黃腐酸對(duì)雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis LUGU）蝦青素積累的影響

尚敏敏，趙永騰，李 濤，趙 鵬，徐軍偉，余旭亞（昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明650500）

黃腐酸對(duì)雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis LUGU）蝦青素積累的影響

尚敏敏，趙永騰，李 濤，趙 鵬，徐軍偉，余旭亞*
（昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明650500）

通過(guò)形態(tài)學(xué)以及18S rRNA的分析，篩選鑒定出了一株新的雨生紅球藻Haematococcus pluvialis LUGU，并以其作為研究對(duì)象，研究了不同質(zhì)量濃度的黃腐酸（FA）對(duì)脅迫培養(yǎng)條件下細(xì)胞生長(zhǎng)和蝦青素產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，5 mg/L和10 mg/L的FA不僅促進(jìn)了藻細(xì)胞的生長(zhǎng)（生物量濃度分別比對(duì)照組增加了4.26%和10.58%），而且能夠顯著提高蝦青素的含量（最大含量分別達(dá)到20.82和12.23 mg/L）。其中，5 mg/L的FA誘導(dǎo)效果最為明顯，蝦青素產(chǎn)量（37.46 mg/g）比對(duì)照組（20.90 mg/g）提高79.23%。實(shí)驗(yàn)表明，黃腐酸在適當(dāng)濃度下能夠顯著促進(jìn)藻細(xì)胞內(nèi)蝦青素的積累，可作為一種有效的誘導(dǎo)子應(yīng)用于蝦青素的生產(chǎn)。

雨生紅球藻，蝦青素，黃腐酸（FA）

蝦青素（3，3′-二羥基-4，4′-二酮基-β，β′-胡蘿卜素）是類胡蘿卜素的最高級(jí)衍生物，有較強(qiáng)的抗氧化性，對(duì)炎癥［1］、心血管［2］以及腫瘤等疾?。?］的發(fā)生具有抑制作用，在飼料、保健品、化妝品和藥品生產(chǎn)上也極具應(yīng)用潛力的次生代謝物質(zhì)［4］。蝦青素從來(lái)源上主要分為化學(xué)合成的蝦青素和天然蝦青素?；瘜W(xué)合成的蝦青素成本高、方法繁瑣且穩(wěn)定性和抗氧化性遠(yuǎn)不如天然蝦青素［5］，因此天然蝦青素廣受青睞。天然蝦青素的主要來(lái)源為水產(chǎn)品的下腳料、真菌以及微藻，但水產(chǎn)品下腳料（甲殼類動(dòng)物殼等）和某些真菌（如紅發(fā)夫酵母）提取成本高，蝦青素的純度和產(chǎn)量也較低［6-8］。藻類中小球藻、衣藻［9］等因生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、含量低等不宜進(jìn)行規(guī)?；囵B(yǎng)生產(chǎn)蝦青素。相比之下，雨生紅球藻內(nèi)蝦青素的含量可達(dá)到藻細(xì)胞干重4%以上［10］，被稱為天然蝦青素的“濃縮品”［11］。此外，由于目前蝦青素價(jià)格較貴（約3000美元/kg），而估計(jì)全球市場(chǎng)每年蝦青素需求量?jī)r(jià)格超過(guò)20億美元［12］。因此，通過(guò)選育優(yōu)良藻種、改進(jìn)培養(yǎng)條件以及利用誘導(dǎo)子對(duì)雨生紅球藻進(jìn)行脅迫培養(yǎng)等方式，以更低的成本得到較高的蝦青素產(chǎn)量已經(jīng)成為一種可行有效的策略。

黃腐酸（Fulvic Acid，F(xiàn)A）作為一種植物調(diào)節(jié)劑對(duì)植物的生長(zhǎng)具有調(diào)節(jié)作用。周麗娜等［13］做了FA作為抗旱營(yíng)養(yǎng)劑對(duì)小麥和玉米影響的研究，研究表明添加FA后小麥的發(fā)芽率增加，對(duì)干旱組澆灌稀釋后的FA也可明顯提高玉米的株高。還有研究表明，F(xiàn)A

不僅促進(jìn)了馬鈴薯的生長(zhǎng)發(fā)育還提高了其淀粉的產(chǎn)量［14］。由此推測(cè)，F(xiàn)A對(duì)雨生紅球藻中蝦青素的積累可能具有一定的影響。目前關(guān)于外源FA對(duì)雨生紅球藻中蝦青素積累的影響還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本文根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和18S rRNA分子進(jìn)化樹(shù)，從采自云南淡水湖泊瀘沽湖的水樣中分離鑒定出一株新的雨生紅球藻藻株（Haematococcus pluvialis LUGU），以其作為研究對(duì)象，探究了FA對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)及蝦青素的產(chǎn)量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

PCR引物 生工生物工程股份有限公司；2×Taq PCR Master mix、ddH2O、膠回收試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；1 kb marker、溶液I、T-Vector pMD-19、2000 bp marker 寶生物工程（大連）有限公司；核酸染料 BioTeke；二甲亞砜（DMSO，≥99.5%）、KOH（≥99.5%）、甲醇（分析純） 北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司。

XS-212-202顯微鏡 JNOEC；DMI6000B倒置熒光顯微鏡 Leica；VS-840-1超凈工作臺(tái) 上海博訊；FD5-12冷凍干燥機(jī) SIM International Group；Ultrospec 2100pro紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) Amersham Biosciences；LDZX-50KBS滅菌鍋 上海申安；FA2004N分析天平 上海箐海；HHW-D6水浴鍋 金壇雙捷；5804R離心機(jī) Eppendorf；BC/BD-516DTF （-20℃）冰箱 合肥美菱；ABI-2720 PCR儀 Life Technologies；1730R高速冷凍離心機(jī) Labogene Scanspeed；EPS-300電泳儀、3500凝膠成像儀 上海天能；DS-8510DTH超聲波微波組合體系 上海生析；BCD-205F（4℃）冰箱 伊萊克斯。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雨生紅球藻Haematococcus pluvialis LUGU的分離、培養(yǎng)和鑒定 水樣采自云南省九大高原淡水湖之一的瀘沽湖（27°42′00″N 100°47′00″E），過(guò)濾（0.22 μm過(guò)濾器）、富集培養(yǎng)（BG11液體培養(yǎng)基，溫度25±1℃，濕度70%，光照強(qiáng)度1500 lx條件下培養(yǎng)）、梯度稀釋后，重復(fù)涂布（BG11固體培養(yǎng)基，條件同富集培養(yǎng)條件）、挑單菌落、光照下富集培養(yǎng)（BG11液體培養(yǎng)基，條件同上）以及利用光學(xué)顯微鏡鏡檢細(xì)胞形態(tài)，直至出現(xiàn)形態(tài)單一的藻細(xì)胞。將分離鑒定出的藻細(xì)胞接種到3 L（內(nèi)置2 L BG-11液體培養(yǎng)基）的玻璃三角瓶中，于溫度（25±1）℃，光照強(qiáng)度2400 lx，泵入0.1 vvm的含1.5%二氧化碳的無(wú)菌空氣條件下，高密度培養(yǎng)10 d左右至藻細(xì)胞對(duì)數(shù)期。

將藻液于4000 r/min下離心5 min富集，CTAB法［15］提取藻細(xì)胞DNA，利用引物（正向：5’-TCCTGCCAGT AGTCATATGC-3’，反向：5’-TGATCCTCCGCAGGTT CAC-3’）［16］擴(kuò)增18S rRNA，將18S rRNA序列比對(duì)分析，利用Neighbor-joining的方法構(gòu)建相應(yīng)的進(jìn)化樹(shù)結(jié)合藻細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析鑒定藻種。

1.2.2 黃腐酸處理 將高密度培養(yǎng)約10 d至對(duì)數(shù)期的種子液接種到BG-11缺氮培養(yǎng)基中（接種量約為2×105CFU/mL，培養(yǎng)基總體積為400 mL）。用超純水配制10 g/L的FA母液，將不同體積的FA母液添加到缺氮的BG11培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)，使誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加FA質(zhì)量濃度分別為0、5、10、20 mg/L，每組設(shè)3個(gè)平行樣。持續(xù)鼓入0.4 vvm的含1.5%二氧化碳的無(wú)菌空氣，24 h、8000 lx光照，置于（27±1）℃室內(nèi)脅迫培養(yǎng)7 d，以誘導(dǎo)藻細(xì)胞積累蝦青素。

1.2.3 藻細(xì)胞生物量濃度測(cè)定 每隔1 d取50 mL藻液5000 r/min離心10 min、-20℃冷凍、干燥、稱重，具體計(jì)算如下：DBW（g/L）=WA/V，其中DBW：藻細(xì)胞生物量濃度；WA：藻粉干重（g）；V：藻液體積（L）。培養(yǎng)7 d后按下式計(jì)算生物量產(chǎn)率：生物量產(chǎn)率（mg/L·d）=DBW（g/L）×1000/7（d），其中DBW為7 d培養(yǎng)后的生物量濃度。

1.2.4 蝦青素含量測(cè)定 采用Boussiba等［17］的方法加以改進(jìn)測(cè)定藻細(xì)胞中蝦青素含量。每隔1 d取出5 mL藻液，5000 r/min離心5 min，棄上清液。在收集的藻細(xì)胞沉淀中加入5%KOH和30%甲醇混合液置于65℃水浴鍋內(nèi)5 min以破壞葉綠素，5000 r/min離心收集沉淀，加入3 mL二甲亞砜（DMSO），利用超聲波破壁（20 s/5 s，輸出功率40 W），反復(fù)抽提直至藻體發(fā)白，然后在高速離心機(jī)10000 r/min中離心10 min，取上清液于490 nm下測(cè)定OD值。按公式ρ（mg/L）= （4.5×A490×Va）/Vb計(jì)算蝦青素含量，其中ρ：蝦青素含量，A490：490 nm測(cè)得的OD值，Va：DMSO的體積，Vb：藻液體積；進(jìn)一步得出總蝦青素產(chǎn)量：P（mg/g）=ρ（mg/L）/ DBW（g/L）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文全部實(shí)驗(yàn)均設(shè)置三組平行，利用ANOVA （SPSS 19.0）一步法分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。最小顯著性差異進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)調(diào)查不同實(shí)驗(yàn)的組間差異，且當(dāng)p＜0.05具有顯著性意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同階段下雨生紅球藻的形態(tài)學(xué)鑒定

圖1 不同階段下雨生紅球藻的細(xì)胞形態(tài)圖Fig.1 Microscopic images of H.pluvialis cells at different life cycle stages

如圖1a所示，藻細(xì)胞長(zhǎng)約45 μm，寬約35 μm，呈

球形或橢球形，橢球形藻細(xì)胞底端帶有兩根鞭毛可以游動(dòng)，且細(xì)胞呈亮綠色；圖1b所示的藻細(xì)胞已退去鞭毛，且形成很多黑色脂質(zhì)體；圖1c所示藻細(xì)胞逐漸變大變圓，根據(jù)標(biāo)尺長(zhǎng)度及測(cè)量后得出此時(shí)藻細(xì)胞長(zhǎng)、寬約為60、50 μm，且此時(shí)有少量的紅色素在細(xì)胞中央積累；圖1d顯示此時(shí)的藻細(xì)胞體積繼續(xù)變大并積累大量的紅色素，且占滿整個(gè)細(xì)胞質(zhì)。由此可以說(shuō)明該藻具有雨生紅球藻的一般特性，所以可初步鑒定為雨生紅球藻屬。

2.2 雨生紅球藻18S rRNA進(jìn)化分析

圖2 根據(jù)18S rRNA基因序列利用NJ法構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Neighboring-joining tree estimated from 18S rRNA sequence data

將藻DNA的PCR產(chǎn)物測(cè)序比對(duì)后，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖2。由進(jìn)化樹(shù)可以看出，LUGU在其圖進(jìn)化上與 Haematococcus lacustris（湖 泊紅 球 藻）和Haematococcus pluvialis（雨生紅球藻）極為相似（相似度都為99%）。但結(jié)合其細(xì)胞多為廣卵形到廣橢圓形，開(kāi)始是帶鞭毛的游動(dòng)細(xì)胞，生長(zhǎng)旺盛且呈綠色；然后隨著營(yíng)養(yǎng)因子的減少或不利條件下（高光照、高溫、高鹽等），藻細(xì)胞逐漸變大，鞭毛逐漸褪去，最后形成圓形的厚壁孢子并為紅色等形態(tài)學(xué)特征［18］，確定LUGU屬于雨生紅球藻屬Haematococcus pluvialis，命名為Haematococcus pluvialis LUGU。

2.3 黃腐酸對(duì)誘導(dǎo)階段H.pluvialis LUGU生長(zhǎng)的影響

不同質(zhì)量濃度的FA對(duì)H.pluvialis LUGU誘導(dǎo)階段藻細(xì)胞生物量濃度的影響具有顯著性差異（p＜0.05）（圖3）?？傮w來(lái)看，當(dāng)添加的FA濃度為10 mg/L且生長(zhǎng)到第5 d，生物量濃度達(dá)到最大值0.562 g/L，比對(duì)照組增加10.58%。當(dāng)誘導(dǎo)到第3 d時(shí)，4種條件對(duì)藻生物量濃度的影響不同，此時(shí)對(duì)照組生物量濃度最大。而后誘導(dǎo)至第5 d和第7 d時(shí)，添加5和10 mg/L FA的實(shí)驗(yàn)組的生物量濃度分別增加且都高于對(duì)照組。其中第5 d時(shí)，添加10 mg/L FA的生物量濃度比5 mg/L FA高3.2%；之后第7 d時(shí)，5 mg/L FA的生物量濃度繼續(xù)增大，且高于此時(shí)已有下降趨勢(shì)的10 mg/L FA處理組的生物量濃度，并達(dá)到此實(shí)驗(yàn)組的最大生物量濃度0.556 g/L，比對(duì)照組提高4.26%。在添加FA的條件下，藻細(xì)胞生物量濃度提高可能是由于FA是一種含有微量元素和氨基酸等營(yíng)養(yǎng)元素［19］的植物生長(zhǎng)因子，除了自身含有的大量官能團(tuán)，生理活性比一般的植物生長(zhǎng)激素強(qiáng)外，還具有絡(luò)合金屬離子的作用［20］，因此對(duì)藻的生長(zhǎng)起到調(diào)節(jié)作用。但當(dāng)FA質(zhì)量濃度增大到20 mg/L，藻細(xì)胞的生長(zhǎng)遠(yuǎn)不如對(duì)照組藻的生長(zhǎng)，可見(jiàn)在誘導(dǎo)藻細(xì)胞階段，低質(zhì)量濃度的FA能促進(jìn)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)，高質(zhì)量濃度的FA可能超過(guò)藻對(duì)其的耐受能力，從而會(huì)抑制藻細(xì)胞的生長(zhǎng)。

圖3 不同質(zhì)量濃度黃腐酸雨生紅球藻生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of FA on biomass of H.pluvialis LUGU during induction days

2.4 黃腐酸對(duì)蝦青素產(chǎn)量的影響

如圖4所示，在不同質(zhì)量濃度的FA的誘導(dǎo)下，蝦青素產(chǎn)量均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。在誘導(dǎo)第3 d，3種質(zhì)量濃度下的藻細(xì)胞蝦青素產(chǎn)量?jī)H微高于對(duì)照，但10 mg/L FA處理組，蝦青素產(chǎn)量相對(duì)較高；第5 d時(shí)，5 mg/L FA質(zhì)量濃度下蝦青素產(chǎn)量顯著（p＜0.05）提高，而10和20 mg/L FA質(zhì)量濃度下的蝦青素產(chǎn)量低于對(duì)照組；第7 d時(shí)，5 mg/L FA質(zhì)量濃度下，蝦青素產(chǎn)量明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組且達(dá)到最大值37.46 mg/g，比此時(shí)對(duì)照組蝦青素的產(chǎn)量提高79.23%。而添加10 mg/L FA處理組的蝦青素產(chǎn)量稍高于對(duì)照組產(chǎn)量，20 mg/LFA濃度下蝦青素產(chǎn)量顯著低于其他組。結(jié)果證明在FA脅迫誘導(dǎo)條件下，F(xiàn)A作為誘導(dǎo)子能夠有效的促進(jìn)蝦青素的積累，而過(guò)高濃度的FA下，藻細(xì)胞死亡，總蝦青素累積較少，這種高濃度抑制的結(jié)果與前人的研究結(jié)論一致［21］。

圖4 不同質(zhì)量濃度黃腐酸對(duì)雨生紅球藻蝦青素積累的影響Fig.4 Effect of FA on astaxanthin content of H.pluvialis LUGU during induction days

根據(jù)表1綜合分析不同質(zhì)量濃度的FA分別對(duì)

H.pluvialis LUGU誘導(dǎo)階段生物量產(chǎn)率、蝦青素含量及總蝦青素產(chǎn)量的影響，在添加5及10 mg/L FA時(shí)，藻細(xì)胞的生物量產(chǎn)率幾乎相同，且都高于對(duì)照組生物量產(chǎn)率。FA的質(zhì)量濃度為10 mg/L時(shí)，生物量產(chǎn)率達(dá)到最大80.28 mg/L·d，比對(duì)照組增加5.44%；但是FA的添加量達(dá)到20 mg/L，生物量產(chǎn)率降低到67.96 mg/L·d。當(dāng)添加5 mg/L的FA時(shí)，蝦青素的含量為20.82 mg/L，比對(duì)照組提高了86.89%，總蝦青素的產(chǎn)量提高79.23%；而隨著FA質(zhì)量濃度的增加到10和20 mg/L時(shí)，總蝦青素的產(chǎn)量?jī)H為對(duì)照組的1.04和0.71倍，蝦青素含量降低到12.234和7.03 mg/L。

表1 不同質(zhì)量濃度的黃腐酸對(duì)藻細(xì)胞的生物量產(chǎn)率、蝦青素含量及總蝦青素產(chǎn)量的影響Table1 Effect of FA on the biomass productivity，astaxanthin production and astaxanthin content of Haematococcus pluvialis strain LUGU during induction days

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，5 mg/L FA處理對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素有最顯著的促進(jìn)作用，且蝦青素含量比對(duì)照組提高了86.89%，增產(chǎn)效果非常明顯。由此可見(jiàn)，F(xiàn)A作為誘導(dǎo)因子促進(jìn)藻細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物的積累，但當(dāng)FA增加至10和20 mg/L時(shí)，蝦青素的產(chǎn)量逐漸降低，表明FA也具有植物激素所普遍存在的雙重性，即只有適宜濃度的FA才能促進(jìn)生長(zhǎng)和代謝，過(guò)低對(duì)蝦青素的促進(jìn)作用偏低，過(guò)高則不利于生物量的積累從而導(dǎo)致對(duì)單位體積藻液內(nèi)次生代謝積累無(wú)提高作用。而FA促進(jìn)藻細(xì)胞大量積累蝦青素的機(jī)制（可能是FA影響H.pluvialis LUGU關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量，增加蝦青素代謝途徑中關(guān)鍵酶合成量，進(jìn)而促使藻細(xì)胞大量的積累蝦青素）有待于進(jìn)一步的探究。

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Effects of fulvic acid on astaxanthin accumulation of Haematococcus pluvialis LUGU

SHANG Min-min，ZHAO Yong-teng，LI Tao，ZHAO Peng，XU Jun-wei，YU Xu-ya*
（Faculty of Life Science and Technology，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China）

A novel strain identified by the morphology and 18S rRNA namely，Haematococcus pluvialis LUGU，was used to explore the effect of fulvic acid（FA）on the growth of algae and the production of astaxanthin in this study.As a result，the biomass of H.pluvialis increased by 4.26%and 10.58%than controls and the astaxanthin content reached 20.82 and 12.23 mg/L in 5 and 10 mg/L FA-treated culture，respectively.Particularly，5 mg/L FA enhanced 79.23%with 37.46 mg/g in the production of astaxanthin more than that of control group （20.90 mg/g）.The result indicated that FA was a effective factor to enhance the production of astaxanthin at appropriate concentration.

Haematococcus pluvialis LUGU；astaxanthin；fulvic acid（FA）

TS254.8

A

1002-0306（2016）08-0225-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.038

2015－08－24

尚敏敏（1990-），女，碩士研究生，研究方向：微藻資源開(kāi)發(fā)，E-mail：shangminmin@126.com。

*通訊作者：余旭亞（1969-），男，博士，教授，主要從事微藻資源開(kāi)發(fā)方面的研究，E-mail：xuya_yu@163.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（21266013）。