(biāo)本保存在山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心。

1.2樣品制備

將表1中的遠(yuǎn)志樣品分別采用四分法，平行三次取樣，研磨，過(guò)藥典三號(hào)篩，取粉末約1 g，精密稱定。置于具塞試管中，加入50 ml甲醇，混勻，稱重，超聲提取30 min，補(bǔ)足減失重量，靜置，過(guò)濾。取續(xù)濾液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜備用，每份樣品溶液平行進(jìn)樣2次。

表1山西省不同產(chǎn)地不同生長(zhǎng)方式遠(yuǎn)志根與筒樣品表

Table 1The roots and cortices ofP.tenuifoliain different growth pattern of samples from different regions of Shanxi

編號(hào)來(lái)源(生長(zhǎng)方式) 根(G)筒(T)1山西省臨汾市襄汾縣南賈村(栽培)G1T12山西省臨汾市石樓縣小蒜村(野生)G2T23山西省運(yùn)城市聞喜縣辛村(栽培)G3T34山西省運(yùn)城市夏縣中條山藥材市場(chǎng)(栽培)G4T45山西省忻州市定襄縣上靈山村(野生)G5T56山西省忻州市河曲縣巡鎮(zhèn)(野生)G6T67山西省忻州市靜樂(lè)縣朝陽(yáng)山(野生)G7T78山西省陽(yáng)泉市盂縣鄭溝村(野生)G8T8

1.3色譜條件

流動(dòng)相為乙腈(A)和0.1%甲酸水(B)，洗脫梯度為：0-1 min，5%A；1-3 min，5%-12%A；3-6 min，12%-20%A；6-10 min，20%-30%A；10-10.5 min，30%-35%A；10.5-13.5 min，35%-45%A；13.5-15 min，45%-50%A；15-18 min，50%-95%A；18-19 min，95%A；19-20 min，95%-100%A。運(yùn)行時(shí)間為20 min，流速為0.4 ml/min，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量2 μl。

1.4質(zhì)譜條件

遠(yuǎn)志樣品在負(fù)離子模式下的離子化效果優(yōu)于正離子模式，故本文采用電噴霧負(fù)離子模式檢測(cè)。霧化氣體為高純度氮?dú)?N2)，碰撞氣體為超高純氦氣(He)。檢測(cè)的質(zhì)量數(shù)范圍為50-2 000 D，錐孔電壓40 V，毛細(xì)管電壓2.5 kV，源溫度100 ℃，脫溶劑氣溫度500 ℃，脫溶劑氣體流速為800 L/h,錐孔氣流量50 L/h，碰撞能量(CE)50-80 V，碰撞氣體：氬氣(Ar)。LockMass：亮氨酸腦啡肽，m/z為554.261 5。

1.5數(shù)據(jù)分析

采用UPLC/Q-TOF MS代謝組學(xué)技術(shù)，分析產(chǎn)地、生長(zhǎng)方式、藥用部位等因素對(duì)山西產(chǎn)遠(yuǎn)志商品藥材質(zhì)量的影響，其備樣方法、色譜條件與質(zhì)譜條件[11,12]見(jiàn)1.3與1.4。然后結(jié)合UPLC/Q-TOF MS的總離子流色譜圖及文獻(xiàn)[7-9]，依據(jù)化合物的質(zhì)荷比、保留時(shí)間及特征碎片離子，對(duì)化合物進(jìn)行推斷指認(rèn)。UPLC/Q-TOF MS原始數(shù)據(jù)矩陣圖是由Waters公司自帶的軟件TransOmicsTM生成，對(duì)其進(jìn)行面積歸一化后，采用SIMCA-P 13.0(Umetrics，Umea，Sweden)軟件進(jìn)行主成分分析(PCA)，再用偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)進(jìn)行外部模型驗(yàn)證，然后再用正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)及S-plot分析找出差異代謝產(chǎn)物。采用SPSS 16(IBM SPSS, USA)軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行聚類(lèi)分析，并對(duì)不同組內(nèi)樣品差異代謝物相對(duì)含量進(jìn)行獨(dú)立t檢驗(yàn)(Independent-Samples T Test)，最后運(yùn)用GraphPad Prism 5.0(USA)軟件對(duì)遠(yuǎn)志中化合物的相對(duì)含量進(jìn)行作圖。

2　結(jié)果

2.1UPLC/Q-TOF MS圖譜分析

基于UPLC/Q-TOF MS數(shù)據(jù)，本文共推斷指認(rèn)出29個(gè)化合物(見(jiàn)表2)，其中包括：6個(gè)寡糖酯類(lèi)(No.1-6)，4個(gè)口山酮類(lèi)(No.7-10)，10個(gè)低聚糖類(lèi)(No.11-20)及9個(gè)皂苷類(lèi)(No.21-29)。

表2基于UPLC/Q-TOF-MS (負(fù)離子模式)推斷指認(rèn)的化合物

Table 2Compounds identification ofP.tenuifoliabased on the UPLC/Q-TOF MS(negative ion mode)

編號(hào)化合物名稱 分子式保留時(shí)間(min)分子量測(cè)量值理論值主要離子碎片(m/z)參考文獻(xiàn)1SibiricosesA5C22H30O142.2975517.1554517.1563160.0155,175.0389,193.050672SibiricosesA6C23H30O152.5591547.1660547.1668175.0022,190.0258,205.0492,341.1063,367.102183TenuifolisideBC30H36O174.5026667.1874667.1880137.0233,190.0259,205.0491,239.0550,461.1230743,6’-Disinapoylsu-croseC34H42O195.59361507.44871507.4568367.1017,529.1556,547.1666,753.2246,205.045975TenuifolisideAC31H38O176.3578681.2033681.2036137.0223,179.0337,239.0546,263.0561,281.0659,443.118476TenuifolisideCC34H44O197.4113767.2400767.2404190.0257,205.0492,223.0589,237.0763,265.0708,367.0992,529.155987LancerinC19H18O103.2560405.0807405.0822257.0449,285.042378SibiricaxanthoneAC24H26O143.6405537.1243537.1250243.0288,267.0287,285.0385,297.0389,387.0622,405.082279PolygalaxanthoneⅢC25H28O154.1643567.1352567.1355315.0491,357.0477,272.0311,345.05917101,6-Dihydroxy-3,7-dimethoxyxanthoneC15H12O611.3884287.0547287.0553272.0294711TenuifolioseLC67H84O387.51831495.44841495.4568145.0283,795.2336,1039.3152,1081.3248,1143.3423,1161.3529,1203.3630,1307.3900712TenuifolioseKC57H70O327.59541265.37621265.3777851.2695,973.2956,997.3049,1077.3441,1119.3379813TenuifolioseFC68H86O397.71231525.45671525.4668795.2344,1039.3168,1143.3463,1203.3606,1379.4071814TenuifolioseCC58H72O337.84631295.38681295.3883851.2665,973.3097,997.3091,1119.3455715TenuifolioseⅠC59H72O338.13421307.38661307.3926145.0282,163.0387,997.3039,1101.3309,1119.3409,1143.3359,1161.3508,1247.3812,1265.3744716TenuifolioseGC66H84O386.67161483.44881483.4568175.0385,753.2220,997.3002,1119.3412,1161.3560717TenuifolioseBC60H74O348.38881337.39661337.39891101.3317,1119.3401,1161.3534,1295.3958718TenuifolioseHC61H74O349.05331349.39651349.3989145.0281,1203.3624719TenuifolioseNC63H78O369.52571409.41551409.4200337.0911,703.2092,825.2554,1051.3103,1069.3279,1191.3634720TenuifolioseAC62H76O359.33361379.40651379.40941203.3619,1161.3524,1039.3153,1143.3455,1119.3451721PolygalasaponinxxⅧC53H84O249.06591103.52801103.5280425.3049,455.3155722OnjisaponinTFC59H94O289.34871249.58401249.5894425.3048,455.3156723OnjisaponinTEC70H110O369.39481525.66041525.66991381.6287724OnjisaponinSC81H122O4011.60581733.72081733.7440425.3067 7-925SeneginⅣC80H120O3911.95691703.71351703.7329699.2354,1480.6761,1673.7063 7,826OnjisaponionTC84H128O4112.19191791.72351791.74891761.7156727SeneginⅢC75H112O3512.29791571.67981571.69061348.6349,1541.1254928PolygalasaponinXXXⅡC79H118O3812.51541673.70411673.72281449.6639729OnjisaponinWC81H120O4012.92191731.72311731.72831587.67327

3,6’-Disinapoyl sucrose：3,6’-二芥子酰基蔗糖；Polygalaxanthone Ⅲ：遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ

為了進(jìn)一步明確這29個(gè)化合物在遠(yuǎn)志樣品中的含量變化，將UPLC/Q-TOF MS數(shù)據(jù)的所有保留時(shí)間對(duì)應(yīng)的色譜峰面積進(jìn)行歸一化后，將上述化合物的相對(duì)含量的百分比做柱狀圖分析(見(jiàn)圖1)。結(jié)果表明，這29個(gè)化合物在遠(yuǎn)志根與筒中的相對(duì)含量各不相同，其中以Tenuifoliside A的相對(duì)含量為最高。由圖1可知，Lancern，1,6-dihydroxy-3,7-dimethoxyxanthone,Tenuifoliose L,Tenuifoliose K,Tenuifoliose F,Tenuifoliose G,Tenuifoliose N,Tenuifoliose A,Onjisaponin TF,Onjisaponin TE,Onjisaponin S,Onjisaponin T,Onjisaponin W,Polygalasaponin ⅩⅩⅩⅡ14個(gè)化合物的相對(duì)含量較小(<0.25%)，因此推測(cè)這14個(gè)化合物的含量即使發(fā)生變化，對(duì)遠(yuǎn)志根與筒的總化學(xué)成分含量影響也較小。因此，在本文后續(xù)的多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析以及差異代謝物的尋找過(guò)程中，這14個(gè)化合物將不予繼續(xù)指認(rèn)與分析。

1.sibiricoses A5； 2.sibiricoses A6； 3.Tenuifoliside B； 4.3,6’-Disinapoly sucrose； 5.Tenuifoliside A； 6.Tenuifoliside C； 7.Lancerin； 8.Sibiricaxanthone； 9.Polygalaxanthone Ⅲ； 10.1,6-Dihydroxy-3，7-dimethoxyxanthone； 11.Tenuifoliose L； 12.Tenuifoliose K； 13.Tenuifoliose F； 14.Tenuifoliose C； 15.Tenuifoliose I； 16.Tenuifoliose G； 17.Tenuifoliose B； 18.Tenuif-oliose H； 19.Tenuifoliose N； 20.Tenuifoliose A； 21.Polygalasaponin ⅹⅹ Ⅷ； 22.Onjisaponin TF； 23.Onjisaponion TE； 24.Onjisaponin S； 25.Senegin Ⅳ； 26.Onjisaponion T； 27.Senegin Ⅲ； 28.Polygalasaponin ⅩⅩⅩⅡ； 29.Onjisaponin W圖1　遠(yuǎn)志根與筒中29個(gè)化合物的相對(duì)含量Figure 1　The relative contents of 29 compounds in the roots and cortices of P.tenuifolia

2.2遠(yuǎn)志商品藥材質(zhì)量的影響因素分析

產(chǎn)地、生長(zhǎng)方式、用藥部位等是目前影響遠(yuǎn)志商品藥材質(zhì)量的主要因素。首先，將表1中遠(yuǎn)志樣品分別按上述因素進(jìn)行分類(lèi)：①產(chǎn)地因素：1，3，4號(hào)樣品產(chǎn)于山西南部(晉南)，6號(hào)樣品產(chǎn)于山西北部(晉北)，2，5，7，8號(hào)樣品產(chǎn)于山西中部(晉中)；②生長(zhǎng)方式因素：1，3，4號(hào)樣品為栽培品，2，5，6，7，8號(hào)樣品為野生品；③藥用部位因素：1-8號(hào)樣品均分別包含根與筒。

為了進(jìn)一步明確產(chǎn)地、生長(zhǎng)方式、用藥部位等因素對(duì)遠(yuǎn)志商品藥材質(zhì)量影響的大小，故將表1中8個(gè)不同產(chǎn)地遠(yuǎn)志樣品的UPLC/Q-TOF MS原始數(shù)據(jù)經(jīng)面積歸一化后，分別進(jìn)行PCA分析(見(jiàn)圖2A)和聚類(lèi)分析(見(jiàn)圖2B)。

圖2A結(jié)果表明：①同一個(gè)產(chǎn)地的遠(yuǎn)志根與筒無(wú)明顯區(qū)分；②1，3，4號(hào)樣品(晉南，栽培)無(wú)明顯區(qū)分，與7號(hào)樣品(晉中，野生)同在t[1]軸的左邊；③6號(hào)樣品(晉北，野生)與2，5，7，8號(hào)樣品(晉中，野生)同在t[1]軸的右邊，且與5、8號(hào)樣品無(wú)明顯區(qū)分。上述結(jié)果表明，PCA分析只能明確產(chǎn)地及生長(zhǎng)方式因素對(duì)遠(yuǎn)志商品藥材質(zhì)量的影響強(qiáng)于藥用部位。

圖2B(采用歐氏距離測(cè)量及Ward法連結(jié)作圖的聚類(lèi)分析圖)結(jié)果表明：①同一個(gè)產(chǎn)地的遠(yuǎn)志根與筒均明顯聚為一類(lèi)；②閾值為20時(shí)，1，3，4號(hào)樣品與其他樣品分別聚為兩大類(lèi)；③閾值為17時(shí)，1，3，4為一類(lèi)，6單獨(dú)為一類(lèi)，2，5，7，8則為另一類(lèi)。該聚類(lèi)分析結(jié)果與之前PCA分析結(jié)果基本一致。

綜上所述，PCA與聚類(lèi)分析均只能明確產(chǎn)地及生長(zhǎng)方式因素對(duì)遠(yuǎn)志商品藥材質(zhì)量的影響強(qiáng)于藥用部位，而無(wú)法判斷產(chǎn)地與生長(zhǎng)方式對(duì)遠(yuǎn)志商品藥材質(zhì)量影響的大小。因此，本文將繼續(xù)針對(duì)產(chǎn)地、生長(zhǎng)方式、藥用部位三因素分別進(jìn)行單因素分析，以期從中找出影響遠(yuǎn)志商品藥材質(zhì)量的關(guān)鍵因素。

A.PCA散點(diǎn)圖　　　　　　　　　　　　　　　　　B.聚類(lèi)分析圖2　遠(yuǎn)志樣品的PCA散點(diǎn)圖和聚類(lèi)圖(G1-G8，T1-T8見(jiàn)表1)Figure 2　The scattered plots of PCA (A) and clustering plot (B) of all the roots and cortices of P.tenuifolia (G1-G8，T1-T8 seen in Table 1)

2.2.1產(chǎn)地因素對(duì)遠(yuǎn)志商品藥材質(zhì)量的影響首先，分別對(duì)栽培(1，3，4號(hào)樣品，圖3A-C)與野生(2，5，7，8號(hào)樣品，圖3D-H)遠(yuǎn)志樣品進(jìn)行PCA分析，并通過(guò)逐漸減少產(chǎn)地，進(jìn)而驗(yàn)證產(chǎn)地因素對(duì)遠(yuǎn)志商品藥材質(zhì)量的影響大于藥用部位(見(jiàn)圖3)。結(jié)果表明：①隨著產(chǎn)地的減少，栽培遠(yuǎn)志樣品的根與筒沿t[1]軸分開(kāi)的趨勢(shì)越來(lái)越明顯(圖3A-C)；②野生遠(yuǎn)志樣品按不同產(chǎn)地可明顯區(qū)分(見(jiàn)圖3D)，且去掉6號(hào)樣品后，剩余遠(yuǎn)志樣品間區(qū)分的趨勢(shì)未變(見(jiàn)圖3E)；③無(wú)論繼續(xù)去掉7號(hào)樣品或2號(hào)樣品，對(duì)剩余遠(yuǎn)志樣品的PCA分類(lèi)趨勢(shì)均無(wú)明顯影響(見(jiàn)圖3F-G)；④當(dāng)產(chǎn)地減少為兩個(gè)時(shí)，同一產(chǎn)地的遠(yuǎn)志根與筒才可明顯區(qū)分(見(jiàn)圖3H)。該結(jié)果與之前PCA與聚類(lèi)分析(見(jiàn)圖2)結(jié)果一致，驗(yàn)證了產(chǎn)地因素對(duì)遠(yuǎn)志商品藥材質(zhì)量的影響明顯大于藥用部位。

之后，為了進(jìn)一步明確不同產(chǎn)地對(duì)遠(yuǎn)志商品藥材質(zhì)量影響的大小，故將遠(yuǎn)志中的15個(gè)主要化合物(圖1中相對(duì)含量>0.25%)進(jìn)行相對(duì)含量堆積后，做柱狀圖分析(見(jiàn)圖4)。結(jié)果表明：①遠(yuǎn)志筒中主要化合物的相對(duì)含量高于遠(yuǎn)志根(見(jiàn)圖4A)，2，7，8號(hào)遠(yuǎn)志樣品(野生)和1，3號(hào)遠(yuǎn)志樣品(栽培)中主要化合物的相對(duì)含量分別高于同類(lèi)其他樣品，提示上述遠(yuǎn)志樣品質(zhì)量較優(yōu)；②1-8號(hào)遠(yuǎn)志樣品中的3,6’-二芥子酰基蔗糖(圖4B)、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ(圖4C)、寡糖酯類(lèi)(圖4D)、口山酮類(lèi)(圖4E)化合物的相對(duì)含量變化趨勢(shì)與圖4A基本一致，提示以3,6’-二芥子?；崽?、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ作為遠(yuǎn)志含量測(cè)定的指標(biāo)性成分，有一定的科學(xué)依據(jù)；③低聚糖類(lèi)(圖4F)與皂苷類(lèi)(圖4G)化合物的相對(duì)含量變化趨勢(shì)與圖4A不完全相同，推測(cè)皂苷類(lèi)化合物相對(duì)含量較低的原因可能與遠(yuǎn)志樣品制備方法有關(guān)。

2.2.2生長(zhǎng)方式因素對(duì)遠(yuǎn)志商品藥材質(zhì)量的影響生長(zhǎng)方式是影響遠(yuǎn)志商品藥材質(zhì)量的另一個(gè)重要的因素。由于在樣品收集時(shí)，未能收集到同一產(chǎn)地的野生與栽培遠(yuǎn)志樣品，因此本文只評(píng)價(jià)栽培遠(yuǎn)志與野生遠(yuǎn)志的整體化學(xué)成分差異。圖4A的結(jié)果已表明，栽培遠(yuǎn)志中主要化合物相對(duì)含量的變化范圍要小于野生遠(yuǎn)志。

為了進(jìn)一步了解生長(zhǎng)方式因素對(duì)遠(yuǎn)志商品藥材質(zhì)量影響的大小，故采用突出組間差異的有監(jiān)督的PLS-DA來(lái)分析栽培與野生遠(yuǎn)志樣品間的化學(xué)差異。PLS-DA的分析是以外部模型成立為基礎(chǔ)，本文外部模型驗(yàn)證的參數(shù)分別為(R2X=0.381，R2Y=0.980，Q2=0.978)，且左端任何一次隨機(jī)排列產(chǎn)生的R2、Q2均小于右端，表明該模型有效可靠。隨后，依據(jù)S-plot得分散點(diǎn)圖并結(jié)合VIP>1來(lái)尋找栽培與野生間差異代謝物，共找到12個(gè)差異代謝物(見(jiàn)表3)，分別為：寡糖酯類(lèi)5個(gè)：Sibiricoses A5，Sibiricoses A6，Tenuifoliside B，Tenuifoliside A，Tenuifoliside C；口山酮類(lèi)(1個(gè))：Sibiricaxanthone A；低聚糖類(lèi)3個(gè)：Tenuifoliose C，Tenuifoliose Ⅰ，Tenuifoliose B；皂苷類(lèi)3個(gè)：Polygalasaponin XXⅧ,Senegin Ⅲ,Senegin Ⅳ。

與栽培遠(yuǎn)志相比，野生遠(yuǎn)志中的Sibiricoses A5(P<0.001)、Sibiricoses A6(P<0.001)、Sibiricaxanthone A (P<0.001)、Tenuifoliside B(P<0.001)、Tenuifoliside A(P<0.001)、Senegin Ⅳ(P<0.01)相

圖3　栽培(A,B,C)與野生(D,E,F,G,H) 遠(yuǎn)志樣品依次減少的PCA散點(diǎn)圖(G1-G8，T1-T8見(jiàn)表1)Figure 3　The PCA scattered plots of decreasing numbers of cultivated(A,B,C) and wild(D,E,F,G,H) samples of P.tenuifolia (G1-G8，T1-T8 found in Table 1)

對(duì)含量較高，而Tenuifoliside C(P<0.001)、Tenuifoliose C(P<0.001)、Tenuifoliose I(P<0.05)、Tenuifoliose B(P<0.001)、Polygalasaponin xxⅧ(P<0.05)、Senegin Ⅲ(P<0.01)相對(duì)含量較低。該結(jié)果表明，野生遠(yuǎn)志中的口山酮類(lèi)與寡糖酯類(lèi)物質(zhì)含量較高，而栽培遠(yuǎn)志中的皂苷類(lèi)與低聚糖類(lèi)物質(zhì)的含量則較高。

2.2.3藥用部位不同對(duì)遠(yuǎn)志商品藥材質(zhì)量的影響藥用部位(根與筒)的選擇是影響現(xiàn)有遠(yuǎn)志商品藥材質(zhì)量的主要因素之一,而之前的結(jié)果已表明，遠(yuǎn)志筒中主要化合物的相對(duì)含量高于遠(yuǎn)志根(見(jiàn)圖4A)。為了進(jìn)一步明確遠(yuǎn)志筒與根中的主要化學(xué)差異，本文采用2.2項(xiàng)下相同的方法尋找差異代謝物。遠(yuǎn)志根與筒的PLS-DA分析的模型驗(yàn)證的參數(shù)分別為R2X=0.481，R2Y=0.948，Q2=0.916，且左端任何一次隨機(jī)排列產(chǎn)生的R2、Q2均小于右端，表明該模型有效可靠。依據(jù)S-plot的得分散點(diǎn)圖并結(jié)合VIP>1來(lái)尋找遠(yuǎn)志根與筒間的差異代謝物，共找到12個(gè)差異代謝物(見(jiàn)表4)，分別為：寡糖酯類(lèi)5個(gè)：Sibiricoses A5，Sibiricoses A6，3,6’-二芥子?；崽牵琓enuifoliside B，Tenuifoliside A;口山酮類(lèi)1個(gè)：Sibiricaxanthone A;低聚糖類(lèi)4個(gè)：Tenuifoliose C;Tenuifoliose I，Tenuifoliose B，Tenuifoliose H;皂苷類(lèi)2個(gè)：Polygalasaponin XXⅧ，Senegin Ⅲ。

圖4　不同產(chǎn)地遠(yuǎn)志根與筒中總化合物(A)，3’6-二芥子?；崽?B)，遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ(C)，寡糖酯類(lèi)化合物(D)，口山酮類(lèi)化合物(E)，低聚糖類(lèi)化合物(F)，皂苷類(lèi)化合物(G)的相對(duì)含量變化折線圖(產(chǎn)地1-8見(jiàn)表1)Figure 4　The relative contents of all comprounds(A),3,6’-Disinapoyl sucrose(B), Polygalaxanthone Ⅲ(C),Oligosaccharide esters(D),Xanthones(E),Oligosaccharides(F),and Saponins(G) in roots and cortices of P.tenuifolia from different 8 regions(regions 1-8 see Table 1)

表3栽培與野生遠(yuǎn)志指認(rèn)的差異代謝物

Table 3Differential metabolites in different growth pattern of P. tenuifolia

編號(hào)名稱 保留時(shí)間(min)分子量VIP差異倍數(shù)(野生/栽培)1SibiricosesA52.2975517.15545.571.42↑***2SibiricosesA62.5591547.16604.661.45↑***8SibiricaxanthoneA3.6405537.12435.851.80↑***3TenuifolisideB4.5026667.18747.193.92↑***5TenuifolisideA6.3578681.20334.471.27↑***6TenuifolisideC7.4113767.24004.390.71↓***14TenuifolioseC7.84631295.38684.120.32↓***15TenuifolioseI8.13421307.38661.150.79↓*17TenuifolioseB8.38881337.39665.440.36↓***21PolygalasaponinⅹⅹⅧ9.06591103.52801.540.78↓*25SeneginⅣ11.95691703.71351.511.31↑**27SeneginⅢ12.29791571.67982.080.79↓**

與栽培的相比,↑,↓表示野生遠(yuǎn)志中相對(duì)含量的升高或降低,***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05；No.1-27見(jiàn)表1

表4結(jié)果表明，①除Tenuifoliose H、Senegin Ⅲ外，其余10個(gè)差異代謝物在遠(yuǎn)志筒中的相對(duì)含量均高于遠(yuǎn)志根，②只有Sibiricoses A6，3,6’-二芥子?；崽桥cTenuifoliose C的相對(duì)含量在遠(yuǎn)志根與筒中具有顯著差異。

3　討論

3.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

本文采用UPLC/Q-TOF MS代謝組學(xué)技術(shù)針對(duì)性地分析了產(chǎn)地、生長(zhǎng)方式、藥用部位等因素對(duì)山西產(chǎn)遠(yuǎn)志商品藥材質(zhì)量的影響，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)地、生長(zhǎng)方式因素對(duì)遠(yuǎn)志商品藥材質(zhì)量的影響均大于藥用部位。此外，因客觀原因，本文未能收集到同一產(chǎn)地下的栽培與野生遠(yuǎn)志樣品，因此在單因素分析過(guò)程中，暫無(wú)

表4遠(yuǎn)志根與筒指認(rèn)的差異代謝物

Table 4Differential metabolites in different samples of P. tenuifolia.

編號(hào)名稱 保留時(shí)間(min)分子量VIP差異倍數(shù)(筒/根)1SibiricosesA52.2975517.15541.031.02↑ 2SibiricosesA62.5591547.16607.531.17↑**8SibiricaxanthoneA3.6405537.12432.371.06↑3TenuifolisideB4.5026667.18743.721.16↑43,6’-二芥子酰基蔗糖5.59361507.44876.091.31↑***5TenuifolisideA6.3578681.20333.171.05↑14TenuifolioseC7.84631295.38683.681.34↑*15TenuifolioseI8.13421307.38663.121.20↑17TenuifolioseB8.38881337.39663.901.23↑18TenuifolioseH9.05331349.39651.650.93↓21PolygalasaponinⅹⅹⅧ9.06591103.52801.071.05↑27SeneginⅢ12.29791571.67982.930.91↓

與根相比,↑,↓表示筒中相對(duì)含量的升高或降低,***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05； No.1-27見(jiàn)表1

法明確產(chǎn)地與生長(zhǎng)方式中的哪個(gè)因素對(duì)遠(yuǎn)志商品藥材質(zhì)量的影響更大。鑒于目前市售遠(yuǎn)志商品藥材絕大部分為栽培遠(yuǎn)志，且野生遠(yuǎn)志藥材的蘊(yùn)藏量少且產(chǎn)地不統(tǒng)一等諸多原因，因此本文最終推測(cè)產(chǎn)地因素是影響現(xiàn)有遠(yuǎn)志商品藥材質(zhì)量的關(guān)鍵因素。

3.2影響遠(yuǎn)志商品藥材質(zhì)量的關(guān)鍵因素分析

遠(yuǎn)志商品藥材的質(zhì)量?jī)?yōu)劣將直接影響到遠(yuǎn)志的臨床療效，而產(chǎn)地因素又對(duì)遠(yuǎn)志商品藥材質(zhì)量有較大影響，因此建議在選購(gòu)山西產(chǎn)遠(yuǎn)志商品藥材時(shí)，可以優(yōu)先考慮藥材的產(chǎn)地，如選擇晉南的栽培遠(yuǎn)志或晉中的野生遠(yuǎn)志，最后再考慮選擇遠(yuǎn)志根或筒。由于遠(yuǎn)志植物喜陽(yáng)，目前，晉南地區(qū)是遠(yuǎn)志商品藥材的主要種植基地，且質(zhì)量也相對(duì)穩(wěn)定；而晉中地區(qū)由于其地理位置的東西跨度較大，導(dǎo)致該地區(qū)的野生遠(yuǎn)志分布較分散，進(jìn)而引起野生遠(yuǎn)志質(zhì)量差異較大，但該區(qū)域野生遠(yuǎn)志中的口山酮類(lèi)與寡糖酯類(lèi)物質(zhì)含量相對(duì)較高，因此，建議可適當(dāng)對(duì)晉中野生遠(yuǎn)志品種進(jìn)行遠(yuǎn)志藥材的良種選育，且今后遠(yuǎn)志的種植區(qū)域可適度從晉南向晉中小范圍遷移。此外，由于晉北地區(qū)不適宜遠(yuǎn)志生長(zhǎng)，且質(zhì)量較差，因此不建議在晉北地區(qū)種植遠(yuǎn)志。

2015版《藥典》中，3,6’-二芥子?；崽恰⑦h(yuǎn)志口山酮Ⅲ、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷是評(píng)價(jià)遠(yuǎn)志藥材質(zhì)量?jī)?yōu)劣的指標(biāo)性成分[2]。本文研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)(圖4)，3,6’-二芥子?；崽?、遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ等單一成分的相對(duì)含量，分別與寡糖酯類(lèi)、口山酮等單類(lèi)化合物的相對(duì)含量以及遠(yuǎn)志中主要化合物相對(duì)總含量的變化趨勢(shì)趨于一致，驗(yàn)證了指標(biāo)性成分3,6’-二芥子?；崽恰⑦h(yuǎn)志口山酮Ⅲ含量高低可以間接反映出遠(yuǎn)志藥材質(zhì)量的優(yōu)劣。此外，本課題組前期在研究不同生長(zhǎng)年限對(duì)遠(yuǎn)志藥材質(zhì)量的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ等口山酮類(lèi)和Tenuifoliose H等部分低聚糖類(lèi)化合物的相對(duì)含量會(huì)隨著年限的延長(zhǎng)而降低[11]；但就商品藥材來(lái)而言，1年生遠(yuǎn)志根太細(xì)且產(chǎn)量太低，無(wú)法進(jìn)入市場(chǎng)流通。因此，綜上所述，本文認(rèn)為遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ可以作為評(píng)價(jià)遠(yuǎn)志商品藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)性成分。另由于遠(yuǎn)志樣品制備方法的不同，在本文的UPLC/Q-TOF MS圖譜分析中，未指認(rèn)出細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷。

3.3關(guān)于遠(yuǎn)志商品藥材臨床用藥選擇依據(jù)的討論

本課題組曾對(duì)遠(yuǎn)志筒與根進(jìn)行了HPLC指紋圖譜及化學(xué)差異性分析，由于受材料樣品所限，未能對(duì)同一產(chǎn)地的遠(yuǎn)志根與筒樣品進(jìn)行分析，所得“遠(yuǎn)志筒與根所含的有效成分含量存在一定的差異，但遠(yuǎn)志根中有效成分的含量要高于遠(yuǎn)志筒”結(jié)果有一定的片面性[13]。本文經(jīng)對(duì)同一產(chǎn)地遠(yuǎn)志根與筒的差異性進(jìn)行分析后證明：①遠(yuǎn)志筒中主要化合物的相對(duì)含量高于遠(yuǎn)志根，與文獻(xiàn)[14]所報(bào)道的結(jié)果一致，該結(jié)果也是對(duì)本課題組前期研究結(jié)果[13]的更正、補(bǔ)充與完善；②引起遠(yuǎn)志根與筒間化學(xué)差異的主要差異代謝物為：Sibiricoses A6，3,6’-二芥子酰基蔗糖，Tenuifoliose C，而遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ雖未被指認(rèn)成差異代謝物，但在筒中的相對(duì)含量高于根(見(jiàn)圖1)，與“根與筒間的主要差異物質(zhì)為3,6’-二芥子?；崽桥c遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ”結(jié)果[13]基本一致。

藥材發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)是化學(xué)成分，Sibiricoses A6、3,6’-二芥子?；崽窃谶h(yuǎn)志中均屬于寡糖酯類(lèi)成分，而Tenuifoliose C則屬于低聚糖類(lèi)成分。目前，已有研究證明上述成分是遠(yuǎn)志安神及抗抑郁的活性成分。劉屏等[15]發(fā)現(xiàn)3,6’-二芥子酰基蔗糖對(duì)藥物誘發(fā)抑郁模型有顯著的抗抑郁活性；聶淑琴等[16]曾報(bào)道寡糖酯類(lèi)化合物Tenuifoliside A在體內(nèi)腸道細(xì)菌的作用下，在腦內(nèi)能轉(zhuǎn)化成具有鎮(zhèn)靜活性的3，4，5-三甲氧基桂皮酸(TMCA)而產(chǎn)生持續(xù)的鎮(zhèn)靜作用。因此，建議今后在選用遠(yuǎn)志藥材治療抑郁病、失眠等疾病時(shí)，可針對(duì)性地選擇上述成分含量較高的遠(yuǎn)志筒；如要發(fā)揮遠(yuǎn)志藥材的祛痰、消腫等功效時(shí)，遠(yuǎn)志根與筒則可以混用。由此可見(jiàn)，遠(yuǎn)志藥用部位(根與筒)的選擇，應(yīng)充分考慮臨床所治療疾病的特性，而不能一概而論。該結(jié)果為遠(yuǎn)志產(chǎn)地粗加工及臨床精確用藥提供了一定的科學(xué)依據(jù)。當(dāng)然上述結(jié)果還有待于后續(xù)對(duì)遠(yuǎn)志根與筒進(jìn)行藥效學(xué)與毒理學(xué)(如《雷公炮炙論》：遠(yuǎn)志，若不去心，服之令人悶)的進(jìn)一步驗(yàn)證。

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UPLC/Q-TOF MS-based metabolomics in analyzing the key factors affecting the quality of commercialPolygalatenuifolia

XU Xiaoshuang1,2, ZHANG Yanhua1,2, WANG Dandan1,2, ZHANG Fusheng1*, QIN Xuemei1, PENG Bing3, ZENG Zuping3

(1ModernResearchCenterforTraditionalChineseMedicine,ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China;2CollegeofChemistryandChemicalEngineering,ShanxiUniversity;3BeijingInstituteofTraditionalChineseMedicine,BeijingHospitalofTraditionalChineseMedicineAffiliatedtoCapitalMedicalUniversity；*Correspondingauthor，E-mail：ample1007@sxmu.edu.cn)

ObjectiveTo explore the effect of regions, growth patterns, and medical parts on the quality of commercialPolygalatenuifoliaand analyze the key influential factors.MethodsThe samples of commercialP.tenuifoliawere analyzed by the ultra-performance liquid chromatography(UPLC)-quadrupole time-of-flight mass spectrometry(Q-TOF MS), and the obtained data were analyzed using principal component analysis, cluster analysis, and other statistical analysis methods.ResultsThe results showed that the key factor affecting the quality of commercialP.tenuifoliawas the region, and the contents of 3,6’-disinapoyl sucrose and polygalaxanthone Ⅲ reflected indirectly the whole quality ofP.tenuifolia. The quality of wildP.tenuifoliain Shilou, Jingle, and Yu county and cultivatedP.tenuifoliain Xiangfen, Wenxi in Shanxi province was better than that from other regions. The relative content of main compounds in roots was higher than in cortices ofP.tenuifolia, and the main chemical difference between the roots and cortices were Sibiricoses A6, 3,6’-disinapoyl sucrose, tenuifoliose C and polygalaxanthone Ⅲ. Moreover, the choice between the roots and the cortices was in accordance with the characteristics of the clinical diseases.ConclusionThe key factor affecting the quality of commercialP.tenuifoliais the region and this study provides some scientific evidences for the directions of standardized cultivation, habitat processing, and accurate clinical medication ofP.tenuifoliain the future.

Polygalatenuifolia;metabolomics;UPLC/Q-TOF MS;commercial medicinal herbs;quality

國(guó)家科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目(2011BAI07B05)；山西省科學(xué)技術(shù)發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目(20140313010-1)；山西省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金資助項(xiàng)目(2013131015)

許曉雙，女，1988-10生，在讀碩士，E-mail：xxs1005@126.com

2015-12-29

R284

A

1007-6611(2016)03-0255-09

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.03.014