黑曲霉內(nèi)切菊粉酶基因在畢赤酵母中的表達及應(yīng)用研究

王寧鶴，邢雪巖，封志媚，路福平，李 玉（工業(yè)微生物教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

黑曲霉內(nèi)切菊粉酶基因在畢赤酵母中的表達及應(yīng)用研究

王寧鶴，邢雪巖，封志媚，路福平，李 玉*
（工業(yè)微生物教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

利用PCR方法從黑曲霉（Aspergillus niger）基因組DNA中擴增內(nèi)切菊粉酶（endo I）全長基因（1551 bp），經(jīng)序列分析后將其連接到表達載體pPIC9K上，得到重組表達載體pPIC9K-endo I。重組質(zhì)粒經(jīng)Sac I線性化并電轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115，陽性轉(zhuǎn)化子進行發(fā)酵產(chǎn)酶后考察其酶學(xué)性質(zhì)。酶學(xué)性質(zhì)研究表明，重組酶的最適pH和最適溫度分別為5和60℃，重組酶在55℃下保溫9 h后，重組菊粉內(nèi)切酶仍殘余83.2%的活性，表現(xiàn)出極高的熱穩(wěn)定性，Cu2+、Ag+對重組酶有明顯的抑制作用。對內(nèi)切菊粉酶水解菊粉的過程研究表明，重組內(nèi)切菊粉酶能在8 h內(nèi)將4%（w/v）菊粉水解為3～6個聚合度的低聚果糖，水解11 h后，低聚果糖得率達到63.5%，本研究為進一步開發(fā)以菊粉為原料生產(chǎn)低聚果糖的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

內(nèi)切菊粉酶，畢赤酵母，酶學(xué)性質(zhì)，轉(zhuǎn)化率

內(nèi)切菊粉酶（endo-inulinase）能夠特異性的水解菊粉中β-2，1-果糖苷鍵［1］，最終生成聚合度為3～10的高純度低聚果糖（GFn，F(xiàn)n），低聚果糖是一種聚合度為2～7的功能性果聚糖，具有熱值低、增殖人體內(nèi)雙歧桿菌、抑制腸道沙門氏菌和腐敗菌的生長［2］的作用，能夠促進腸胃功能，防止便秘提高人體免疫力［3-4］，還能抑制血糖、降低血脂［5］，因而在食品、保健品等行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用。菊粉是一種廉價的糖源，廣泛存在于菊科植物的根莖和塊莖中，通常被作為食用或飼用原料，其真正的價值未得到發(fā)揮。應(yīng)用內(nèi)切型菊粉酶水解菊粉生產(chǎn)低聚果糖，不僅可以提高低聚果糖的純度，還能降低成本，從而提高農(nóng)副產(chǎn)品附加值，具有廣闊的應(yīng)用前景。

近年來國內(nèi)外研究者已經(jīng)分離出很多能夠水解菊粉的微生物，其中包括酵母、霉菌、細(xì)菌等，國內(nèi)外已報道了來源于無花果曲霉（Aspergillus ficuum）［6］、節(jié)

桿菌（Arthrobacter sp.）［7］、克魯維酵母（Kluyveromyces）［8］、青霉（Penicillium）［9］、黑曲霉（Aspergillus niger）［10］等菊粉酶的基因的克隆及鑒定，但到目前為止，市售的菊粉酶仍為混合酶，即同時存在內(nèi)切型菊粉酶和外切型菊粉酶，外切型菊粉酶會從菊粉非還原性末端水解菊粉生成果糖分子，這樣就無法以菊粉為底物生產(chǎn)高純度的低聚果糖，也就無法發(fā)揮菊粉作為功能糖原料的應(yīng)有的價值。因此有必要利用基因工程的方法表達內(nèi)切型菊粉酶蛋白，以滿足以菊粉為底物生產(chǎn)低聚果糖的要求，進而才能對內(nèi)切菊粉酶水解菊粉生產(chǎn)低聚果糖的轉(zhuǎn)化過程進行深入的探討。

本研究根據(jù)Genbank所報道的內(nèi)切菊粉酶生物信息，設(shè)計引物，通過PCR技術(shù)從本實驗室保藏的一株野生型黑曲霉（TCCC 41064）中克隆得到內(nèi)切菊粉酶基因endo I，構(gòu)建到表達載體pPIC9K上，得到pPIC9K-endo I重組質(zhì)粒，并在畢赤酵母GS115中得到誘導(dǎo)表達，并進一步研究了內(nèi)切菊粉酶的酶學(xué)性質(zhì)及轉(zhuǎn)化過程，以期為內(nèi)切菊粉酶的工業(yè)化生產(chǎn)及水解菊粉生產(chǎn)低聚果糖的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

載體和質(zhì)粒 黑曲霉TCCC41064、克隆宿主菌E.coli JM109、表達宿主GS115、表達載體pPIC9K均由本實驗室保藏；克隆載體pMD19-T simple vector 購自Takara公司；LB培養(yǎng)基 蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，pH7.0；YPD固體培養(yǎng)基 蛋白胨20 g/L，酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂2%（w/v）；MD篩選培養(yǎng)基、BMMY培養(yǎng)基、BMGY培養(yǎng)基 參考文獻［11］所述方法配制；工具酶和試劑 DNA限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、LA Taq DNA聚合酶、DNA Marker均購自TaKaRa公司；蛋白胨、酵母粉、菊粉和瓊脂糖 購自上海生工；柱式DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、氨芐青霉素（Amp）、遺傳霉素（G418） 購自北京博大泰克公司。

TU-1810型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；TC-512型PCR基因擴增儀 英國Techne公司；高速低溫離心機 德國Eppendorf公司；HW SY21-K型電熱恒溫水浴鍋 江蘇國華儀器廠；水浴恒溫振蕩器 北京市長風(fēng)儀器儀表公司；DYY-6D型電泳儀 北京市六一儀器廠；HPLC分析色譜儀 安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑曲霉基因組DNA的制備 參見文獻［12］所述方法。

1.2.2 引物設(shè)計與基因克隆 參考GenBank中已報道的黑曲霉（GenBank登錄號：CAA07345和DQ233221）內(nèi)切菊粉酶基因的DNA序列，應(yīng)用primer 5引物設(shè)計軟件設(shè)計1對引物，如表1所示，引物由奧科生物工程有限公司合成。

PCR擴增條件為：95℃5 min，94℃ 45 s，58℃40 s，72℃1.5 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.2.3 表達載體pPIC9K-endo I的構(gòu)建 使用引物endo-F、endo-R和LA Taq DNA聚合酶擴增Endo I全長基因，擴增得到的序列連接到pMD19-T simple vector載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109，獲得T-endo I重組質(zhì)粒，然后將用EcoR I、Not I雙酶切的目的片段與同樣雙酶切的pPIC9K載體相連，獲得pPIC9K-endo I。重組載體構(gòu)建示意圖如圖1所示。

圖1 重組表達質(zhì)粒pPIC9K-endoⅠ的構(gòu)建Fig.1 Construction of the recombinant plasmid carrying the endo-inulinase gene

1.2.4 畢赤酵母電轉(zhuǎn)化、高拷貝重組菌株以及搖瓶發(fā)酵 參見文獻［12］所述方法。

1.2.5 內(nèi)切菊粉酶酶活力測定 將適當(dāng)稀釋的200 μL酶液與800 μL底物（4%長鏈菊粉溶解在0.05 mol/L的HAC-NaAC的緩沖液中，pH4.6）混合，50℃下反應(yīng)10 min后沸水浴滅酶。內(nèi)切菊粉酶水解菊粉釋放出來的還原性末端用DNS［13］法測定。在100℃煮沸10 min的滅活發(fā)酵液上清液作為陰性對照。內(nèi)切菊粉酶的酶活力單位定義為反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量為1個酶活力單位（U）。

1.2.6 重組酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

1.2.6.1 最適溫度測定 取適當(dāng)稀釋的酶液200 μL，加入800 μL 4%菊粉（用0.05 mol/L的HAC-NaAC緩沖液配制），在不同溫度（40、45、50、55、60、65、70、75℃下）條件下考察內(nèi)切菊粉酶的活力。

1.2.6.2 最適pH測定 利用0.05 mol/L的HAC-NaAC緩沖液（pH3.5～11）配制4%的菊粉，測定在不同的pH條件下的內(nèi)切菊粉酶活力。

1.2.6.3 熱穩(wěn)定性測定 將酶液在50、55、60、65℃下保存一定時間后然后快速冷卻，測定殘余酶活力。

1.2.6.4 酸堿穩(wěn)定性的測定 將酶液置于不同pH的緩沖液中，于室溫下放置60 min，經(jīng)0.1 mol/L pH4.6的醋酸緩沖液稀釋后，在50℃下測定剩余的酶活力。

表1 PCR反應(yīng)引物Table1 PCR primers

1.2.6.5 金屬離子對內(nèi)切菊粉酶酶活的影響 pH4.6、50℃下，在4%菊粉（0.05 mol/L的HAC-NaAC緩沖液配制）800 μL與200 μL酶液反應(yīng)體系中添加5 mmol/L的金屬離子，考察金屬離子對內(nèi)切菊粉酶的影響。

1.2.7 內(nèi)切菊粉酶水解菊粉產(chǎn)物的分析檢測

1.2.7.1 酶解產(chǎn)物的TLC定性分析 4%菊粉（0.05 mol/L 的HAC-NaAC緩沖液配制）800 μL加入200 μL酶液，pH4.6、50℃下反應(yīng)，定時取樣，將反應(yīng)后的產(chǎn)物在薄層層析板上進行定性分析，上樣2 μL，然后進行展層，每次展開時間為20 min，展開劑為正丁醇-異丙醇-水-乙酸（體積比為7∶5∶4∶2）。每次展層結(jié)束后用電吹風(fēng)吹干，展層2次。展層后，在薄層層析板上加入顯色液（水235 mL，鉬酸氨12 g，鉬酸鈰氨0.5 g，濃硫酸15 mL），于95℃烘干顯色10 min，觀察結(jié)果。

1.2.7.2 酶解產(chǎn)物的HPLC定量分析 4%菊粉（0.05 mol/L的HAC-NaAC緩沖液配制）800 μL加入200 μL酶液，pH4.6、50℃下反應(yīng)8 h，并定時取樣，而后將樣品置于1.5 mL離心12000 r/min離心10 min，上清稀釋后經(jīng)0.45 μm超濾膜后進行分析。HPLC色譜條件：安捷倫高效液相色譜儀，自動進樣器，TSK-GEL Amide-80 Series色譜柱（4.6 mm×100 mm，5.0 μm）蒸發(fā)光檢測器；流動相為60%（v/v）乙腈水溶液，流速1 mL/min；進樣量5 μL。利用低聚果糖標(biāo)準(zhǔn)樣品，繪制質(zhì)量與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品中各糖組分峰面積分別帶入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出相應(yīng)濃度，從而確定聚合度DP3～5的低聚果糖的含量。

2 結(jié)果和分析

2.1 表達載體pPIC9K-endo I的構(gòu)建及鑒定

以黑曲霉TCCC 41064菌株DNA作為基因擴增模板，按照方法1.2.2用引物P1、P2進行PCR擴增。0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，在1.5 kb附近有特異性的單一DNA條帶與目的基因片段大小一致。將PCR產(chǎn)物與pMD19-T Simple Vector連接后委托北京華大基因有限公司進行測序，經(jīng)過比對，PCR產(chǎn)物與GenBank上報道的endo-inulinase基因序列相似度為99.67%。

圖2 endoⅠ基因PCR及重組質(zhì)粒pPIC9K-endoⅠ酶切驗證電泳圖Fig.2 The electrophoresis of endoⅠgene and digesting recombinant vector with restriction enzymes

將擴增出的內(nèi)切菊粉酶基因片段插入到表達載體pPIC9K上，構(gòu)成重組質(zhì)粒pPIC9K-endo I，重組質(zhì)粒pPIC9K-endo I經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定，小片段為1500 bp左右目的基因，大片段為9000 bp左右的pPIC9K載體，驗證正確，表明目的基因已插入到pPIC9K載體上。

2.2 重組畢赤酵母的發(fā)酵

電轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)化子經(jīng)驗證后，按照1.2.4方法對該重組子進行搖瓶發(fā)酵，按照方法1.2.5對發(fā)酵上清進行了酶活檢測，發(fā)酵液上清酶活達到13.5 U。

2.3 內(nèi)切菊粉酶性質(zhì)的研究

2.3.1 重組內(nèi)切菊粉酶的純化 發(fā)酵液上清SDSPAGE結(jié)果如圖3（A）所示，由圖可知，在66 ku處，重組菌株比對照組多出一條特征條帶，重組酶純化方法參考文獻［13-14］，經(jīng)純化去除雜蛋白后得到單一的具有內(nèi)切菊粉酶活性的蛋白（圖3B），表明純化效果良好，純化出的活性蛋白表觀分子量約為70 ku，略高于根據(jù)內(nèi)切菊粉酶氨基酸序列計算得出的55 ku，這可能是由于蛋白折疊過程中的糖基化。

圖3 SDS-PAGE分析蛋白純化結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE analysis of the purified protease

2.3.2 最適溫度測定 為確定溫度對酶活性的影響，測定了從40～75℃下的酶活性，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果顯示，在40～60℃之間酶活隨溫度升高而增加，60℃時酶活達到最大，比從黑曲霉野生菌株［10］分離出的內(nèi)切菊粉酶最適溫度略高，超過65℃酶活下降較快，在溫度低于45℃或者高于65℃的范圍內(nèi)均不好。

圖4 酶的最適溫度Fig.4 The optimum temperature of the recombinant enzymes

2.3.3 最適pH測定 為確定pH對酶活性的影響，測定不同pH下的酶活性，結(jié)果如圖5所示，結(jié)果顯示，在pH3.5～5.0范圍內(nèi)，酶活性隨pH增加而升高，在pH5.0，酶活達到最大，pH超過6.0，酶活下降很快。

圖5 酶的最適pHFig.5 The optimum pH and pH stability of recombinant enzymes

2.3.4 熱穩(wěn)定性分析 經(jīng)過在50、55、60、65℃下條件下恒溫水浴處理9 h后，酶的活性隨時間變化過程如圖6。

圖6 酶的溫度穩(wěn)定性Fig.6 The thermostability of the recombinant enzymes

由結(jié)果可知，在60℃以下，內(nèi)切菊粉酶有很好的穩(wěn)定性。在55℃下保溫9 h后，內(nèi)切菊粉酶仍殘余83.2%的活性，但當(dāng)溫度高于60℃時，酶的活性下降很快，在65℃保溫9 h后酶幾乎完全失活。

2.3.5 pH穩(wěn)定性分析 為了確定pH對酶穩(wěn)定性的影響，分別測定在內(nèi)切菊粉酶在pH3.0～10.0下酶的活性，并與在標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的酶活相比較，實驗結(jié)果見圖7。

圖7 酶的pH穩(wěn)定性Fig.7 The pH stability of recombinant enzymes

由結(jié)果可看出，在pH3.0～7.0，酶活性在原來的90%以上，在pH10.0仍有原來酶活的81.1%，由此可見，內(nèi)切菊粉酶在pH3.0～10.0較為穩(wěn)定，在偏酸性條件穩(wěn)定性要高于堿性環(huán)境，并且隨著pH升高，酶的穩(wěn)定性下降加快。

2.3.6 金屬離子對內(nèi)切菊粉酶酶活的影響 為了測定金屬離子對酶活的影響，在反應(yīng)體系中添加了不同的金屬離子，結(jié)果如表2所示，由表2可知，金屬Mg2+、Ni2+、Li+、Na+對酶沒有明顯的激活或抑制作用，酶活性能保持原來的90%左右；而Cu2+、Ag+對酶有明顯的抑制作用，酶活性在原來的50%以下。

表2 金屬離子對內(nèi)切菊粉酶活力的影響Table2 Effect of different cations on recombinant endo-inulinase activity

2.4 內(nèi)切菊粉酶水解菊粉產(chǎn)物的分析檢測

2.4.1 TLC分析內(nèi)切菊粉酶水解菊粉產(chǎn)物 薄層層析（TLC）法檢測反應(yīng)產(chǎn)物，結(jié)果如圖8所示，隨著反應(yīng)時間的延長，長鏈菊粉逐漸被水解為短鏈糖，反應(yīng)8 h后，菊粉基本被完全水解為短鏈的低聚糖。

圖8 薄層層析法檢測菊粉水解產(chǎn)物Fig.8 The hydrolyzed products in different periods by TLC analyze

2.4.2 HPLC分析內(nèi)切菊粉酶水解菊粉產(chǎn)物 不同來源的內(nèi)切菊粉酶與菊粉的結(jié)合及作用方式有差別，從而生成產(chǎn)物的聚合度的分布也不同，而聚合度3～5的低聚果糖的營養(yǎng)價值要高于其他聚合度的低聚果糖。為考察產(chǎn)物聚合度的分布，對反應(yīng)產(chǎn)物進行

HPLC分析，不同時期產(chǎn)物成分液相圖顯示，在最初120 min內(nèi)，內(nèi)切菊粉酶將菊粉水解為3～6糖，從圖9中可以看出，三糖增加速率要遠(yuǎn)高于其他幾種糖，隨著時間的延長，5糖、6糖逐漸開始水解，最終將菊粉水解成以3～5糖為主的低聚糖，并伴隨有少量的2糖生成。

圖9 以菊粉為底物時水解產(chǎn)物液相分析Fig.9 The hydrolyzed products in different periods using inulin as the substrate by HPLC analyze

2.4.3 低聚果糖得率隨水解時間的變化 在加酶量為20 U/g下，利用內(nèi)切菊粉酶水解4%（w/v）的菊粉，結(jié)果如圖10所示，從圖中可以看出，菊粉水解速率由快變慢，5 h后水解反應(yīng)趨于平緩，可能是由于隨著反應(yīng)的進行，反應(yīng)體系粘度過高，不利于傳質(zhì)，從而抑制了酶的催化活性，導(dǎo)致水解反應(yīng)減慢。圖中表明在反應(yīng)11 h后低聚果糖得率達到63.5%。

圖10 低聚果糖得率隨水解時間的變化Fig.1 0 The conversion rate of fructooligosaccharides with the change of hydrolysis time

3 結(jié)論與討論

從黑曲霉中克隆得到的內(nèi)切菊粉酶基因在畢赤酵母中過表達，得到了高純度的內(nèi)切菊粉酶酶液，研究表明Cu2+、Ag+對酶有明顯的抑制作用；酶的最適pH和最適溫度分別為5和60℃，而且該酶在55℃以下具有很高的熱穩(wěn)定性；對內(nèi)切菊粉酶水解菊粉過程研究表明，內(nèi)切菊粉酶在8 h內(nèi)能將4%（w/v）菊粉水解為3～6個聚合度的低聚果糖，最終能將菊粉水解成以3～5糖為主的低聚糖，在轉(zhuǎn)化11 h后，低聚果糖得率達到63.5%。

菊粉酶因微生物來源不同，其酶學(xué)性質(zhì)也會存在一定的差異，如霉菌來源的菊粉酶的最適pH在4.5～7.0之間，酵母菌來源的菊粉酶在4.4～6.5之間，細(xì)菌來源的菊粉酶在4.8～7.0之間。通常，細(xì)菌和酵母菌來源的菊粉酶的最適溫度比霉菌的高，黑曲霉作為重要的糖苷酶類來源的微生物具有重要的研究意義，黑曲霉（A.niger strain 12）［15］內(nèi)切菊粉酶最適pH 為5.3，穩(wěn)定區(qū)在4.0～7.5；最適溫度為45℃，穩(wěn)定區(qū)在40℃以下，均沒有本實驗所構(gòu)建菌株酶學(xué)特性優(yōu)良，王靜［16］在水解菊粉反應(yīng)過程中添加10 U/g Aspergillus ficuum產(chǎn)生的內(nèi)切菊粉酶，在pH6.0、45℃條件下反應(yīng)72 h后，低聚果糖產(chǎn)量超過50%，主產(chǎn)物是DP2到DP4的低聚果糖。而本實驗采用的重組內(nèi)切菊粉酶能夠在8 h內(nèi)將菊粉水解為3～6個聚合度的低聚果糖，11 h后低聚果糖得率達到63.5%，水解時間短，低聚果糖得率高，符合水解菊粉生產(chǎn)低聚果糖的

基本要求，以上表明本研究構(gòu)建的黑曲霉來源的內(nèi)切菊粉酶具有很高的實用性，為利用菊粉生產(chǎn)低聚果糖的工業(yè)化提供了重要指導(dǎo)意義。

［1］Respondek F，Swanson K S，Belsiro K R，et al.Short-chain fructooligosaccharides influence insulin sensitivity and gene expression of fat tissue in obese dogs［J］.Journal of Nulrilion，2008，138（9）：1712-1718.

［2］Respondek F，Goachet A G，Julliand V.Effects of dietary short-chain fructooligosaccharides on the intestinal microflora of horses subjected to a sudden change in diet［J］.Journal of Animal Science，2008，86（2）：316-323.

［3］Morita T，kasaoka S，Ilase K，et al.Oligo-L-methionine and resistant protein promote cecal butyrate production in rats fed resistant starch and fructooligosaccharide［J］.Journal of Nulrilion，1991，129（7）：1333-1339.

［4］Li D，kim J M，Jin Z，et al.Prebiotic effectiveness of inulin extracted from edible burdock［J］.Anaerobe，2008，14（1）：29-34.

［5］Mesa M D，Silvan J M，Olza J，et al.Antioxidant properties of soy protein-fructooligosaccharide glycation systems and its hydrolyzates［J］.Food Research International，2008，41（6）：606-615.

［6］Uhm T B，Chae K S，Lee D W，et al.Cloning and nucleotide sequence of the endoinulinase-encoding gene，inu2，from Aspergillus ficuum［J］.Biotechnology Letters，1998，20（8）：809-812.

［7］Kang SII，Chang Y J，Oh S J，et al.Purification and properties of an endo-inulinase from an Arthrobacter sp.［J］.Biotechnology Letters，1998，20（10）：983-986.

［8］Zhang T，Chi Z，Chi Z，et al.Expression of the inulinase gene from the marine derived Pichia guilliermondii in Saccharomyces sp.W0 and ethanolproduction from inulin［J］.Microbial Biotechnology，2010，3（5）：576-582.

［9］Nakamura T，Shitara A，Matsuda S，et al.Production，purification and properties of an endoinulinase of Penicillium sp.TN-88 that liberates inulotriose［J］.Journal of Fermentation and Bioengineering，1997，84（4）：313-318.

［10］Ohta K，Akimoto H，Matsuda S，et al.Molecular cloning and sequence analysis of two endoinulinase genes from Aspergillus niger［J］.Bioscience，Biotechnology and Biochemistry，1998，62（9）：1731-1738.

［11］胡世界，羅素蘭，張吉貞，等.巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)及其高水平表達策略［J］.生物技術(shù)，2007，17（6）：79-83.

［12］李長青，薛永常.5種快速提取黑曲霉基因組DNA方法的比較［J］.中國生物制品學(xué)雜志，2014，27（5）：725-726.

［13］Cho YJ，Yun JW.Purification and characterization of an endoinulinase from Xanthomonas oryzae No.5［J］.Process Biochem，2002，37（11）：1325-1331.

［14］Shi XL Feng，MQ Shi J.High-level expression and purification of recombinant human catalase in Pichia pastoris［J］.Protein Expression and Purification，2007，54（2）：193-203.

［15］Ohta K，Akimo to H，Mo riyama S.Fungal Inulinase：enzymology，molecular biology and biotechno logy［J］.J Appl Glycosci，2004，51：247-254.

［16］王靜，金征宇，江波，等.Aspergillus ficuum菊粉酶的分離純化及其酶解菊粉制備低聚果糖［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報，2006，25（1）：1673-1689.

Overexpression of the endo-inulinase gene from Aspergillus niger in Pichia pastoris and its application research

WANG Ning-he，XING Xue-yan，F(xiàn)ENG Zhi-mei，LU Fu-ping，LI Yu*
（Key Laboratory of Industrial Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science＆Technology，Tianjin 300457，China）

The endo-inulinase gene（1551 bp）was amplified from the total DNA of A.niger by PCR and subsequently cloned into pPIC9K.The recombinant plasmid was linearized by Sac I and transformed into P.pastoris GS115 by electroporation，yielding the recombinant strain P.pastoris GS115/pPIC9K-endo I.Then right transformants were isolated and the recombinant enzyme derived from fermentation was characterized.Its optimal pH and optimum temperature of the recombinant enzyme was 5 and 60℃，respectively，moreover 83.2%of the original enzymatic activity remained after the incubation of recombinant enzyme at 55℃ for 9 hours.It was shown that Cu2+，Ag+strongly inhibited the recombinant enzyme activity.The hydrolytic process analyses showed that the recombinant endo-inulinase could hydrolyze 4%（w/v）inulin into DP3-6 of fructooligosaccharides in 8 h.The conversion rate reached 63.5%in 11 h.The research laid a foundation for the produce of fructooligosaccharides.

endo-inulinase；Pichia pastoris；enzyme characterization；conversion rate

TS201.3

A

1002-0306（2016）08-0219-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.037

2015－09－10

王寧鶴（1990-），男，碩士研究生，研究方向：酶工程，E-mail：wnh1991@sina.com。

*通訊作者：李玉（1976-），女，博士，教授，研究方向：應(yīng)用微生物與酶工程，E-mail：liyu@tust.edu.cn。

食品新酶創(chuàng)制與應(yīng)用關(guān)鍵技術(shù)研究（2013AA102106-07）；天津科技大學(xué)青年教師創(chuàng)新基金（2014CHG08）。