鎘在企鵝珍珠貝組織器官中的分布及其存在形態(tài)研究

廖 艷，吳育廉，吳曉萍，章超樺（.廣東海洋大學現代生物化學實驗中心，廣東湛江54088；.廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東普通高等學校水產品深加工重點實驗室/國家貝類加工技術研發(fā)分中心（湛江），廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江54088）

鎘在企鵝珍珠貝組織器官中的分布及其存在形態(tài)研究

廖 艷1，吳育廉1，吳曉萍2，章超樺2
（1.廣東海洋大學現代生物化學實驗中心，廣東湛江524088；2.廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東普通高等學校水產品深加工重點實驗室/國家貝類加工技術研發(fā)分中心（湛江），廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江524088）

為研究企鵝珍珠貝組織器官中鎘的分布及形態(tài)，實驗采用石墨爐原子吸收光譜法和凝膠層析技術分析了鎘在貝體不同組織器官中的分布、存在形態(tài)和相對分子質量分布。結果表明，企鵝珍珠貝各組織器官中鎘的含量分別為：全臟器2.33 mg/kg，外套膜2.50 mg/kg，閉殼肌2.40 mg/kg，內臟團2.38 mg/kg，斧足2.24 mg/kg，鰓1.42 mg/kg。全貝中83.3%的鎘蓄積在企鵝珍珠貝的內臟團、閉殼肌和外套膜中。企鵝珍珠貝各組織器官中只有不到40%的鎘以可溶性蛋白結合態(tài)的形式存在。各組織器官的可溶性熱穩(wěn)定蛋白經Sephadex G-50凝膠過濾柱層析分離后，均得到相對分子質量＞26000 u和＜16000 u的兩個蛋白質的紫外吸收峰。內臟團、外套膜和腮中的鎘在兩種分子質量段的蛋白質中均有分布；閉殼肌中少量鎘與大分子蛋白質結合，其余近90%的鎘分布在非蛋白組分中；斧足中鎘幾乎完全與大分子蛋白質結合。研究表明，鎘在企鵝珍珠貝組織器官中的分布及形態(tài)存在差異性。

企鵝珍珠貝，鎘，分子量分布，形態(tài)

雙殼貝類具有非選擇性濾食習性，在受污染的海域中生長的貝類極易富集環(huán)境中的有害物質，如致病菌、貝類毒素［1］、農獸藥殘［2］和重金屬［3］等。水體中呈游離態(tài)的重金屬離子進入生物體內，將與生物大分子（如特定蛋白質）或金屬硫蛋白（metallothionein）相結合，或以離子或低分子絡合離子的形式積累［4］。由于重金屬在生物體內的形態(tài)不同，其產生的毒性效應也有所不同。相關研究顯示重金屬鎘（Cd）在水生生物尤其是雙殼貝類體內的污染情況不容樂觀［5-6］。由于鎘在水生生態(tài)系統(tǒng)中呈現較為復雜的形態(tài)，且不同生物對鎘的吸收和排出規(guī)律不同，因此，本文以企鵝珍珠貝為研究對象，對其全臟器及各組織器官中的鎘含量進行檢測，并對鎘在各器官中的存在形態(tài)和結合態(tài)鎘在不同分子質量段蛋白質中的分布情況進行分析，探索鎘在貝類體內的存在形態(tài)，以期為企鵝珍珠貝蛋白質資源的合理利用提供數據和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

企鵝珍珠貝 采集于廣東省徐聞縣芳華珍珠養(yǎng)殖場，貝齡2.5年；鎘標準貯備液GBW08612（1.0 mg/mL）國家標準物質研究中心；貽貝標準GBW08571 中國科學院生態(tài)環(huán)境研究所國家海洋局第二海洋研究所；葡聚糖凝膠Sephedex G-50（中粒度） 北京鼎國昌盛生物技術有限公司；標準分子質量物質 磷酸異構酶triosephosphate-isomerase（26625 u）、肌球蛋白myoglobin（16950 u）、抑肽酶aprotinin（6512 u）、胰島素B insulin-B（3496 u）、桿菌肽bacitracin（1423 u）

美國Bio-Rad公司；馬尿酰-組氨酰-亮氨酸NHippuryl-His-Leu hydrate（433 u） 北京華美生物技術有限公司；鹽酸、硝酸、高氯酸 均為優(yōu)級純；其他試劑 均為分析純；實驗用水 超純水。

LC-20AT高效液相色譜儀 日本島津公司；Z-5000塞曼原子吸收光譜儀、CR-22高速冷凍離心機、U-3310紫外分光光度計 均為日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理 企鵝珍珠貝去殼、除雜，取全臟器依次用蒸餾水、超純水迅速洗凈，瀝干，于冰上按器官分解為內臟團、閉殼肌、外套膜、腮和斧足五部分，分別稱重后用高速組織勻漿機勻漿，于-18℃下凍藏備用。

1.2.2 樣品制備 參考文獻方法［7］，企鵝珍珠貝各臟器經解凍后，與經4℃預冷的0.01 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH8.6，含0.5 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）和1 mmol/L 2-巰基乙醇按1∶2（W/V）的比例在高速勻漿機中勻漿5 min，均質物于4℃冰箱靜置過夜。均質物于4℃下離心（10000 r/min）30 min，除去沉淀（Tris-HCl不溶物），上清液（可溶性蛋白）經80℃水浴加熱5 min除熱變性蛋白，冰浴冷卻5 min，再次于4℃下離心（10000 r/min）30 min，取上清（熱穩(wěn)定蛋白）供凝膠層析分離使用。Tris-HCl不溶物、可溶性熱穩(wěn)定蛋白和熱變性蛋白均留樣進行鎘元素測定。

1.2.3 可溶性熱穩(wěn)定蛋白的層析分離 取5 mL可溶性熱穩(wěn)定蛋白用Sephadex G-50進行凝膠層析（層析柱為2.6 cm×40 cm），以0.01 mol/L Tris-HCl（pH8.6）緩沖液在1 mL/min的流速下洗脫，每管收集8 mL，分別對各管層析液進行紫外檢測和鎘元素測定。

1.2.4 鎘元素的測定 凝膠層析液直接用石墨爐原子吸收光譜法測定鎘含量（ng/mL）；其他樣品處理參照國標（GB/T 5009.15.2003）方法［8］，經濕式消化后同上測定鎘含量。按同樣消解方法做空白實驗，并采用國家標準物質貽貝（GBW08571）驗證方法的準確度。消化液中鎘含量（ng/mL）經質量換算得到試樣中鎘含量（mg/kg）。

1.2.5 鎘含量的計算

式（1）中：X：凝膠層析洗脫峰中鎘相對含量（%）；N1：洗脫峰含鎘量（ng）；N0：總鎘量，即各洗脫峰含鎘量之和（ng）。

式（2）中：Y：器官（組分）中鎘相對含量（%）；M1：器官（組分）含鎘量（mg）；M0：總鎘量，即各器官（組分）含鎘量之和（mg）。

1.2.6 蛋白質相對分子質量的測定 可溶性蛋白的熱穩(wěn)定組分經凝膠層析分離，紫外光譜檢測，取各洗脫峰在280 nm波長處有最大吸收值處的餾分，采用高效空間排阻色譜法（HPSEC）進行相對分子質量的測定。分析柱為PROTEIN-PAK 60（WAT085250），流動相為0.05 mol/L Tris-HCl（pH7.2），流速0.7 mL/min，檢測波長214 nm，溫度25℃。

2 結果與分析

2.1 鎘在企鵝珍珠貝組織器官中的分布

企鵝珍珠貝全臟器及不同組織器官中鎘的含量測定結果見表1。由表1可知，企鵝珍珠貝的腮中鎘含量稍低（1.42 mg/kg），其他器官中鎘的含量都比較接近（2.24～2.50 mg/kg）。從鎘的相對含量分布上看，企鵝珍珠貝的內臟團、閉殼肌和外套膜中的鎘占總鎘量的83.3%，為主要蓄積鎘的器官。鎘在不同貝類體內分布規(guī)律并不一致，除了受生長環(huán)境的水質影響外，這可能與貝類種間差異對重金屬的吸收、累積途

徑不同有關。

表1 鎘在企鵝珍珠貝各組織器官中的分布（濕基，n=3）Table1 Distribution of Cd in different organs of Pteria penguin（wet basis，n=3）

2.2 鎘在企鵝珍珠貝組織器官中的存在形態(tài)

企鵝珍珠貝各組織器官不同提取組分中鎘的分布情況見圖1。由圖1可知，鎘在企鵝珍珠貝體內分別以Tris-HCl不溶態(tài)、熱穩(wěn)定蛋白結合態(tài)和熱變性蛋白結合態(tài)存在，這三種形態(tài)的鎘在各組織器官中的比例各不相同。其中，各組織器官均有超過60%的鎘以Tris-HCl不溶態(tài)存在?？扇苄缘鞍字墟k的含量分布依次為：內臟團＞閉殼?。救靖悖就馓啄?；可溶性蛋白經熱處理后鎘損失最多的為外套膜，接近三分之二，內臟團和斧足約損失一半左右，閉殼肌和腮則較少。這可能是因為構成各組織器官的蛋白質組成和熱敏蛋白含量不同而導致。

圖1 鎘在企鵝珍珠貝各組織器官不同提取組分中的分布Fig.1 The distribution of Cd in the different fractions of organs from Pteria penguin

2.3 鎘在企鵝珍珠貝組織器官可溶性熱穩(wěn)定蛋白中的相對分子質量分布

企鵝珍珠貝各組織器官的可溶性熱穩(wěn)定蛋白經Sephadex G-50凝膠過濾柱層析，測定每管洗脫液在280 nm處的紫外吸收值及相應的鎘含量，并繪制柱層析洗脫曲線（圖2）。從圖2中可以看出，各組織可溶性熱穩(wěn)定蛋白組分經Sephadex G-50凝膠過濾柱層析分離后均得到兩個蛋白質的紫外吸收峰。內臟團、外套膜和腮的洗脫液中，鎘的吸收峰與兩處蛋白質吸收峰基本重合，且鎘含量與蛋白含量的變化趨勢一致，由此可推斷在這三種器官中鎘可能與這兩種蛋白質相結合而存在；在閉殼肌的洗脫液中，少量鎘在第一峰處，而絕大部分鎘出現在兩個蛋白質吸收峰間，表明小部分鎘與大分子蛋白質相結合，大部分鎘可能與其他物質結合；在斧足中，幾乎全部鎘出現在第一峰處，表明斧足中的鎘基本都存在于大分子蛋白中。

經換算可得洗脫液中鎘的含量分布，見圖3。由圖3可以看出，閉殼肌中少量鎘與大分子蛋白質結合，其余89.83%的鎘分布在非蛋白組分中；內臟團的兩個蛋白質吸收峰中的鎘總量相差不大（47.82%，52.18%）；而外套膜和腮均為第一個峰中的鎘含量較大（61.62%，77.79%），說明大分子蛋白質結合了較多的鎘；斧足的熱穩(wěn)定組分中鎘幾乎完全與大分子蛋白質結合（99.26%）。各組織器官可溶性蛋白質熱穩(wěn)定組分大分子蛋白中鎘所占的百分比順序依次為：斧足＞腮＞外套膜＞內臟團＞閉殼肌，在小分子蛋白中

所占的百分比順序為：內臟團＞外套膜＞腮＞斧足＞閉殼肌。鎘在企鵝珍珠貝不同組織器官中與不同相對分子質量蛋白質的結合情況差異很大，說明鎘與蛋白質的結合是具有選擇性的，可能是由于不同組織器官的功能蛋白質組成不同造成。

圖2 各組織器官可溶性熱穩(wěn)定蛋白組分的Sephadex G-50凝膠層析圖譜Fig.2 Sephadex G-50 gel chromatography of heat stable components of soluble protein from organs

圖3 鎘在各組織器官Sephadex G-50凝膠層析洗脫液中的分布Fig.3 The distribution of Cd in eluate of Seph adex G-50 gel chromatography from organs

用已知相對分子質量的標準物質對HPSEC柱進行標定，將各分子質量的對數值（logMr）與相應的保留時間（tR，min）作圖，其線性方程為logMr=6.4972-0.2261tR，相關系數r=0.9877。在相同實驗條件下對樣品進行分離分析，通過該線性方程，可估算出色譜圖上各分離組分的分子量大小。取各個組織器官的可溶性熱穩(wěn)定蛋白層析液第一峰和第二峰A280 nm最大處的餾分，用HPSEC進行分離測定。圖4為內臟團熱穩(wěn)定組分層析液的HPSEC圖譜，其他組織器官與該圖譜近似（略）。根據相對分子質量校正曲線，各個組織器官第一洗脫峰主要是相對分子質量遠大于26000 u的組分，第二洗脫峰蛋白質組成較雜，由相對分子質量小于16000 u的多組分組成。

圖4 柱層析兩處洗脫峰的HPSEC圖譜Fig.4 HPSEC chromatogram of two elution peaks by column chromatography

3 討論

從中國人的傳統(tǒng)食用習慣來看，腹足類的貝類，一般選食其肌肉部分（腹足），如海螺、鮑魚等；雙殼類的貝類，很多是食用整個軟體部，如牡蠣、蛤、貽貝等；有的貝類只食其閉殼肌，如常見的干貝、江瑤柱，分別為扇貝和江瑤的閉殼肌干制品。從已有的研究報道來看，無論是雙殼類，還是腹足類，均是肌肉中的重金屬含量最低，而內臟團（含消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等）的重金屬含量高，因此有觀點認為，食用貝類海鮮時，最好去除貝類內臟團，食用剩下的貝類肌肉部分會更安全［10］。而根據筆者對鎘在企鵝珍珠貝的不同化學組分及各種蛋白質組分中的分布情況的研究［11-12］，并結合本研究的結果，可以發(fā)現，鎘在企鵝珍珠貝的內臟團中蓄積量最高，其次是閉殼肌和外套膜，無論是食用整個軟組織或其肌肉，都可能存在攝入過量重金屬的風險。因此，直接食用或對貝類進行加工利用時，應選擇清潔的原料，或進行相應的重金屬脫除工藝。

重金屬在生物體內的存在形態(tài)與生物體的種類、重金屬進入體內的形態(tài)、吸收途徑、在體內的積累方式等都有很大的關系。目前，有關生物體中鎘的存在形態(tài)研究主要關注的熱點是鎘金屬硫蛋白（MT）。也有一些研究發(fā)現，不同生物體內的鎘會與不同分子量段的蛋白質相結合，這些鎘結合蛋白并不一定都是金屬硫蛋白。如High等［13］用凝膠層析法對污染地區(qū)貽貝中的鎘結合蛋白進行分離時，除發(fā)現分子量約6000～7000 u的類似哺乳動物體內的金屬硫蛋白類物質外，還得到了分子量約60000 u的鎘-蛋白質結合物。在帽貝中也有類似物質存在，凝膠層析得到分子量分別為10800 u和22000 u的Cd-SH配合物。在牡蠣中的鎘，則與分子量為50000 u以上和3000 u以下的蛋白質相結合。廖琳［14］在對海豚肝臟的研究中發(fā)現，可溶性含鎘物質以兩種不同分子量的形態(tài)存在，其分子量大部分都在3000～70000 u范圍內，一部分分子量小于3000 u，這些含鎘蛋白質均不是鎘金屬硫蛋白。Bin Li等［15］采用分子排阻色譜-電感耦合等離子質譜（SEC-ICP-MS）分析了南極鱗蝦水提物中不同分子量金屬復合物的元素分布，發(fā)現鎘主要分布在相對分子質量大于20000 u的物質中。趙艷芳等［16］在扇貝中檢測到3種Cd形態(tài)：MT-Cd、谷胱甘肽（GSH）-Cd和半胱氨酸（Cys）-Cd，在菲律賓蛤仔中檢測到2種Cd形態(tài)：MT-Cd和GSH-Cd。文獻中報道的不同生物體內鎘結合蛋白的分子量分布并不一致，本研究中，企鵝珍珠貝體內鎘與不同分子量蛋白質結合的情況也與其他貝類不同，這些都體現了生物的多樣性。

4 結論

本研究表明，企鵝珍珠貝的內臟團、閉殼肌和外套膜中的鎘含量占總量的83.3%，可以推測這三個器官為蓄積鎘的主要器官。在體內各器官中，鎘的存在狀態(tài)有Tris-HCl不溶態(tài)、熱穩(wěn)定蛋白結合態(tài)和熱變性蛋白結合態(tài)，且在不同器官中的比例亦不相同。各器官中分離得到的可溶性熱穩(wěn)定蛋白經凝膠層析分離后，均可得到相對分子質量＞26000 u和＜16000 u的兩個蛋白質的紫外吸收峰，其中，內臟團、外套膜和腮中鎘的分布與上述兩種分子質量段的蛋白質分布情況基本重合，其他器官中的重合情況不明顯，進一步說明不同器官中鎘的結合情況可能不同。這是否能暗示二者在不同器官中的結合狀態(tài)特點，有待進一步的研究。此外，企鵝珍珠貝體內超過62%的鎘存在于Tris-HCl不溶物中，且在不同器官不溶物中鎘的百分含量不同，這部分鎘的形態(tài)、結構和性質也有待更深入的研究。

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Distribution and speciation studies of cadmium in the Pteria penguin tissues and organs

LIAO Yan1，WU Yu-lian1，WU Xiao-ping2，ZHANG Chao-hua2
（1.Modern Bio-Chemical Laboratory Center，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China；2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety，Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution，National Research and Development Branch Center for Shellfish Processing（Zhanjiang），College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China）

The distribution，speciation and molecular weight distribution of cadmium（Cd）in the Pteria penguin tissues and organs were studied by graphite furnace atomic absorption spectrometry and gel filtration chromatography technology.The results showed that the contents of Cd in the various tissues and organs of the Pteria penguin were 2.33 mg/kg the whole viscera，2.50 mg/kg mantle，2.40 mg/kg adductor muscle，2.38 mg/kg visceral mass，2.24 mg/kg foot，1.42 mg/kg gill.83.3%of the full shell Cd accumulation in visceral mass，adductor muscle and mantle in Pteria penguin.Less than 40%of the Cd in different tissues and organs of the Pteria penguin bound in the form of water soluble protein.Two ultraviolet absorption peaks of proteins，which had a relative molecular weight of more than 26000 u and less than 16000 u，were got after the isolation of soluble thermally stable protein of water soluble protein from every organ by Sephadex G-50 gel filtration column chromatography.The Cd in visceral mass，mantle and gill were distributed in two molecular weight proteins.About 90%Cd in adductor was distributed in nonprotein compounds while a small quantity of it was combined with proteins of high molecular weight.Nearly all the Cd of soluble thermally stable protein in foot were combined with proteins of high molecular weight.This research revealed that distribution and molecular weight distribution of Cd in the Pteria penguin tissues and organs differences.

Pteria penguin；cadmium；molecular weight distribution；speciation

TS201

A

1002-0306（2016）08-0176-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.028

2015-09-10

廖艷（1977-），女，碩士，實驗師，研究方向：食品安全檢測技術，E-mail：liaoyan39@163.com。

現代農業(yè)產業(yè)技術體系（CARS-48-07B）；廣東省科技廳農業(yè)攻關項目（2010B 020313005）。