不同熱處理條件下大豆分離蛋白的紅外光譜分析

李 楊，王中江，王 瑞，隋曉楠，齊寶坤，韓飛飛，畢 爽，江連洲，2，*（.東北農業(yè)大學食品學院，黑龍江哈爾濱50030；2.國家大豆工程技術研究中心，黑龍江哈爾濱50030）

不同熱處理條件下大豆分離蛋白的紅外光譜分析

李 楊1，王中江1，王 瑞1，隋曉楠1，齊寶坤1，韓飛飛1，畢 爽1，江連洲1，2，*
（1.東北農業(yè)大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030；2.國家大豆工程技術研究中心，黑龍江哈爾濱150030）

本文研究不同溫度、時間熱處理下不同濃度大豆分離蛋白的熱穩(wěn)定性及紅外光譜，探討蛋白質二級結構的變化規(guī)律，結果表明：樣品濃度的差異對變性溫度（TD）和變性焓變（ΔH）的影響不明顯，未經加熱處理的大豆分離蛋白中7S和11S球蛋白變性溫度分別為74.2℃和93.7℃。相比于未處理的蛋白質樣品，熱處理使α-螺旋結構增多，β-折疊結構減少。80℃熱處理下，α-螺旋結構及β-轉角結構均呈現先增加后減少的變化趨勢，而β-折疊結構含量則先減少后增加。在2%蛋白濃度、90℃熱處理條件下，隨著處理時間的增長，α-螺旋結構及β-折疊結構呈現出先增加后降低的變化趨勢，而無規(guī)卷曲結構則呈現相反的變化趨勢。無論何種蛋白濃度下，11S球蛋白在90℃熱處理45 min時的變性增大了無規(guī)卷曲結構含量，同時降低了β-轉角結構及β-折疊結構組分含量。

大豆分離蛋白，熱穩(wěn)定性，紅外光譜

傅立葉變換紅外吸收光譜（FTIR）技術是結構分析的重要工具，它以高靈敏度、高分辨率、快速掃描、聯(lián)機操作及高度計算機化等優(yōu)點見長，是研究蛋白質分子內氫鍵的一種有效方法，用來估測多肽和蛋白質二級結構［1-2］。目前，大豆蛋白是質優(yōu)價廉的植物蛋白資源之一，人們對其營養(yǎng)價值和功能特性認知

程度在逐年增加，實際生產加工中對大豆蛋白食品種類的開發(fā)也逐年增多，在多數含大豆蛋白的食品生產加工過程中都包括熱處理過程，如熱殺菌、噴霧干燥等［3］。這些操作都會對大豆蛋白的溶解性、乳化性、穩(wěn)定性等功能性質產生較大的影響［4］。而熱處理對大豆蛋白功能特性的影響一直是大豆蛋白研究領域的熱點之一。熱處理的溫度、時間和蛋白濃度等因素對蛋白質的聚集程度產生重要影響。在對大豆分離蛋白進行熱處理時，可以通過調整熱處理條件控制蛋白質的聚集程度，從而控制蛋白質的功能性質［5］。

現今，已有很多國內外研究者以大豆分離蛋白、大豆7S球蛋白和11S球蛋白為對象，探討熱處理過程中蛋白的結構變化及聚集行為［6］。蛋白質分子內的氫鍵、二硫鍵和疏水相互作用等作用力是蛋白質發(fā)生聚集的主要作用力［7］。加熱會使大豆7S球蛋白和11S球蛋白變性并發(fā)生聚集。WEIJERS等［8］研究指出蛋白質的變性和聚集程度會對大豆蛋白的功能性質產生顯著影響。而WANG C H［9］研究發(fā)現天然狀態(tài)的大豆11S球蛋白二級結構中主要是以β-折疊和無規(guī)則結構為主。Marcone等［10］利用FTIR研究熱處理對大豆11S球蛋白結構的影響，指出酰胺I帶1635 cm-1處紅外光譜峰強度的增加表明大豆11S球蛋白在熱聚集過程中分子間維持β-折疊的氫鍵加強。國內外近些年來關于大豆分離蛋白方面的研究有很多，主要集中在大豆分離蛋白的亞基結構、分離方法、構象研究、改性手段和大豆蛋白復合物等方面，對于熱處理對大豆分離蛋白空間結構的影響方面的研究少有報道。所以本研究針對不同溫度、時間熱處理下，不同濃度大豆分離蛋白的熱穩(wěn)定性及空間構象的變化，探討蛋白質熱穩(wěn)定特性及二級結構的變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆 東農-46號，由東北農業(yè)大學大豆研究所提供；石油醚、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、正己烷、鹽酸等試劑 國產分析純試劑。

CR22G高速冷凍離心機 日本日立公司；FD5-3型冷凍干燥機 美國SIM公司；PE Pyris6差示掃描量熱儀 美國PULUS TA.XT公司；MAGNA-IR560傅立葉變換紅外光譜系統(tǒng) 美國尼高力公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆分離蛋白（SPI）制備 參考Petruccelli［11］的方法。原料大豆經去皮、破碎后粉碎過60目篩，然后在40℃下，用正己烷萃取制備得到脫脂豆粉。將脫脂豆粉按1∶10的質量比與水混合，用2 mol/L NaOH調pH至8.0，攪拌l.5 h后，將其懸浮液在4℃條件下10000×g離心30 min，取上清液用2 mol/L HCl調pH 至4.5。靜置后在4℃條件下10000×g離心30 min，取蛋白沉淀水洗3次，最后取沉淀分散于水中并用2 mol/L NaOH調pH至7.0。再在4℃條件下10000×g離心30 min，除去少量的不溶物，將蛋白溶液冷凍干燥后粉碎即得粉末狀大豆分離蛋白。

1.2.2 大豆分離蛋白的熱處理 稱取3 g大豆分離蛋白溶于50 mL的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液中，而后通過添加標準緩沖液調節(jié)至所需濃度（2%和5%）。溶液中的蛋白質濃度由Lowery法確定，參比蛋白為牛血清白蛋白。調配后樣品溶液分別密封于加熱套管中在控溫水浴鍋中，70、80、90℃加熱，加熱時間為15、30、45、60、90 min。熱處理完成后，樣品迅速冷浴處理。

1.2.3 蛋白質熱穩(wěn)定性的測定 參考Tang等的方法［12］。利用差示掃描量熱儀測定大豆11S球蛋白樣品的熱力學特性。稱取5 mg的樣品放入樣品池中，加入10 μL、0.01 mol/L的磷酸緩沖溶液，壓盤密封，室溫下放置6 h；將平衡好的樣品池放到DPS操作臺左側，空白樣品池放置在右側。溫度掃描范圍：20～120℃；升溫速率：10℃/min；在120℃保持1 min，隨后從120℃降溫至20℃；降溫速率：30℃/min。利用Pyris 6.0軟件進行數據采集和處理得到大豆11S球蛋白的DSC曲線，峰值點溫度為大豆11S球蛋白的變性溫度（TD），曲線與基線間的面積確定變性焓變（ΔH）。每個樣品重復測定三次取平均值為最終結果。

1.2.4 紅外光譜分析 將凍干樣品置于干燥器內用P2O5充分干燥，稱取樣品1 mg，加入溴化鉀100 mg充分研磨混勻壓片進行FTIR測定。為了避免水蒸汽IR吸收的干擾，持續(xù)通入干燥的N2淋洗測量室。測試樣品前預先收集空氣背景。測定在波數范圍為4000～400 cm-1的譜段，分辨率4 cm-1，波數精度0.01 cm-1，掃描次數64次，環(huán)境溫度25℃［13］。

表1 熱處理大豆分離蛋白DSC分析Table1 DSC characteristics of heat-treat SPI

譜圖處理利用Systat的Peakfit Version 4.12軟件，

在譜帶范圍內（酰胺Ⅰ帶1700～1600 cm-1）進行基線校正，進行Savitsk-Go1ay函數平滑處理［14］，在二階導數譜基礎上采用Gauss分峰擬合，估算出子峰的個數和位置［14］，手動調整各子峰的峰高和半峰寬，多次擬合使殘差最?。≧2≥0.999），確保重疊譜帶可完全分辨，確定各子峰與各個二級結構單元的對應關系后，根據積分面積計算各二級結構組分的相對百分含量。各子峰與二級結構對應關系：1610～1640 cm-1為β-折疊；1640～1650 cm-1為無規(guī)則卷曲；1650～1660 cm-1為α-螺旋；1660～1700 cm-1為β-轉角［15］。

1.2.5 數據統(tǒng)計及分析 單項實驗重復3次，結果表示為均值±標準差。用SAS 8.12進行相關分析和方差分析，如果方差分析效應顯著（p＜0.05），使用Duncan multiple range test進行多重比較。

2 結果與討論

2.1 熱處理大豆分離蛋白的DSC分析

應用差示掃描量熱儀測定熱處理過程中SPI的變性程度，主要表現為兩個測定指標即變性溫度（TD）和熱焓變（ΔH），其中TD可用于推測蛋白質的熱穩(wěn)定性，而ΔH是疏水作用和蛋白質結構緊密性的重要指標［16-17］。大豆分離蛋白主要含兩種蛋白，β-伴球蛋白（7S）和大豆球蛋白（11S），熱變性溫度分別分布在68～75℃和85～93℃。由表1可知，未經加熱處理的大豆分離蛋白中7S和11S球蛋白變性溫度分別為74.2℃和93.7℃。

在本研究中樣品濃度的差異對TD和ΔH的影響不明顯。研究選取兩個具有代表性的處理條件（80℃、15 min，90℃、45 min），分別為7S與11S的起始變性溫度點。如表1所示，70℃熱處理后大豆分離蛋白TD和ΔH并未表現出明顯的變化。而在80℃熱處理15 min后，7S球蛋白的吸熱峰消失，表明在此條件下7S球蛋白組分發(fā)生完全變性，而90℃熱處理45 min，11S球蛋白組分發(fā)生完全變性，大豆球蛋白組分11S的ΔH2在此熱處理條件下降了接近12%，而TD2則由93.7℃上升至95.3～95.6℃。由此可知，盡管該熱處理溫度大大低于大豆球蛋白的變性溫度（93.7℃），蛋白質結構依然受到了部分影響，內部的疏水性基團在此過程中發(fā)生部分外露，蛋白質亞基組分解離，而后解離的大豆球蛋白重新折疊形成具有更高TD的更穩(wěn)定熱聚集體［18］。由此可以推斷，在80℃處理15 min后大豆分離蛋白中主要存在由變性β-伴球蛋白構成不可溶性熱聚集體，另有小部分可溶性熱聚集體由部分變性的大豆球蛋白組成［19］。相比之下，在90℃熱處理45 min后，7S和11S均發(fā)生完全變性，此時其熱聚集體組成由完全變性的兩種球蛋白組成。

2.2 熱處理大豆分離蛋白的紅外光譜分析

圖1 不同熱處理時間的大豆分離蛋白FT-IR光譜圖Fig.1 FT-IR spectra of SPI with different heat-treated times

圖1所示為不同熱處理條件下的大豆分離蛋白FT-IR原始光譜，不同處理條件下的大豆分離蛋白的酰胺I帶存在很大差異，對于蛋白質而言，傅里葉變換光譜能夠提供蛋白質分子中的氨基基團、酰胺I帶（或H-O-H彎曲振動和C=O伸縮振動）、酰胺Ⅱ帶（NH彎曲）、酰胺Ⅲ帶（或C-O和C-O-C振動）、蛋白質環(huán)

狀結構中的C-C振動，以及C-O-O糖苷鍵振動波段信息［20］。在蛋白質的紅外圖譜中，蛋白質二級結構信息重疊在酰胺I帶里，可以利用波段縮小技術將FTIR圖譜中的酰胺I帶細分，得到蛋白質的α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則結構、β-轉角等二級結構的定性定量信息。蛋白質二級結構的定量方式有多種，其中二階導數IR去卷積光譜擬合分析結果較為準確［21］。蛋白質酰胺I帶在二階導數光譜中的相應位置歸屬面積與對應結構模式相對含量呈正相關。在本研究中，對蛋白質的FT-IR分析依次進行基線校正、去卷積處理、二階導數擬合處理，經多次擬合確保擬合殘差最小。參考已有研究，各子峰與二級結構對應關系為：1615～1637 cm-1和1682～1700 cm-1為β-折疊結構［22］，1646～1664 cm-1為α-螺旋結構［23］，1637～1 645 cm-1為無規(guī)則卷曲結構，1664～1681 cm-1為β-轉角結構［24］。圖2為大豆分離蛋白去卷積FT-IR擬合定量圖譜，圖3所示為蛋白質二級結構定量信息。

圖2 大豆分離蛋白的去卷積酰胺I帶二階導數譜Fig.2 Deconvolution of the amide I spectra，the GCF bands thereof，and the second-derivative spectra of SPI

由圖3不同熱處理條件下大豆分離蛋白的擬合分析結果表明，β-折疊結構為含量最多的二級結構單元，這與已有的研究相符［25-26］。蛋白質的二級結構組分隨熱處理條件的改變而變化。相比于未處理的蛋白質樣品，熱處理使α-螺旋結構的增多，β-折疊結構減少。而熱處理過程中β-折疊結構含量的降低在其他蛋白質熱處理研究中也有部分體現［27］。

由圖3A可知，大豆分離蛋白濃度為2%在70℃熱處理條件下，前45 min內β-折疊結構含量降低，α-螺旋結構的增多及β-轉角結構含量增大，而無規(guī)卷曲結構含量變化較小。這表明β-折疊結構逐漸轉變?yōu)棣?螺旋結構及β-轉角結構，而β-折疊結構常見于蛋白質內部折疊區(qū)域，β-折疊結構含量的降低表明蛋白質疏水位點暴露，進而引起蛋白質表面疏水值的增大。如圖3B所示，蛋白濃度為5%在70℃熱處理條件下，與未處理的蛋白相比，熱處理并未造成明顯的結構含量變化，同時該條件下二級結構各組分含量并未表現出連續(xù)性的變化趨勢。

圖3 熱處理對大豆分離蛋白二級結構的影響Fig.3 Effect of the heat-treatment on the secondary structures of SPI

如圖3C和圖3D所示，在80℃熱處理下，隨著處理時間的增長，熱處理大豆分離蛋白的α-螺旋結構及β-轉角結構均呈現先增加后減少的變化趨勢，而β-折疊結構含量則先減少后增加。這種變化趨勢與

7S球蛋白的變性及逐漸形成的熱聚集體有關。由DSC實驗可知，在80℃熱處理15 min后7S球蛋白發(fā)生完全變性。7S球蛋白變性造成α-螺旋結構含量的增加和β-折疊結構含量的降低。長時間熱處理所帶來的β-折疊結構增加，被證實與7S球蛋白α’亞基和α亞基構成的熱聚集體形成有關［28］。Lee［29］報道由于氫鍵作用，β-折疊結構易存在于蛋白質聚集體內部。另外，相比于α-螺旋結構，由于β-折疊結構的弱水合作用使其在熱聚集體形成及凝膠網絡結構的形成中具有重要作用，這是由兩種結構中水分子與羰基基團相互作用幾何學分布差異造成的［30-31］。另外，80℃熱處理總體增多了β-轉角結構含量，增多的β-轉角結構可能是由其他更為有序結構單元轉化而來，此外熱聚集體分子間的β-折疊結構也易于轉變?yōu)棣?轉角結構［32］。80℃熱處理時，較高濃度蛋白的無規(guī)卷曲結構含量增加微小，而對于低濃度蛋白的無規(guī)則卷曲結構含量呈下降趨勢。這與高濃度蛋白80℃熱處理后，較多的熱聚集體形成以及不同分子量聚集體組分含量的平衡性變化有關。

如圖3E和圖3F所示，在2%蛋白濃度，90℃熱處理使α-螺旋結構增多而降低了β-折疊結構含量。隨著處理時間的增長，α-螺旋結構及β-折疊結構呈現出先增加后降低的變化趨勢，而無規(guī)卷曲結構則呈現相反的變化趨勢。在60 min時，α-螺旋結構及β-折疊結構明顯地轉變?yōu)棣?轉角結構，在此時7S及11S球蛋白均發(fā)生完全變性。由此可以推斷，β-轉角結構在新形成的熱聚集體中具有重要作用。而在5%蛋白濃度，90℃熱處理后，大豆分離蛋白的β-轉角結構含量的大幅增多可能與AB-11S球蛋白熱聚集體有關。通過比對可知，無論何種蛋白濃度下，在90℃熱處理45 min時，11S球蛋白的變性增大了無規(guī)卷曲結構含量，同時降低了β-轉角結構及β-折疊結構組分含量。在90℃熱處理45 min與處理30 min相比，高濃度蛋白中α-螺旋結構含量增多近4%，而低濃度蛋白中α-螺旋結構含量并未顯著增加。

3 結論

本研究中未經加熱處理的大豆分離蛋白中7S和11S球蛋白變性溫度分別為74.2℃和93.7℃。70℃熱處理后大豆分離蛋白TD和ΔH并未表現出明顯的變化，而在80℃熱處理15 min、90℃熱處理45 min，大豆球蛋白及β-伴球蛋白發(fā)生完全變性。

研究發(fā)現熱處理可以使α-螺旋結構增多及β-折疊結構減少。2%濃度蛋白在70℃熱處理條件下，前45 min內β-折疊結構含量降低，α-螺旋、β-轉角結構含量增大，無規(guī)卷曲結構含量變化較??；80℃熱處理下，2%和5%濃度蛋白的α-螺旋結構及β-轉角結構均呈現先增加后減少的變化趨勢，而β-折疊結構含量則先減少后增加；2%濃度的蛋白、90℃熱處理條件下，α-螺旋結構及β-折疊結構隨時間呈現出先增加后降低的變化趨勢，無規(guī)卷曲結構呈現相反的變化趨勢。而11S球蛋白在90℃、45 min時的變性增大了無規(guī)卷曲結構含量同時降低了β-轉角及β-折疊結構組分含量。

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Fourier transform infrared spectroscopic analysis of soybean isolate protein at different heat treatment conditions

LI Yang1，WANG Zhong-jiang1，WANG Rui1，SUI Xiao-nan1，QI Bao-kun1，HAN Fei-fei1，BI Shuang1，JIANG Lian-zhou1，2，*
（1.Food College，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2.National Soybean Engineering Technology Research Center，Harbin 150030，China）

In this study，the thermal stability and secondary structures of soy protein isolate（SPI）during heat treatments were analyzed by differential scanning calorimetry（DSC）and fourier transform infrared（FTIR）spectroscopic.The impact of differences in sample concentration on denaturation temperature（TD）and denaturation enthalpy（ΔH）were not obvious.The denaturation temperatures of 7S and 11S in isolated soy protein without heat treatment were 74.2℃and 93.7℃.Compared with untreated samples，the heat treatment resulted in an addition of α-helix structureand reduction of β-sheet structure.Heat treatment at 80℃，α-helix structure and β-turn structure showed a trend of increased firstly and then decreased.At 2%protein concentration，90℃ heat treatment conditions，with the processing time of growth，α-helix structure and β sheet structure showed a trend of first increase and then decrease，and random coil structure showed the opposite trend.In any protein concentrations conditions，90℃，heat treatment 45 min，11S globulin degeneration，increased the content of random coil structure，while reduced the component content of β-corner structure and β-sheet structure.

soybean protein isolate；thermal stability；FTIR spectroscopy

TS214.2

A

1002-0306（2016）08-0104-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.013

2015－07－29

李楊（1981-），男，博士，副教授，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程，E-mail：liyanghuangyu@163.com。

*通訊作者：江連洲（1960-），男，教授，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程，E-mail：jlzname@yeah.net。

國家自然科學基金青年基金項目（31301501）；黑龍江省自然科學基金項目重點項目（ZD201302）；黑龍江博士后科研啟動金（LBHQ13018）；國家科技支撐計劃課題（2014BAD22B00）。