稗草生防菌BC-1的分離及生物學(xué)特性研究

李健，李美，高興祥，房鋒，董連紅

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，山東省植物病毒學(xué)重點實驗室，山東 濟南250100)

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稗草生防菌BC-1的分離及生物學(xué)特性研究

李健，李美*，高興祥，房鋒，董連紅

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，山東省植物病毒學(xué)重點實驗室，山東 濟南250100)

為了能夠獲得低毒且高效的生物除草劑，本研究以蘋果園感病稗草為材料，從中分離得到菌株BC-1，形態(tài)學(xué)觀察和16S rDNA序列比對分析后，確認(rèn)該菌株為露濕漆斑菌(Myrotheciumroridum)。菌株BC-1最適生長培養(yǎng)基為PDA和PSA培養(yǎng)基，最適生長溫度為25～28 ℃。最適生長pH值為6～7；光照強度對菌絲生長有一定抑制作用；菌絲生長最佳碳源為麥芽糖，最佳氮源為硝酸銨。室內(nèi)生防試驗表明，該菌株分生孢子懸浮液對稗草生防效果最佳，接菌21 d后稗草發(fā)病率為100%，鮮重防效達(dá)93.7%；對馬唐、狗尾草、播娘蒿和反枝莧的生防效果相對較差，鮮重抑制率僅為33.7%，28.3%，-3.2%，16.8%。作物安全性試驗表明，該菌株的分生孢子液對玉米、小麥、水稻等作物安全。綜上所述，菌株BC-1有開發(fā)成商品化生物除草劑的潛力。

稗草；生物學(xué)特性；露濕漆斑菌；生物防治

農(nóng)田雜草是危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全的重要因素之一。據(jù)統(tǒng)計，我國每年因雜草危害造成的農(nóng)作物產(chǎn)量損失達(dá)9.7%[1]。稗草(Echinochloacrusgalli)生態(tài)適應(yīng)性強，在我國分布廣泛，是我國嚴(yán)重危害作物產(chǎn)量安全的18種惡性雜草之一[2]。稗草生育期與相應(yīng)作物生育期高度一致，且根系發(fā)達(dá)，吸收水分和養(yǎng)分能力強，易與田間農(nóng)作物爭奪水分、養(yǎng)分、光照和空間等條件，是我國水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)和小麥(Triticumaestivum)等糧食作物上危害最嚴(yán)重的雜草之一[3]。目前，對稗草的防除主要通過化學(xué)防除方法，該方法簡單易行，經(jīng)濟有效。但是，化學(xué)除草劑的長期使用不僅造成環(huán)境污染，更會引起高抗性雜草的產(chǎn)生，從而使得化學(xué)藥劑的使用陷入單純劑量逐漸增加的惡性循環(huán)[4-5]。例如，早在1993年，黃炳球等[6]就已報道稗草對丁草胺和禾草丹產(chǎn)生了明顯的抗藥性；而隨著近年來二氯喹啉酸在我國的大規(guī)模推廣使用，我國各主要水稻產(chǎn)區(qū)的稗草對二氯喹啉酸已經(jīng)產(chǎn)生了不同程度的抗藥性[7]。

雜草生物防治菌株多采集于自然界，毒性低，具有長效防治的特點，是減少化學(xué)藥品大量使用的有效手段[5]。利用生物防除雜草已有200多年歷史，我國是應(yīng)用生物防除雜草較早的國家之一，如20世紀(jì)60年代中期研制并推廣的“魯保一號”菌劑，為我國在生物除草劑研究應(yīng)用方面打下良好的基礎(chǔ)[8]。近年來在諸多科研人員的重視下，我國在雜草生物防治上也取得了一定成果。初步建立起了以稗草-新月彎孢(Culvularialunata)[9]、稗草-尖角突臍孢(Exserohilummonoceras)[10]，馬唐(Digitariasanguinalis)-畫眉草彎孢(Curvulariaeragrostidis)[11]和空心蓮子草(Alternantheraphiloxeroides)-假隔鏈格孢菌(Nimbyaalternantherae)[12]等生物除草劑研究的技術(shù)體系，但是我國生物除草劑產(chǎn)品尚處于初期階段，需要進一步研究并開發(fā)成為可替代化學(xué)除草劑的新型生物除草劑。

生物除草劑具有對目標(biāo)雜草選擇性高、環(huán)境負(fù)效應(yīng)小、對作物安全性高等優(yōu)點[13]，符合可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展要求，已受到世界各國的高度重視，紛紛致力于該領(lǐng)域的開發(fā)與研究。本實驗室于2013年對山東省主要雜草病原真菌進行調(diào)查和分離，并從山東齊河的感病稗草葉片上分離得到1株具有強致病力的菌株BC-1，并對其進行了形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定、生物學(xué)特性、生防效果和作物安全性評估等的研究，以期為進一步研究和下一步的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

供試植物：稗草、馬唐、狗尾草(Setariaviridis)、反枝莧(Amaranthusretroflexus)和播娘蒿(Descuminiasophia)等雜草種子均為本實驗室采集并保存。玉米、小麥和水稻種子均購自種子公司。玉米品種為魯單981，小麥品種為濟麥22，水稻品種為鄭旱6號。

本研究所用培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(potato dextrose agar, PDA)、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(potato sucrose agar, PSA)、葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基(peptone dextrose agar, SDA)、真菌培養(yǎng)基(fungi medium, ZJ)、水瓊脂培養(yǎng)基(water)和稗草汁液培養(yǎng)基(baicao juice medium, BC)等基本配方參考李健等[14]和方中達(dá)[15]的方法。碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基和氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方參考李健等[14]的方法配制。

1.2病原菌的分離純化

參照康慧穎等[16]和Han等[17]的方法對病原菌進行分離純化。自然感病的稗草葉片從山東省齊河縣果園中采集，放于信封內(nèi)于4 ℃保存，用于病原菌分離。首先將感病的稗草葉片用無菌水沖洗2次，剪下病葉的病健結(jié)合部位，用5%(v/v)次氯酸鈉溶液和70% (v/v)酒精分別進行表面消毒2和1 min，最后用無菌水漂洗2～3次后將組織轉(zhuǎn)移至新的滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，超凈臺內(nèi)吹干。以上步驟均在超凈工作臺中進行操作。將吹干后的葉片組織鋪于PDA培養(yǎng)基表面，置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待長出菌落后挑取菌絲至新的PDA培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)至產(chǎn)孢并經(jīng)過單孢子分離、純化得到純培養(yǎng)菌菌株，并編號為BC-1。

1.3菌株的鑒定

1.3.1形態(tài)鑒定將菌株BC-1在PDA平板上培養(yǎng)10 d，期間觀察并記錄其菌落形態(tài)。同時用無菌水將培養(yǎng)基表面的分生孢子洗下，制成分生孢子懸浮液，調(diào)節(jié)濃度至1×104個孢子/mL左右。顯微鏡下觀察菌株BC-1的分生孢子形態(tài)；對照魏景超[18]編著的《真菌鑒定手冊》，對菌株BC-1進行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.3.2分子鑒定用CTAB法提取菌株BC-1的基因組DNA[19]，采用引物ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5 (5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物回收后送至上海生物工程有限公司進行PCR產(chǎn)物測序。將測得序列提交到NCBI(National Center for Biotechnology information，美國生物信息中心，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的GeneBank進行BLAST分析，利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4影響菌株BC-1菌絲生長的因子的測定

1.4.1培養(yǎng)基對菌株BC-1菌絲生長的影響PDA培養(yǎng)基活化保存的菌株，5 d后，在菌落的邊緣打取直徑為5 mm的菌餅，接種到各供試培養(yǎng)基上，10 d后測量菌落直徑；并收集菌絲，80 ℃烘箱烘烤2 h后稱量菌絲干重(下同)。

1.4.2溫度對菌株BC-1菌絲生長的影響以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，接菌后將溫度條件設(shè)置為19，22，25，28，31和34 ℃測定溫度條件對菌株生長的影響，接菌10 d后，測量菌落直徑及菌絲重量。

1.4.3光照時間對菌株BC-1菌絲生長的影響以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，接菌后光照條件設(shè)置為連續(xù)黑暗、光照/黑暗(8 h/16 h、12 h/12 h、16 h/8 h)交替和持續(xù)光照5個處理測定光照條件對菌株生長的影響，接菌10 d后，測量菌落直徑及菌絲重量。

1.4.4pH值對菌株BC-1菌絲生長的影響將PDA培養(yǎng)基滅菌后調(diào)制成不同pH值，設(shè)置的pH值為4，5，6，7，8，9，參照1.2.1的方法，25 ℃，黑暗條件下培養(yǎng)10 d后，統(tǒng)計菌落直徑和菌絲重量。

1.4.5碳氮源對菌株BC-1菌絲生長的影響在碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基上分別添加相應(yīng)量(20 g/L)葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖，觀察并統(tǒng)計菌落生長情況；在氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基上分別添加相應(yīng)量(1 g/L)硝酸鈉、硝酸鉀、硝酸鈣、硝酸銨、硫酸銨5種氮源，25 ℃，黑暗條件下培養(yǎng)10 d，觀察并統(tǒng)計菌落生長情況。

以上各試驗均于2015年進行，均設(shè)置3次重復(fù)。

1.5寄主范圍測定

將BC-1接種于PDA平板培養(yǎng)基，25 ℃、黑暗培養(yǎng)14 d后，收集孢子并配制成濃度為1×108個/mL的孢子懸浮液(含0.05%的吐溫80)。將孢子懸浮液噴施2葉期稗草、馬唐和狗尾草等雜草植株上，28 ℃、黑暗保濕培養(yǎng)2 d后，持續(xù)光照培養(yǎng)。觀察菌株的致病特性。以噴施0.05%吐溫80的植株為對照，每個處理設(shè)置3次重復(fù)。

1.6作物安全性測定

將濃度為1×108個/mL 的孢子懸浮液[20](含0.05%的吐溫80)噴施2～3葉期玉米、小麥和水稻植株，培養(yǎng)方法同1.4。接種7 d后，觀察菌株對供試玉米、小麥和水稻的安全性。21 d后收集作物地上部分，稱量鮮重，并統(tǒng)計鮮重抑制率。

1.7數(shù)據(jù)分析

鮮重抑制率(fresh weight inhibition rate，F(xiàn)WIR)的計算公式：FWIR(%)=[(對照平均鮮重-處理平均鮮重)/對照平均鮮重]×100。利用SPSS統(tǒng)計軟件ANOVA和GLM分析不同處理間的差異顯著性。

2　結(jié)果與分析

圖1　生防菌BC-1菌落與分生孢子Fig.1　Colony and conidia of BC-1 strain　A：BC-1菌落Colony of BC-1 strain；B：分生孢子Conidia of BC-1 strain.

2.1病原菌的分離與鑒定

BC-1菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后，菌落直徑約8 cm，白色，菌落產(chǎn)生漆黑色粘孢子團(圖1A)。顯微觀察顯示(圖1B)，BC-1菌株分生孢子梭形，無色。表型分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)結(jié)果表明，BC-1菌株為露濕漆斑菌(Myrotheciumroridum)，屬半知菌亞門，殼霉目，杯霉科[21]。

2.2菌株BC-1在不同培養(yǎng)基內(nèi)生長情況

菌株BC-1在6種不同成分培養(yǎng)基生長情況見表1，在PDA和PSA培養(yǎng)基上長勢最好，生長速率較高，培養(yǎng)10 d后菌落直徑分別為5.5和5.6 cm，但PSA培養(yǎng)基中的氣生菌絲量明顯高于PDA培養(yǎng)基(表1)，為6種培養(yǎng)基中菌絲重量最高。由稗草汁液配制的BC培養(yǎng)基雖然菌落直徑較其他培養(yǎng)基沒有較大差別，但是氣生菌絲量較少。綜上結(jié)合產(chǎn)孢量分析，PDA和PSA培養(yǎng)基為最適合BC-1菌株生長和產(chǎn)孢培養(yǎng)基。

圖2　BC-1 系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.2　Phylogenesis analysis of BC-1 strain

表1　菌株BC-1在不同培養(yǎng)基上的生長速率

注：表中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3)，同行數(shù)據(jù)后的不同字母表示在 0.05 水平上差異顯著，下同。

Note: The values in the Table are the average value±the standard error (n=3), and the different letters within the same row indicate that the differences are significant at the 0.05 level. The same below.

2.3溫度對BC-1菌株生長的影響

以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，研究溫度對菌株BC-1生長的影響。由表2可以看出，在22，25和28 ℃培養(yǎng)條件下，菌株BC-1在菌落直徑、菌絲產(chǎn)量上沒有顯著差異，而在22 ℃條件下產(chǎn)孢量顯著降低。而當(dāng)溫度低于22 ℃或高于28 ℃時，菌株BC-1在菌落直徑、菌絲產(chǎn)量和產(chǎn)孢量上均顯著下降。

表2　溫度對菌株BC-1生長的影響

2.4光照時長對BC-1菌株生長的影響

以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，研究光照時間長短對菌株BC-1生長的影響。由表3可以看出，連續(xù)黑暗條件下，菌株BC-1生長情況最好，菌絲產(chǎn)量最高。根據(jù)菌株BC-1在不同光照時長下的生長情況，顯示光照對菌株BC-1的生長有一定抑制作用，且隨著光照時間的增長,抑制作用更為明顯。

2.5pH值對菌株BC-1生長的影響

由表4可以看出，菌株BC-1在pH值為4～9的培養(yǎng)基上的生長趨勢為，菌落直徑和菌絲重量均表現(xiàn)為先增加后減少的趨勢。菌株BC-1在pH值為6～7時生長最好，當(dāng)培養(yǎng)基pH值<6和pH>7時生長速率和氣生菌絲產(chǎn)生量均開始受到抑制，并且當(dāng)培養(yǎng)基pH值<5和pH>8都受到明顯抑制。

2.6碳氮源對菌株BC-1生長的影響

在以葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉和乳糖為碳源的培養(yǎng)基上對菌株BC-1進行培養(yǎng)時，各培養(yǎng)基的菌落直徑均在5.0～6.0 cm，并沒有明顯差異。但菌絲重量卻表現(xiàn)出明顯差異，從圖3可以看出，菌絲重量從高到低依次為麥芽糖>蔗糖>乳糖>葡萄糖>淀粉。分別以硝酸鈉、硝酸鉀、硝酸鈣、硝酸銨和硫酸銨為氮源進行試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株BC-1在以硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基上，菌落直徑較其他培養(yǎng)基明顯減小。菌絲重量從高到低依次為硝酸銨>硫酸銨>硝酸鉀>硝酸鈉>硝酸鈣。綜上，菌株BC-1的最佳碳源為麥芽糖；最佳氮源為硝酸銨，其對銨態(tài)氮源的利用好于硝態(tài)氮源(圖3)。

表3　光照時長對菌株BC-1生長的影響

表4　pH值對菌株BC-1生長的影響

圖3　菌株BC-1在含不同碳氮源培養(yǎng)基上的生長速率Fig.3　Growth rate of the strain BC-1 in different carbon and nitrogen sources　G:葡萄糖Glucose；M：麥芽糖Maltose；S：蔗糖Sucrose；St：淀粉Starch；L：乳糖Lactin.

2.7接種時期對致病力的影響

菌株BC-1對稗草的致病力受接種時期的影響。本研究分別對2～3葉期和4～5葉期的稗草進行接種，結(jié)果顯示，在相同的接種溫度下，2～3葉期的稗草致死率達(dá)58.5%，鮮重防效達(dá)91.8%，而對4～5葉期的稗草致死率則只有17.2%，鮮重防效也低于2～3葉期(表5)。綜上，菌株BC-1對2～3葉期的稗草在致死率和鮮重防效均優(yōu)于4～5葉期稗草。

表5　接種時期對菌株BC-1致病力的影響

2.8菌株BC-1對不同雜草防效分析

雜草生防實驗結(jié)果表明,BC-1菌株孢子液對稗草生防效果最佳,接菌21d后稗草發(fā)病率為100%,致死率達(dá)57.2%,鮮重抑制率達(dá)到93.7%;對馬唐、狗尾草和反枝莧的生防效果較差,鮮重抑制率僅為33.7%,28.3%,16.8%;反枝莧雖然發(fā)病,但是卻不致死;而播娘蒿幾乎不感病,BC-1對其生長幾乎沒影響(表6)。

2.9作物安全性分析

作物安全性試驗結(jié)果(表7)表明,在噴霧7d后,玉米(魯單981)、小麥(濟麥22)和水稻(鄭旱6號)葉片沒有明顯病斑;接菌21d后,玉米、小麥和水稻等作物鮮重沒有明顯的抑制,表現(xiàn)為安全。

3　結(jié)論與討論

農(nóng)田雜草與作物競爭光照、生存空間和土壤肥力,造成作物產(chǎn)量損失,化學(xué)除草劑的發(fā)現(xiàn)與使用在一定程度上釋放了勞動力,降低了農(nóng)業(yè)成本,為保障全球糧食安全做出了重要貢獻(xiàn)。迄今,化學(xué)除草劑已經(jīng)是使用量最大的農(nóng)藥類別,僅僅草甘膦的使用量就已經(jīng)占據(jù)全球農(nóng)藥市場的近20%[22]。但是隨著化學(xué)除草劑的大規(guī)模持續(xù)使用,其帶來的負(fù)面影響也越來越受到關(guān)注，尤其是近些年隨著抗性雜草的廣泛出現(xiàn)，導(dǎo)致了除草劑倍量使用現(xiàn)象的發(fā)生，進一步加劇了除草劑殘留等環(huán)境危害[23-25]。因此，研制高效、持續(xù)且無殘留的新型生物除草劑已經(jīng)顯得十分迫切。在我國，隨著經(jīng)濟的發(fā)展以及在農(nóng)業(yè)上實施的“食品安全”戰(zhàn)略，給生物除草劑在我國的研究和發(fā)展提供了機遇，使生物除草劑逐漸成為當(dāng)前研制和開發(fā)的熱點之一[26]。生物除草劑的篩選主要依據(jù)兩方面：有效性(對目標(biāo)雜草防治效果好)和專一性(對目標(biāo)雜草外的作物安全)[27]。

表6　BC-1菌株孢子液對不同雜草生物防效的比較

表7　BC-1菌株孢子液對不同作物安全性比較

能夠高效地防治目標(biāo)雜草是生防菌是否有研究價值的基礎(chǔ)。BC-1菌株分離自感病的稗草植株，通過室內(nèi)防效實驗，發(fā)現(xiàn)菌株BC-1對稗草具有良好的生物防效，具備進一步開發(fā)的潛力。該菌株對其他類雜草，例如對馬唐、狗尾草、反枝莧等雜草的防治效果則一般；同時BC-1菌株對玉米、小麥和水稻等作物安全性較高。真菌除草劑的大規(guī)模使用會在短期內(nèi)人為地增加使用環(huán)境中的該病原菌數(shù)量，并因此對環(huán)境中的其他作物構(gòu)成潛在威脅，因此所篩選病原菌對作物安全性也是雜草生防菌研究中的重要問題[28]。生防菌株在對目標(biāo)雜草具有良好防效的基礎(chǔ)上，同時對其他常見作物安全，這就為該菌株的進一步利用掃清了障礙，避免了因生防菌株大規(guī)模引入、應(yīng)用而造成對作物安全的人為危害。

近20年來，美國專利局公布的關(guān)于生物除草劑的專利已經(jīng)達(dá)到了90個左右，而加拿大和日本等國家的相關(guān)專利申請也分別為17和8個，但是截至目前全球范圍內(nèi)僅有20多個生物除草劑產(chǎn)品登記[29]。這是因為在具備了高效性和專一性后，雜草生防菌初步具備了被開發(fā)為生防制劑的潛力，但是否具備開發(fā)價值，并進一步開發(fā)為除草劑登記產(chǎn)品，還取決于該菌的一系列生物特性，例如培養(yǎng)的難易程度，對培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的要求和生防因子的制備難易等影響[30]。本試驗中獲得的BC-1菌株易于培養(yǎng)，產(chǎn)孢量高，且未經(jīng)任何基因修飾，因此將它釋放到自然界中不會造成生態(tài)環(huán)境的安全隱患，是相對安全的生物防治介體。綜上所述，菌株BC-1兼?zhèn)溆行院桶踩裕@示出該菌具有開發(fā)成商品化生物除草劑的巨大潛力。2015年3月，農(nóng)業(yè)部發(fā)布了《到2020 年農(nóng)藥使用量零增長行動方案》，就如何提高農(nóng)藥利用效率，減少農(nóng)藥總使用量，改善我國土壤環(huán)境問題等方面提出了具體要求，而鑒于微生物源農(nóng)藥的諸多優(yōu)點，因此微生物源農(nóng)藥的開發(fā)顯得十分迫切。

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Isolation and biological characteristics of the biological control fungi BC-1 forEchinochloacrusgalli

LI Jian, LI Mei*, GAO Xing-Xiang, FANG Feng, DONG Lian-Hong

InstituteofPlantProtection,ShandongAcademyofAgriculturalScience,ShandongKeyLaboratoryofPlantVirology,Jinan250100,China

There has been increasing effort in the research and development of biological herbicides because of their low toxicity.Myrotheciumroridum, strain BC-1 was isolated from diseasedEchinochloacrusgallileaves in order to obtain a low toxicity and effective biological herbicide. The BC-1 strain was identified using its culture characters and 16S rDNA sequence analysis. The optimal mycelium growth media were PDA and PSA medium. The optimal culture temperature is 25-28 ℃, and optimal initial pH of culture media was 6-7. Darkness was beneficial for mycelium growth. The optimal mycelium growth carbon source is maltose, and the best nitrogen source was NH4NO3. Additionally, biocontrol testing showed that theE.crusgalliwere all infested with BC-1 21 days after innoculation, and fresh weight inhibition was 93.7%. However, the fresh weight inhibition effects of BC-1 onDigitariasanguinalis，Setariaviridis,DescuminiasophiaandAmaranthusretroflexuswere only 33.7%， 28.3%， -3.2% and 16.8% respectively. Crop safety analysis showed that the strain BC-1 was safe toZeamays,TriticumaestivumandOryzasativa. This study suggests that strain BC-1 has potential to be developed into an effective microbial herbicide with economic and social benefits.

Echinochloacrusgalli; biological characteristics;Myrotheciumroridum; biological control

10.11686/cyxb2015583http://cyxb.lzu.edu.cn

李健， 李美， 高興祥， 房鋒， 董連紅. 稗草生防菌BC-1的分離及生物學(xué)特性研究. 草業(yè)學(xué)報, 2016, 25(8): 164-171.

LI Jian, LI Mei, GAO Xing-Xiang, FANG Feng, DONG Lian-Hong. Isolation and biological characteristics of the biological control fungi BC-1 forEchinochloacrusgalli. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(8): 164-171.

2015-12-31；改回日期：2016-03-25

山東省自然科學(xué)基金(ZR2015CQ014)和國家863計劃項目(2011AA10206)資助。

Corresponding author. E-mail: limei9909@163.com