高鐵含量豬血紅蛋白的提取純化及特性研究

張 敏，閆曉明，王 敏，馬潔晨，林治淮，劉 俊，高佳運，趙賀志，張 潔，*（.合肥學(xué)院生物與環(huán)境工程系，安徽合肥3060；.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，安徽合肥3003）

高鐵含量豬血紅蛋白的提取純化及特性研究

張 敏1，閆曉明2，王 敏1，馬潔晨1，林治淮1，劉 俊1，高佳運1，趙賀志1，張 潔1，*
（1.合肥學(xué)院生物與環(huán)境工程系，安徽合肥230601；2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，安徽合肥230031）

取新鮮豬血紅細(xì)胞裂解原液依次用10%、20%、30%、40%、50%、60%飽和度的硫酸銨沉淀，并分步收集沉淀，獲得粗豬血紅蛋白。結(jié)果表明，血紅蛋白主要集中于50%和60%飽和度的硫酸銨沉淀中，雜蛋白主要集中在10%～40%飽和度的硫酸銨沉淀。50%和60%飽和度的硫酸銨沉淀后獲得的粗豬血紅蛋白用DEAE-Sephrose FF陰離子交換色譜進(jìn)一步分離，均獲得了單一蛋白峰，對出峰處各管樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，均為分子量為16.4 ku的單一條帶，為豬血紅蛋白的單亞基分子量，經(jīng)PDQuest軟件分析純度為95.2%，比市售的豬血紅蛋白純度（約為85%）高。采用Bradford法測定各步分離組分的蛋白濃度，結(jié)果表明，血紅蛋白得率占總蛋白的49.69%；純化豬血紅蛋白的溶解度為32.96%；純化后豬血紅蛋白的含鐵量為0.335%，與血紅蛋白中理論鐵含量0.35%接近。

豬血紅蛋白，提取純化，特性研究

紅細(xì)胞中含有的血紅蛋白具有攜氧作用，其中起作用的主要是血紅素。血紅素和血紅蛋白有氧化型、還原型及氧合型3種天然誘導(dǎo)體構(gòu)型。血紅素和血紅蛋白除顏色、構(gòu)型相同之外，光譜學(xué)特性也極為

相似［1-2］。

據(jù)資料顯示，豬血占豬活體總重的5%，豬屠宰后，血液總量的60%～70%能夠被收集到，以宰殺一頭生豬可收集3.0 kg的血液來計算，則每年可以獲得非?？捎^的畜禽類動物血液量，用以開發(fā)和利用［3］。

豬血紅蛋白的濃度及純度和人類紅細(xì)胞中血紅蛋白的生物特性接近，是非常理想的血液代用品原料［4］。楊成［5］、樊晶［6］、李濤［7］和路秀玲等［8］研究并優(yōu)化了提取純化豬血紅蛋白的工藝，但各種提取工藝對豬血紅細(xì)胞的生物活性都有不同程度的破壞，鐵損失嚴(yán)重。另外，血紅蛋白類的血液替代品的副作用多，甚至有安全隱患，例如人使用了血液替代品可能會有血栓的形成，也可能會誘導(dǎo)產(chǎn)生一些細(xì)胞因子，引發(fā)腎毒性等疾病的發(fā)生［9］。究其原因，上述疾病可能與血紅蛋白以外的雜蛋白和血紅蛋白溶液中所含細(xì)胞膜碎片等有密切關(guān)系。因此，獲得高鐵含量高純度的豬血紅蛋白具有重要意義。本實驗采用分步硫酸銨沉淀結(jié)合Sepharose FF陰離子交換法純化豬血紅蛋白，獲得了電泳純級高鐵含量的豬血紅蛋白，為進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮豬血 購自合肥經(jīng)開食品有限公司；檬酸三鈉、硫酸銨、氯化鈉、SDS、過硫酸胺、甘氨酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、考馬斯亮藍(lán)R-250、磷酸、氫氧化鈉、鹽酸 均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250、甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、Tris 均為分析純，購自生工生物（上海）有限公司。

LGJ-10型冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；Centrifuge 5810型高速離心機(jī) Biochrom Libra S22上海安亭儀器有限公司；BS-160A型自動部分收集器 上海滬西分析儀器廠；Z型系列層析柱 上海錦華實驗器械廠；DYY-6C型電泳儀 北京市六一儀器廠；6300火焰原子吸收儀 日本島津。

1.2 實驗方法

1.2.1 豬血紅蛋白的提取 取新鮮豬血250 mL，加入抗凝劑（3%檸檬酸三鈉）25 mL，3500 r/min離心10 min，收集沉淀，棄去上清液，0.9%生理鹽水洗滌收集的豬血紅細(xì)胞3次，每次3500 r/min離心10 min［10］。在洗滌后收集到的豬血紅細(xì)胞中，加入2倍體積的蒸餾水，磁力攪拌20 min。再將破碎后的溶液10000 r/min離心20 min。收集上清液，棄去沉淀，此時收集的上清液稱原液［11］。

1.2.2 血紅蛋白的分離［12］取原液10 mL用10%飽和硫酸銨沉淀，8000 r/min離心20 min，收集沉淀和上清，將上清用20%飽和硫酸銨進(jìn)行沉淀，8000 r/min離心20 min，收集沉淀和上清，將上清再順次30%，40%，50%，60%飽和度的硫酸銨沉淀離心取上清液。各步獲得的沉淀，分別溶于40、20、20、20、40、40 mL PBS，獲得A液、B液、C液、D液、E液、F液，60%飽和硫酸銨沉淀后上清為G液。用Bradford法測A液、B液、C液、D液、E液、F液和G液的蛋白質(zhì)含量［13］。

1.2.3 豬血紅蛋白的進(jìn)一步純化 分別取15 mL E液、30 mL F液，用50 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）透析24 h后，透析液用DEAE-Sephrose FF柱純化，依次用0.0625、0.125、0.25和0.5 mol/L的NaCl梯度洗脫［14］，自動收集器收集洗脫液，每管4 mL。并測定蛋白質(zhì)含量。

1.2.4 蛋白質(zhì)含量測定 采用Bradford法［13］對A液、B液、C液、D液、E液、F液、G液的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定，標(biāo)準(zhǔn)蛋白牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式為y=0.0128x+0.0752，R2=0.9916。Sepharose FF柱材料純化后的血紅蛋白溶液的蛋白質(zhì)濃度測定也采用同樣的方法進(jìn)行測定，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式為y=0.0133x+0.0491，R2=0.997。

1.2.5 純化血紅蛋白純度檢測 采用SDS-PAGE凝膠電泳法檢測純化各步豬血紅蛋白的純度，分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為3%，先調(diào)整電壓為80 V，待分離樣品進(jìn)入分離膠時，將電壓調(diào)至100 V，直至溴酚藍(lán)前沿至距離膠底部約1 cm時，停止電泳。

1.2.6 豬血紅蛋白的溶解度測定 準(zhǔn)確量取1 mL蒸餾水加入稱量好的EP管中，加入稱量好的過量的豬血紅蛋白，8000 r/min離心15 min，分別收集沉淀和上清。稱取沉淀濕重，將沉淀冷凍干燥后，稱取干燥后的血紅蛋白重量。溶解度=（a-b）/［1-（c-d）+（ab）］；a：加入的豬血紅蛋白總量；b：結(jié)晶析出的豬血紅蛋白量；c：析出血紅蛋白的濕重；d：析出血紅蛋白的干重。

1.2.7 純化豬血紅蛋白的含鐵量檢測 用火焰原子吸收法測定純化后豬血紅蛋白的鐵含量，鐵標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=9.7893x+0.073，R2=0.9988。

1.2.8 蛋白質(zhì)純度的計算 用PDQuest軟件分析各純化步驟獲得的蛋白質(zhì)樣品中豬血紅蛋白的純度。

1.2.9 特征光譜分析 將純化血紅蛋白樣品進(jìn)行200～900 nm紫外-可見光全波長掃描，確定其峰形和特征吸收的波長。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)純化結(jié)果

2.1.1 不同飽和度硫酸銨沉淀紅細(xì)胞裂解液結(jié)果

不同飽和度硫酸銨沉淀中的蛋白濃度測定結(jié)果表明血紅蛋白主要集中于50%和60%飽和度的硫酸銨沉淀中，雜蛋白主要集中在10%～40%飽和度的硫酸銨沉淀中。

2.1.2 豬血紅蛋白純度檢測 采用12%SDS-PAGE膠對不同飽和度的硫酸銨沉淀產(chǎn)物進(jìn)行電泳，其中A液、B液、C液、D液都有不同程度的雜帶出現(xiàn)，E液、F液沒有雜帶出現(xiàn)，表明蛋白較純，如圖1所示。結(jié)果表明E液、F液含有較純的血紅蛋白亞基條帶，分子量約為16.4 ku；根據(jù)血紅蛋白由四條分子量基本相同的亞基組成，推測純化的血紅蛋白分子量約為65.6 ku，與文獻(xiàn)報道的64 ku接近［15］。

圖1 不同飽和度硫酸銨沉淀紅細(xì)胞裂解液后各組分蛋白電泳圖Fig.1 Diagram of electrophoresis of different protein precipitated by different saturate amonium sulfate from porcine red blood lysis

圖2 Sepharose FF純化E（A）、F（B）液洗脫液各管OD280值Fig.2 OD280purified by Sepharose FF from different tubes of E（A）and F（B）solution

2.1.3 Sepharose FF純化豬血紅蛋白 分別取E、F透析液15、30 mL上Sepharose FF柱，平衡50 min，以50 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）加入不同濃度（0～0.5 mol/L）氯化鈉梯度洗脫，分別洗脫300 min。E液洗脫液1～14管為無色，15～20管為紅色，由淡粉色到紅色，顏色依次加深，21～22管則是由紅到淡粉色，23～35管為無色，用紫外分光光度計檢測各管的OD280值，結(jié)果如圖2A所示，15～22號收集管中為主峰。將15～22管進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖3B所示，15～18管和21～22管為單一條帶，合并。只有19和20管的上方有一條很淺的帶，分子量為33 ku左右，參考電泳圖中E液的泳道，為單一條帶，判斷19和20管很淺的條帶可能為豬血紅蛋白多肽中沒有完全分開二聚體亞基。

F管洗脫液1～19管為無色，20～27管由淡粉色到深紅色依次加深，28～31管的紅色則是由紅到淡粉色，31～50管為無色，用紫外分光光度計檢測各管的OD280值，結(jié)果如圖2B所示，20～31號收集管中為主峰。將20～31管進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖3A所示，豬血紅蛋白的單亞基相對分子量約為16.4 ku，則豬血紅蛋白的相對分子量約為65.6 ku。

圖3 Sepharose FF純化E、F液電泳效果圖Fig.3 Diagram of electrophoresis purified by Sepharose FF of E（A）and F（B）solution

電泳結(jié)果表明，E液和F液經(jīng)DEAE-Sepharose FF純化后，獲得的主峰為電泳純的豬血紅蛋白，經(jīng)PDQuest軟件分析，其純度達(dá)到95.2%，高于市售的血紅蛋白的純度85%。

2.1.4 純化豬血紅蛋白得率計算 E液、F液經(jīng)Sepharose FF柱層析進(jìn)一步分離后，得到電泳純的豬血紅蛋白，其占細(xì)胞漿總蛋白含量=純豬血紅蛋白量/細(xì)胞裂解原液蛋白量，計算結(jié)果為49.69%。根據(jù)血紅蛋白約占紅細(xì)胞蛋白總量的75%，純豬血紅蛋白占紅細(xì)胞總蛋白量=49.69×75%=37.27%。

2.1.5 自制血紅蛋白與市售血紅蛋白純度比較 將市售血紅蛋白、D液、F液，以及Sepharose FF純化后的血紅蛋白進(jìn)行電泳比較如圖4所示，結(jié)果表明市售血紅蛋白的泳道有雜蛋白泳道，過柱后血紅蛋白的泳道為單一清晰的條帶，純度高于市售的血紅蛋白。所以一般用40%飽和度的硫酸銨沉淀除去雜蛋白的同時，但也除去了部分的豬血紅蛋白。

圖4 不同分離純化階段的豬血紅蛋白約市售豬血紅蛋白的比較Fig.4 Comparison of different phases Hemoglobin with saled swine globulin

2.2 純化豬血紅蛋白的鐵含量測定

用火焰法原子吸收法測定純化后豬血紅蛋白的鐵含量為0.335%，接近于理論含鐵量值0.35%，可以進(jìn)一步開發(fā)為血液代替品或補(bǔ)鐵用品。

2.3 純化豬血紅蛋白的溶解度

采用檢測紅細(xì)胞裂解原液中的蛋白含量和Sepharose FF柱材料層析分離純化獲得的豬血紅蛋白的含量，純化后的血紅蛋白溶解度為32.96%（g/100 g），即每100 g豬血紅蛋白溶液中能溶解豬血紅蛋白32.96 g，表明豬血紅蛋白的溶解性好。

2.4 血紅蛋白的特征光譜分析

將原液和經(jīng)過硫酸銨、Sepharose FF純化后的血

紅蛋白樣品進(jìn)行200～900 nm紫外-可見光全波長掃描，確定其峰形和特征吸收的波長，結(jié)果如圖5所示。光譜掃描結(jié)果表明原液和經(jīng)過硫酸銨、Sepharose FF純化后的血紅蛋白樣品的吸收峰沒有顯著差異，均有五個峰出現(xiàn)，分別出現(xiàn)在276、346、416、542和577 nm。結(jié)果表明，豬紅細(xì)胞裂解液與純化后的豬血紅蛋白的紫外可見吸收光譜基本相同，與標(biāo)準(zhǔn)豬血紅蛋白吸收光譜液相同?？赡苡捎谘t蛋白濃度超過70%時，紫外可見吸收光的吸收主要以豬血紅蛋白為主，表現(xiàn)出相似的峰型，與文獻(xiàn)報道一致［16］。

圖5 原液（A）、純化后的血紅蛋白樣品（B）和標(biāo)準(zhǔn)血紅蛋白（C）全波長光譜掃描圖Fig.5 Comparation of full length between swine red blood lysis solution（A），purified swine hemoglobulin（B）and standard swine hemoglobulin（C）

3 結(jié)論

采用不同濃度的硫酸銨分步沉淀豬紅細(xì)胞裂解液，血紅蛋白主要集中于50%和60%飽和度的硫酸銨沉淀中，雜蛋白主要集中在10%～40%飽和度的硫酸銨沉淀中。經(jīng)50%、60%飽和度硫酸銨沉淀后的樣品透析后，用Sepharose FF進(jìn)一步純化，獲得電泳純的血紅蛋白。純化后的豬血紅蛋白純度為95.2%，高于市售血紅蛋白的純度85%；純化血豬紅蛋白分子量65.6 ku，與報道的豬血紅蛋白分子量近似；純化豬血紅蛋白的得率占細(xì)胞漿總蛋白的49.69%，占紅細(xì)胞總蛋白量的37.27%；在蒸餾水中的溶解度為32.96%；純化豬血紅蛋白含鐵量為0.335%，與理論含鐵量0.35%接近；純化豬血紅蛋白的紫外可見吸收光譜特征與文獻(xiàn)［16］報道的豬血紅蛋白的吸收光譜相同。

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Purification of iron-rich swine hemoglobin and its characteristics

ZHANG Min1，YAN Xiao-ming2，WANG Min1，MA Jie-chen1，LIN Zhi-huai1，LIU Jun1，GAO Jia-yun1，ZHAO He-zhi1，ZHANG Jie1，*
（1.Department of Biological and Environmental Engineering，Hefei University，Hefei 230601，China；2.Anhui Academy Agricultural Sciences，Hefei 230031，China）

Swine hemoglobin was extracted from fresh lysed swine red blood cell.The lysed solution was precipitated by 10%，20%，30%，40%，50%，and 60%saturated ammonium sulfate，and precipitaton from each step was collected and the cruel swine hemoglobin was obtained.The results showed the impure protein was mainly distributed in 10%～40%saturated ammonium sulfate pelleted precipitations，while the swine hemoglobin was mainly distributed in the precipitation obtained from 50%and 60%saturated ammonium sulfate precipitated production and was separated by the DEAE-Sepharose FF anion material and SDS-PAGE was used to identify their purification.The results of DEAE-Sepharose FF showed that both of the separated dilution got single protein peak.The SDS-PAGE results showed that the hemoglobin was mainly concentrated by 50%and 60%saturated ammonium sulfate.The molecular weight of the purified hemoglobin was 16.4 ku which was in accordance with with that of the monomer of hemoglobin.The purity of the purified hemoglobin was 95.2%canalyzed by PDQuest，which was higer than that of the purchased porcine hemoglobin whose purity was 85%.The protein concentration from each step was determined by Bradford method.The result showed that obtained rate of hemoglobin was accounted for 49.69%in the total protein fractions.The solubility of purified porcine hemoglobin was 32.96%.The iron content in purifiend hemoglobin was 0.335%whicn was closed to the theory content of natural hemoglobin.

porcine hemoglobin；extract and purification；characteristic reasearch

TS251.93

B

1002-0306（2016）08-0268-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.047

2015－07－17

張敏（1967-），女，博士，副教授，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)，E-mail：zhangmo@hfuu.edu.cn。

*通訊作者：張潔（1960-），女，碩士，教授，研究方向：發(fā)酵工程和酶工程，E-mail：bst@hfuu.edu.cn。

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD14B13）；合肥學(xué)院2014年生物工程重點學(xué)科；國家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目（201311059096）；安徽省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目（AH201411059007，201511059334）。