• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    植物根際促生菌對(duì)兩種真菌病害病原的抑制作用及其鑒定

    2016-09-14 03:29:03孫廣正姚拓趙桂琴李建宏陳龍劉歡
    草業(yè)學(xué)報(bào) 2016年8期
    關(guān)鍵詞:根腐病發(fā)酵液抑制率

    孫廣正,姚拓,趙桂琴,李建宏,陳龍,劉歡

    (甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院, 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室,中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心,甘肅 蘭州 730070)

    ?

    植物根際促生菌對(duì)兩種真菌病害病原的抑制作用及其鑒定

    孫廣正,姚拓*,趙桂琴,李建宏,陳龍,劉歡

    (甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院, 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室,中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心,甘肅 蘭州 730070)

    利用鉬藍(lán)比色法、乙炔還原法和高效液相色譜法分別測(cè)定了分離自5種植物根際的19株細(xì)菌溶磷、固氮和分泌生長素特性;用平板對(duì)峙生長法測(cè)定了19株細(xì)菌對(duì)黃瓜枯萎病菌和小麥根腐病菌的抑制作用;結(jié)合菌株形態(tài)、生理生化反應(yīng),利用分子生物學(xué)方法鑒定了其中8株優(yōu)良細(xì)菌。結(jié)果表明,菌株BacillussubtilisLM4-3固氮酶活性較高[244.88 nmol C2H4/(mL·h)];菌株B.subtilisLHS11-1溶磷能力較強(qiáng)(205.77 mg/L);菌株P(guān)GRS-3分泌IAA能力較好(40.78 μg/mL)。5株菌株能夠有效拮抗黃瓜枯萎病菌,其中B.subtilisFX2-1抑菌活性較強(qiáng)(活菌抑制率69.07%,發(fā)酵液抑制率51.73%)。7株菌株能夠有效拮抗小麥根腐病菌,其中B.subtilisFX2-1抑菌活性較強(qiáng)(活菌抑制率 78.17%),B.subtilisLHS11-1發(fā)酵液抑制率高達(dá)81.52%。其他具有較好促生或拮抗上述兩種病原真菌的菌株經(jīng)鑒定,分別屬于蠟樣芽孢桿菌(B.cereus,菌株XX1)、短小芽孢桿菌(B.pumilus,菌株F1-4和LX22)、簡(jiǎn)單芽孢桿菌(B.simplex,菌株XX6)和熒光假單胞桿菌(Pseudomonasfluorescens,菌株XX5)。

    PGPR菌;促生特性;黃瓜枯萎病菌;小麥根腐病菌;抑菌作用;鑒定

    植物病害是植物在生物或非生物因子影響下,在生理、形態(tài)和組織上發(fā)生一系列的病理變化,使植物不能正常地生長發(fā)育,并出現(xiàn)各種病態(tài),從而影響經(jīng)濟(jì)效益的現(xiàn)象[1]。黃瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌黃瓜?;?Fusariumoxysporumf. sp.cucumerinum)引起,是一種世界性的植物維管束病害,其發(fā)病程度與土壤中病原微生物累積數(shù)量密切相關(guān),研究表明土壤中尖孢鐮刀菌數(shù)量大于103/g,即可使黃瓜致病[2]。該病是黃瓜連作障礙中最主要的因素之一,近年來有愈來愈嚴(yán)重的趨勢(shì),嚴(yán)重影響生產(chǎn)[3]。此外,該菌還引起馬鈴薯(Solanumtuberosum)、茄子(Solanummelongena)、棉花(Gossypiumhirsutum)等多種農(nóng)作物病害。小麥根腐病是由麥根腐平臍蠕孢(Bipolarissorokiniana)引起,該病害的發(fā)生與土壤、種子帶菌量和耕作栽培制度等因素密切相關(guān),能使小麥(Triticumaestivum)減產(chǎn)20%~60%[4]。此外,該菌還能危害禾本科等多種植物,是根部的主要病原之一。目前,黃瓜枯萎病和小麥根腐病防治主要依賴化學(xué)農(nóng)藥。然而,長期大量施用化學(xué)農(nóng)藥導(dǎo)致農(nóng)藥殘留及環(huán)境污染,危害人類健康并破壞生態(tài)平衡,同時(shí)也使病原菌產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性。因此,探尋可持續(xù)控制病害的新途徑已經(jīng)迫在眉睫。

    近年來研究表明,植物根際促生菌(plant growth promoting rhizobacteria,PGPR)通過改變土壤中難溶性元素的形態(tài),從而促進(jìn)植物吸收(如固氮、解磷等),或者合成利于植物生長發(fā)育的物質(zhì)(如生長素等)和間接方式促進(jìn)植物生長,同時(shí)一些菌還能抑制或減輕某些植物病原菌生長和繁殖[5]。近年來,國外學(xué)者對(duì)PGPR菌用于生物防治的研究很多,取得了許多寶貴成果。但是,我國這方面工作稍顯落后,絕大多數(shù)工作只限于菌株的分離篩選方面,對(duì)于其綜合特性的研究還很少。另一方面,分離鑒定優(yōu)良PGPR菌株,并系統(tǒng)研究其促生抗病特性,對(duì)于進(jìn)一步開發(fā)這一寶貴資源也具有重要意義。鑒于此,本研究以分離自5種植物根際的19株菌為原始材料,測(cè)定了菌株的溶磷能力、固氮酶活性和分泌生長素特性;研究了細(xì)菌對(duì)黃瓜枯萎病菌和小麥根腐病菌的抑制作用;鑒定了優(yōu)良拮抗菌株。以期為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上控制黃瓜枯萎病和小麥根腐病提供新的生物防治資源。

    1 材料與方法

    1.1材料

    細(xì)菌:分離自苜蓿(Medicagosativa)、小麥、玉米(Zeamays)、三葉草(Trifoliumpretense)和高原早熟禾(Poaalpigena)根際(表1),由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院草地微生物實(shí)驗(yàn)室提供的19株細(xì)菌,菌株代號(hào)分別為JM170、JM92、LX191、G、JX59、LX22、LX81、LHS11-1、LM4-3、4N4、P2-1、PGRS-3、XX1、XX2、XX5、XX6、FX1、FX2-1和F1-4。

    植物病原真菌:黃瓜枯萎病菌(F.oxysporumf. sp.cucumerinum)和小麥根腐病菌(B.sorokiniana)。

    培養(yǎng)基:PDA (potato dextrose agar)[6]、LB (luria bertani)、PKO (pikovskaya)、King’s B和NFM (nitrogen-free medium)[7]。

    1.2方法

    1.2.1菌株溶磷性能測(cè)定點(diǎn)接菌株至PKO培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)7 d,觀察菌落周圍有無溶磷圈,測(cè)定菌落直徑與溶磷圈直徑,定性判斷菌株溶磷能力;制備菌株懸浮液(108cfu/mL),接種0.5 mL菌懸液于50 mL PKO液體培養(yǎng)基中,(28 ℃,160 r/min)培養(yǎng)10 d,在4 ℃下離心(10000 r/min) 15 min,用鉬藍(lán)比色法測(cè)上清液有效磷(P)含量,每菌株3次重復(fù)[7]。

    1.2.2菌株固氮酶活性測(cè)定在15 mL血清瓶中加入5 mL NFM半固體培養(yǎng)基,將菌株分別接于該培養(yǎng)基,以等量的無菌培養(yǎng)液為對(duì)照(CK)。28 ℃培養(yǎng)2 d后,用注射器從血清瓶中抽出1 mL氣體,同時(shí)又注入等量C2H2氣體,28 ℃培養(yǎng)2~3 d。然后用微量進(jìn)樣器從該瓶中抽取混合氣體50 μL注入氣相色譜儀(GC)的進(jìn)樣柱中,從顯示屏上觀察C2H2、C2H4峰面積。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上通過乙烯峰面積得到乙烯量,運(yùn)用外標(biāo)法計(jì)算固氮酶活性[7],每菌株3個(gè)重復(fù)。

    1.2.3菌株分泌IAA能力測(cè)定取30 mL在KB培養(yǎng)基上生長12 d的懸浮液,(4 ℃,10000 r/min)離心10 min,將上清液在冷凍干燥儀中干燥至10 mL,轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,pH調(diào)至2.8,加入20 mL乙酸乙酯,振蕩5 min,兩相分層后轉(zhuǎn)移乙酸乙酯層,下層溶液用20 mL乙酸乙酯再提取1次,合并乙酸乙酯層于50 mL磨口燒瓶中。在45 ℃水浴中加熱,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮,溶于0.6%冰乙酸中,然后定容2 mL,過0.45 μm有機(jī)系濾膜,供高效液相色譜儀測(cè)定[7]。

    1.2.4優(yōu)良拮抗菌初篩試驗(yàn)時(shí)間為2014年3-11月,采用平板對(duì)峙法測(cè)定細(xì)菌對(duì)病原真菌的拮抗作用[6]。將病原菌菌餅(直徑為6 mm)置于PDA培養(yǎng)基中心,在中心1.8 cm等距離四點(diǎn)接同一細(xì)菌(用加液槍將菌液垂直滴加在培養(yǎng)基平面上),25 ℃培養(yǎng),當(dāng)對(duì)照菌絲在半徑為45 mm培養(yǎng)基上長滿時(shí),測(cè)量真菌距細(xì)菌近端的半徑。每種組合3個(gè)重復(fù),試驗(yàn)重復(fù)3次。抑菌率=[(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑]×100%。并在顯微鏡下(10×40)觀察拮抗菌與真菌菌絲交界處的菌絲,了解拮抗菌對(duì)病原菌菌絲形態(tài)的影響。

    1.2.5優(yōu)良拮抗菌復(fù)篩將初篩得到的拮抗菌制備成無菌發(fā)酵液[8]進(jìn)行復(fù)篩。將無菌發(fā)酵液與45 ℃左右的PDA培養(yǎng)基按1∶9制成固體培養(yǎng)基,以不含無菌發(fā)酵液的(加同樣比例的無菌水)PDA平板為對(duì)照。在平板中央接病原菌菌餅,25 ℃培養(yǎng),當(dāng)對(duì)照菌絲在半徑為45 mm培養(yǎng)基上長滿時(shí),測(cè)量菌落直徑并計(jì)算抑菌率。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

    1.2.6優(yōu)良拮抗菌株鑒定對(duì)兩種病原真菌具有優(yōu)良抑制作用的菌株LX22、LHS11-1、LM4-3、XX1、XX5、XX6、FX2-1和F1-4進(jìn)行鑒定。菌株的形態(tài)特征觀察及生理生化測(cè)定參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[9]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[10]。

    16S rDNA序列分析:首先對(duì)菌株革蘭氏染色。然后提取菌株的總DNA。選用細(xì)菌通用引物1429R-27F,1429R:5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;27F:5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′;50 μL PCR反應(yīng)體系組成:25 μL預(yù)混酶(dNTP,Mg2+,PCR buffer,PCR酶),引物(10 μmol/L)各2 μL,模板2 μL (50 ng/μL),ddH2O 19 μL。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,循環(huán)30次,72 ℃再延伸10 min。擴(kuò)增后,取4 μL的樣品在1%的瓊脂糖凝膠上(80 V電壓)進(jìn)行電泳,并將檢測(cè)合格樣品送交測(cè)序(上海生工生物工程有限公司)。將序列在GenBank中進(jìn)行相似性分析,用ClustalX 1.8進(jìn)行多重序列比對(duì),用Mega 5.0中鄰接法進(jìn)行發(fā)育樹構(gòu)建,其中枝長代表分歧程度,各枝上的數(shù)字表示500次自舉(Bootstrap)重抽樣分析的支持百分比。

    1.3統(tǒng)計(jì)方法

    采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,采用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

    2 結(jié)果與分析

    2.1菌株促生特性

    19株細(xì)菌溶磷、固氮及分泌IAA能力見表1,菌株LM4-3固氮酶活性顯著好于其他菌株(P<0.05),達(dá)到244.88 nmol C2H4/(mL·h);菌株LHS11-1和LX191的溶磷能力顯著好于其他菌株(P<0.05),分別達(dá)到205.77和205.71 mg/L,兩者之間差異不顯著(P>0.05);菌株LX191分泌IAA能力顯著好于其他菌株(P<0.05),達(dá)到40.78 μg/mL。其中,菌株JM92、4N4、P2-1、JM170、LHS11-1和FX2-1兼具溶磷、固氮及分泌IAA特性。

    表1 菌株促生特性

    注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示經(jīng)Duncan氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05)?!?”表示促生特性微弱,“*”待鑒定。下同。

    Note:Values in the Table are mean±SD. Values followed by different lowercase letters in the same column are significantly different atP<0.05 level by Duncan’s new multiple range test. “-” indicates weak growth promoting properties, “*”not identified. The same below.

    2.2優(yōu)良拮抗菌初篩

    2.2.1菌株與黃瓜枯萎病菌拮抗培養(yǎng)4 d后,19株細(xì)菌中5株對(duì)黃瓜枯萎病菌具有抑制作用,菌株LHS11-1和FX2-1的抑菌活性較好,抑制率均大于40% (表2),和其他3株相比,抑菌能力極顯著(P<0.01)。5株拮抗菌隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加,抑制率均提高。培養(yǎng)9 d后,F(xiàn)X2-1具有較好的抑菌活性,抑制率達(dá)到69.07%。LHS11-1和FX2-1能夠明顯抑制病原菌菌絲的生長(圖1A2),抑菌能力極顯著(P<0.01)。培養(yǎng)10 d后,對(duì)照菌落在平板上長滿(圖1A1)。

    2.2.2菌株與小麥根腐病菌拮抗在培養(yǎng)3 d后,19株細(xì)菌中7株對(duì)小麥根腐病菌具有抑制作用,F(xiàn)X2-1的抑菌活性較好,抑制率大于60% (表2),抑菌能力極顯著(P<0.01)。在培養(yǎng)7 d后,F(xiàn)X2-1和LHS11-1對(duì)小麥根腐病菌的抑制率達(dá)到70%以上。FX2-1具有較好的抑菌活性,抑菌能力極顯著高于其他6株拮抗菌(P<0.01)。FX2-1和LHS11-1不僅表現(xiàn)出較好的抑菌能力,拮抗菌菌株自身還可以形成較大的菌落(圖1B2)。培養(yǎng)8 d后,對(duì)照菌落在平板上長滿(圖1B1)。

    2.3優(yōu)良拮抗菌復(fù)篩

    2.3.1菌株發(fā)酵液與黃瓜枯萎病菌拮抗培養(yǎng)4 d后,LHS11-1和FX2-1發(fā)酵液對(duì)黃瓜枯萎病菌的抑制率均達(dá)17.54%(表3),但兩者之間差異不顯著(P>0.01)。培養(yǎng)9 d后,F(xiàn)X2-1發(fā)酵液抑菌能力較好,抑制率為51.73%,相比其他4種菌差異極顯著(P<0.01)。

    表2 菌株對(duì)兩種病原真菌拮抗作用

    注:同列不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01),不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

    Note:Different capital letters mean significant differences atP<0.01; different small letters mean significant differences atP<0.05. The same below.

    圖1 拮抗菌與兩種真菌病原平板對(duì)峙(部分)Fig.1 The panel confrontation of bio-control strains and two fungous pathogens (part) A:黃瓜枯萎病菌;B:小麥根腐病菌。3~4為光鏡照片,放大倍數(shù)為10×40。A1:對(duì)照;A2:菌株LHS11-1處理;A3:對(duì)照,正常菌絲;A4:菌株LHS11-1處理,菌絲彎曲,分枝增多;B1:對(duì)照;B2:菌株FX2-1處理;B3:對(duì)照,正常菌絲;B4:菌株FX2-1處理,菌絲分枝增多,內(nèi)陷。A: F. oxysporum f. sp. cucumerinum; B: B. sorokiniana. 3-4 are micrographs made by optical microscope at a magnification of 10×40. A1: CK; A2: Strain LHS11-1 treatment; A3: CK, normal mycelium; A4: Strain LHS11-1 treatment, the bending mycelium, increased branches; B1: CK; B2: Strain FX2-1 treatment; B3: CK, normal mycelium; B4: Strain FX2-1 treatment, increased and retracted mycelium branches.

    2.3.2菌株發(fā)酵液與小麥根腐病菌拮抗在培養(yǎng)3 d后,LHS11-1和FX2-1的發(fā)酵液對(duì)小麥根腐病菌有抑制作用,抑制率分別為72.87%和55.81%(表3)。其他細(xì)菌的發(fā)酵液對(duì)小麥根腐病菌幾乎沒有抑制作用。在培養(yǎng)7 d后,LHS11-1的發(fā)酵液抑菌能力較強(qiáng),抑制率達(dá)到81.52%,和其他6種細(xì)菌相比,抑制率差異極顯著(P<0.01)。LM4-3、XX6和LX22抑菌作用微弱。

    2.4拮抗菌對(duì)病原菌菌絲生長影響

    2.4.1拮抗菌對(duì)黃瓜枯萎病菌菌絲生長抑制作用LHS11-1使黃瓜枯萎病菌菌絲分枝增多,扭曲變形,內(nèi)容物質(zhì)減少(圖1A4)。菌株FX2-1使菌絲發(fā)生內(nèi)陷,細(xì)胞內(nèi)含物質(zhì)減少。菌株LM4-3、菌株XX1和F1-4使菌絲內(nèi)容物減少。對(duì)照呈均勻絲狀,內(nèi)含物質(zhì)較多(圖1A3)。

    2.4.2拮抗菌對(duì)小麥根腐病菌菌絲生長抑制作用LHS11-1、LM4-3、XX1、XX6、FX2-1和LX22使小麥根腐病菌的菌絲變粗,發(fā)生不同程度的彎曲變形(圖1B4)。菌株XX5使菌絲分枝增多,內(nèi)陷呈枯萎狀,細(xì)胞內(nèi)含物質(zhì)減少。對(duì)照菌絲呈均勻絲狀,直角分支(圖1B3)。

    表3 菌株發(fā)酵液對(duì)兩種病原真菌拮抗及抑制率

    2.5優(yōu)良拮抗菌株鑒定

    2.5.1菌株形態(tài)特征與生理生化特性8株優(yōu)良拮抗菌中,XX5為革蘭氏陰性菌,其余均為革蘭氏陽性菌,所有菌株生長速度較快。根據(jù)其生理生化特性(表4),參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[9]、《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[10]以及參考文獻(xiàn)[11-12]中的參考菌株,初步確定LHS11-1和FX2-1為枯草芽孢桿菌(B.subtilis),XX1為蠟樣芽孢桿菌(B.cereus),LX22、LM4-3和F1-4為短小芽孢桿菌(B.pumilus),XX6為簡(jiǎn)單芽孢桿菌(B.simplex),XX5為熒光假單胞桿菌(P.fluorescens)。

    表4 菌株生理生化特性

    +:菌株反應(yīng)陽性;-:菌株反應(yīng)陰性;NT:沒有測(cè)定。+: Strains were positive; -: Strains were negative; NT: No determination.

    2.5.216S rDNA序列分析8株細(xì)菌PCR產(chǎn)物電泳圖如圖2,所有菌株的16S rDNA序列全長在1500~2000 bp之間。經(jīng)Blast相似性分析,選取20個(gè)典型菌株的16S rDNA序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,結(jié)果如圖3。綜合以上形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)結(jié)果,確定LHS11-1和FX2-1為枯草芽孢桿菌(B.subtilis)(序列登錄號(hào)分別為:KR811366和KR811367),XX1為蠟樣芽孢桿菌(B.cereus) (登錄號(hào):KR811368);LM4-3、F1-4和LX22為短小芽孢桿菌(B.pumilus) (登錄號(hào)分別為:KR811370、KR811372和KR811374);XX6為簡(jiǎn)單芽孢桿菌(B.simplex) (登錄號(hào):KR811373);XX5為熒光假單胞桿菌(P.fluorescens) (登錄號(hào):KR811375)。

    圖2 菌株16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳Fig.2 Electrophoresis of PCR amplification 16S rDNA of tested strains   M: DL2000; 1: 菌株Strain LHS11-1; 2: 菌株Strain LM4-3; 3: 菌株Strain F1-4; 4: 菌株Strain XX6; 5: 菌株Strain LX22; 6: 菌株Strain XX5; 7: 菌株Strain FX2-1; 8: 菌株Strain XX1.

    圖3 菌株16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of tested strains based on 16S rDNA sequences

    3 討論

    3.1菌株促生特性

    通過測(cè)定19株細(xì)菌的促生特性,發(fā)現(xiàn)具有溶磷能力的菌株13株,具有固氮酶活性的菌株14株,能夠分泌生長素的菌株10株。兼具3種促生特性的菌株6株,分別是菌株JM92、4N4、P2-1、JM170、LHS11-1和FX2-1。 分離自高原早熟禾的菌株P(guān)GRS-3分泌IAA能力較好,達(dá)到40.78 μg/mL。連翠飛等[13]研究發(fā)現(xiàn)菌株CX-5-2培養(yǎng)120 h產(chǎn)IAA能力較好,達(dá)到1.19 μg/mL,但是赤霉素含量達(dá)到108.63 μg/mL;分離自苜蓿的菌株LM4-3固氮酶活性較好,達(dá)到244.88 nmol C2H4/(mL·h)。王秀呈等[14]分離獲得48株內(nèi)生菌,其中HerbaspirillumseropedicaeDX35固氮酶活性最高,為181.21 nmol C2H4/(mL·h)。14株細(xì)菌固氮酶活性差別較大,這可能與采集地點(diǎn)土壤狀況、植物種類不同有關(guān);鉬藍(lán)比色法定量測(cè)定菌株的溶磷能力,溶磷圈與菌落直徑大小的比值(D/d)隨著時(shí)間變化而變化,大多數(shù)溶磷菌株的D/d值在第10天時(shí)處于穩(wěn)定狀態(tài)[15],Chen等[16]發(fā)現(xiàn)這與培養(yǎng)基中的磷酸鈣和蛋黃卵磷脂含量有關(guān)。本研究中溶磷能力較強(qiáng)為分離自紅三葉草的菌株LHS11-1,溶磷量達(dá)到205.77 μg/mL。顧杰等[17]研究發(fā)現(xiàn)3株菌的溶磷能力為41.63,37.76和39.78 μg/mL。由此可見本研究中的菌株促生特性明顯好于其他學(xué)者研究的菌株,均為PGPR菌,但這些菌株對(duì)植物的促生效果有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

    3.2菌株對(duì)兩種病害病原抑制作用

    近年來,農(nóng)作物復(fù)種指數(shù)及種植密度持續(xù)增加,使土壤養(yǎng)分嚴(yán)重失衡,導(dǎo)致植物病害發(fā)生嚴(yán)重,使農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的經(jīng)濟(jì)損失每年達(dá)40%~60%,嚴(yán)重地塊可達(dá)80%以上[18]。利用生物防治已成為學(xué)者們的研究重點(diǎn)[19]。卜春亞等[20]從黃瓜根際篩選得到的拮抗菌j-28對(duì)黃瓜枯萎病菌的抑菌帶達(dá)到11.0 mm,具有較強(qiáng)的抑制作用,并且拮抗菌j-28有較廣的抑菌譜,對(duì)黃瓜灰霉病菌、馬鈴薯干腐病菌和茄子黃萎病菌等均具有很強(qiáng)的拮抗作用。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)拮抗菌LHS11-1和FX2-1拮抗效果明顯,對(duì)黃瓜枯萎病菌的抑制率分別達(dá)到67.38%和69.07%,對(duì)小麥根腐病菌的抑制率分別達(dá)到71.03%和78.17%。因此,對(duì)菌株LHS11-1和FX2-1是否具有較廣譜的抑菌性有待進(jìn)一步研究。

    拮抗菌防治植物病害的作用機(jī)制主要有營養(yǎng)和空間位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)、分泌抗菌物質(zhì)、寄生和誘導(dǎo)植物體抗性等。研究發(fā)現(xiàn)PGPR在植物幼根表面定殖時(shí)能夠形成一層均勻的保護(hù)層,保護(hù)了病原菌的侵染位點(diǎn),減低了侵染機(jī)會(huì)[21]。并且通過產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、溶菌酶、木聚糖酶和胞外殼聚糖酶等對(duì)土壤中的大分子物質(zhì)進(jìn)行降解,在給植物提供營養(yǎng)的同時(shí)減少植物病害的發(fā)生[22]。趙帥等[23]研究發(fā)現(xiàn)HD-087產(chǎn)抗菌物質(zhì)能造成黃瓜枯萎病病原菌菌絲畸形、分生孢子萌發(fā)受抑制,5倍發(fā)酵稀釋液對(duì)孢子萌發(fā)的抑制率達(dá)72.1%。Chen等[24]研究表明,B.subtilisB579無菌培養(yǎng)液導(dǎo)致黃瓜枯萎病菌菌絲畸形,抑制孢子萌發(fā),B579培養(yǎng)液灌根接種防治效果可達(dá)73.6%。本研究主要從拮抗菌分泌抗菌物質(zhì)及其對(duì)真菌菌絲形態(tài)的影響角度對(duì)拮抗菌抑菌機(jī)理進(jìn)行初步探索,對(duì)菌株后續(xù)的研究有一定的參考價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)拮抗菌LHS11-1和FX2-1發(fā)酵液對(duì)兩種病害均有一定的抑制作用,對(duì)黃瓜枯萎病菌的抑制率分別為45.69%和51.73%,對(duì)小麥根腐病菌的抑制率分別達(dá)到81.52%和67.67%。拮抗菌發(fā)酵液對(duì)黃瓜枯萎病的抑制率較活菌的抑制率降低,可能是活菌抑制由空間位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)和抗菌物質(zhì)等共同起作用。對(duì)小麥根腐病菌的抑制率較活菌的抑制率提高,可能是主要通過次生代謝產(chǎn)物起抑制作用。利用光學(xué)顯微鏡對(duì)拮抗菌抑菌機(jī)理的初步研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)兩種土傳病害病原菌菌絲具有顯著的致畸作用,可以使菌絲發(fā)生不同程度的膨大變形,使菌絲內(nèi)容物釋放,最終導(dǎo)致病原菌的細(xì)胞壁破裂,菌絲斷裂,病原菌消亡??赡苁沁@種畸變作用造成了病原菌菌絲失活,影響了病原菌的生長。對(duì)其是否存在其他的拮抗機(jī)制有待于進(jìn)一步的探索研究。

    3.3優(yōu)良拮抗菌株鑒定

    16S rDNA序列分析是微生物分類學(xué)中重要的方法,通過16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)序列比較分析,可快速準(zhǔn)確地對(duì)微生物進(jìn)行鑒定分類。本試驗(yàn)對(duì)8株優(yōu)良拮抗菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征初步鑒定,再利用16S rDNA基因測(cè)序確定LHS11-1和FX2-1為枯草芽孢桿菌(B.subtilis),LM4-3、F1-4和LX22為短小芽孢桿菌(B.pumilus);XX6為簡(jiǎn)單芽孢桿菌(B.simplex);XX1為蠟樣芽孢桿菌(B.cereus);XX5為熒光假單胞桿菌(P.fluorescens)。國內(nèi)外大量學(xué)者發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬和假單胞菌屬能夠很好地定殖于植物根部,既能促進(jìn)植物根系生長也能防治一些病害的發(fā)生,如Smith等[25]發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌(B.cereus) UW85能夠定殖于植物根際,并證實(shí)了其抑制病害細(xì)菌與植物間的相互關(guān)系。Ryu等[26]發(fā)現(xiàn)B.subtilisGB03誘導(dǎo)擬南芥對(duì)鹽害的忍耐力,并且該菌株產(chǎn)生的一些揮發(fā)性有機(jī)物是促使其產(chǎn)生誘導(dǎo)體系忍耐力的決定性物質(zhì)。

    References:

    [1]Huang Y, Zhang Z Y, Huang L L,etal. Opinions on definition, analysis of advantages and disadvantages and integrated management of plant diseases. Plant Protection, 2009, 35(1): 97-101.

    [2]Lan J L, Su M X, Ge C B,etal. Relativity between the distribution ofFusariumoxysporumand the course of disease of wilt disease of watermelon. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2007, 23(1): 302-305.

    [3]Zhao S, Du C M, Tian C Y. Current advances in integrated management of cucumber fusarium wilt. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2014, 30(7): 254-259.

    [4]Hou S Y, Zhang G. Study on the losses of wheat yield and the ELT to wheat root rot. Journal of Northwest Sci-tech University of Agriculture and Forestry, 2002, 30(1): 76-78.

    [5]Sun G Z, Yao T, Zhao G Q,etal. Research progress and prospect ofPseudomonasfluorescensin controlling plant diseases. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(4): 174-190.

    [6]Rong L Y, Yao T, Zhao G Q,etal. Screening of siderophore-producing PGPR bacteria and their antagonism against the pathogens. Plant Protection, 2011, 37(1): 59-64.

    [7]Hafeez F Y, Malik K A. Manual on Biofertilizer Technology[M]. Pakistan: Nibge, 2000: 132-135.

    [8]Chen T C, Lin X H, Li J,etal. Isolation, identification of a bacterium isolate An-ctc-y-1 and its antagonism for plant pathogenic fungus. Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica, 2011, 20(7): 41-45.

    [9]Buchanan R E, Bergey D H. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 8th Chinese edn[M]. Beijing: Chinese Science Press, 1984.

    [10]Dong X Z, Cai M Y. Common Bacterial System Identification Manual[M]. Beijing: Chinese Science Press, 2002: 162-166.

    [11]Xue D, Huang X D, Jin C X. Highly efficient bioflocculant produced byBacillussimplex. Techniques and Equipment for Environmental Pollution Control, 2012, 6(8): 2897-2902.

    [12]Wang C X, Wang D B, Zhou Q. Classification and identification of the plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) in cotton. Journal of Huazhong Agricultural University, 1997, 16(1): 29-32.

    [13]Lian C F, Li S Z, Chao C Y,etal. Selection, identification and characterization of antagonistic and phytohormone producing bacterial strain CX-5-2. Acta Phytopathologica Sinica, 2007, 37(2): 197-203.

    [14]Wang X C, Cao Y H, Tang X,etal. Rice endogenous nitrogen fixing and growth promoting bacteriumHerbaspirillumseropedicaeDX35. Acta Microbiologica Sinica, 2014, 54(3): 292-298.

    [15]Ma W W. Screening Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) from Rhizosphere of Grasses and Establishing their Database Management System[D]. Lanzhou: Gansu Agricultural University, 2014.

    [16]Chen Y P, Rekha P D, Arun A B,etal. Phosphate solubilizing bacteria from subtropical soil and their tricalcium phosphate solubilizing abilities. Applied Soil Ecology, 2006, 34: 33-41.

    [17]Gu J, Meng L Y, Sun L N,etal. Mechanisms of plant growth promotion ofAzotobacterspp. of rice PGPR on rice seedling. Journal of Anhui Agricultural University, 2012, 39(3): 426-429.

    [18]Yang X R, Wang X L, Wang M,etal. Inhabiting activity of bio-bacteria B579 to soil-brone disease and its promotion growth effects. Chinese Journal of Biological Control, 2008, 24(Suppl.): 59-61.

    [19]Li X L, Li Y Z. Research advances in biological control of soil-borne disease. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(3): 204-212.

    [20]Bu C Y, Jia Y Q, Wang Y N,etal. Oriented screening antagonisticBacillusagainstFusariumoxysporiumf. sp.cucumarinumowen and analysis of character of its antifungal agents. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2013, 29(31): 101-107.

    [21]Barahona E, Navazo A, Martínez-Granero F,etal.PseudomonasfluorescensF113 mutant with enhanced competitive colonization ability and improved biocontrol activity against fungal root pathogens. Applied and Environmental Microbiology, 2011, 77(15): 5412-5419.

    [22]Li J, An D R, Li A R,etal. Isolation, purification, and structural characterization of antibiotic substance fromPseudomonasfluorescensAbIII745-6. Journal of Microbiology, 2008, 28(2): 11-14.

    [23]Zhao S, Tian C Y, Shi Y W,etal. Fermentation conditions for the biocontrol strain HD-087 against cucumberFusariumwiltand it’s antibacterial effect. Microbiology China, 2013, 40(5): 802-811.

    [24]Chen F, Wang M, Zheng Y,etal. Quantitative changes of plant defense enzymes and phytohormone in biocontrol of cucumberFusariumwiltbyBacillussubtilisB579. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2010, 26(4): 675-684.

    [25]Smith C B, Anderson J E, Fischer R L,etal. Stability of green fluorescent protein using luminescence spectroscopy: is GFP applicable to field analysis of contaminants. Environmental Pollution, 2002, 120(3): 517-520.

    [26]Ryu C M, Farag M A, Hu C H,etal. Bacterial volatiles induce systemic resistance inArabidopsis. Plant Physiology, 2004, 134: 1017-1026.

    [1]黃云, 張中義, 黃麗麗, 等. 植物病害的定義芻議、利弊分析及綜合控制. 植物保護(hù), 2009, 35(1): 97-101.

    [2]藍(lán)江林, 蘇明星, 葛慈斌, 等. 尖孢鐮刀菌的分布與西瓜枯萎病病程的相關(guān)性. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào), 2007, 23(1): 302-305.

    [3]趙帥, 杜春梅, 田長彥. 黃瓜枯萎病綜合防治研究進(jìn)展. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào), 2014, 30(7): 254-259.

    [4]侯生英, 張貴. 小麥根腐病產(chǎn)量損失及經(jīng)濟(jì)閾值研究. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2002, 30(1): 76-78.

    [5]孫廣正, 姚拓, 趙桂琴, 等. 熒光假單胞菌防治植物病害研究現(xiàn)狀與展望. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 24(4): 174-190.

    [6]榮良燕, 姚拓, 趙桂琴, 等. 產(chǎn)鐵載體PGPR菌篩選及其對(duì)病原菌的拮抗作用. 植物保護(hù), 2011, 37(1): 59-64.

    [8]陳太春, 林星華, 李晶, 等. 1株An-ctc-y-1細(xì)菌分離物的鑒定及其對(duì)植物病原真菌的作用.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2011, 20(7): 41-45.

    [10]東秀珠, 蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2002: 162-166.

    [11]薛冬, 黃向東, 靳朝喜. 簡(jiǎn)單芽孢桿菌產(chǎn)高效微生物絮凝劑. 環(huán)境工程學(xué)報(bào), 2012, 6(8): 2897-2902.

    [12]王春霞, 王道本, 周啟. 棉花根際促生菌篩選菌株的分類鑒定. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 1997, 16(1): 29-32.

    [13]連翠飛, 李社增, 晁春燕, 等. 產(chǎn)植物激素拮抗細(xì)菌CX-5-2的篩選, 鑒定及其特性研究. 植物病理學(xué)報(bào), 2007, 37(2): 197-203.

    [14]王秀呈, 曹艷花, 唐雪, 等. 水稻內(nèi)生固氮菌HerbaspirillumseropedicaeDX35的篩選及其促生特性. 微生物學(xué)報(bào), 2014, 54(3): 292-298.

    [15]馬文文. 禾草根際促生菌資源篩選及其數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)構(gòu)建[D]. 蘭州: 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014.

    [17]顧杰, 孟麗媛, 孫樂妮, 等. 水稻根際固氮菌促生特性評(píng)價(jià). 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 39(3): 426-429.

    [18]楊秀榮, 王雪蓮, 王敏, 等. 拮抗細(xì)菌B579對(duì)土傳病害的防治效果及促長作用. 中國生物防治, 2008, 24(增刊): 59-61.

    [19]李興龍, 李彥忠. 土傳病害生物防治研究進(jìn)展. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 24(3): 204-212.

    [20]卜春亞, 賈玉琦, 王有年, 等. 黃瓜枯萎病拮抗芽孢桿菌的定向篩選及其抑菌活性物質(zhì)特性分析. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào), 2013, 29(31): 101-107.

    [23]趙帥, 田長彥, 史應(yīng)武, 等. 黃瓜枯萎病拮抗菌HD-087產(chǎn)抗菌物質(zhì)條件的優(yōu)化及抑菌作用初探. 微生物學(xué)通報(bào), 2013, 40(5): 802-811.

    An assessment of the level of control of two fungal pathogens by various plant growth promoting rhizobacteria

    SUN Guang-Zheng, YAO Tuo*, ZHAO Gui-Qin, LI Jian-Hong, CHEN Long, LIU Huan

    CollegeofPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity,KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,MinistryofEducation,PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince,Sino-U.S.CentersforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China

    The capacity for dissolved phosphorus absorption, the nitrogenase activity and the secretion of auxin of 19 strains of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) acquired from five plant species were tested by molybdenum blue colorimetry, acetylene reduction assay and high performance liquid chromatography, respectively. All 19 strains were tested for ability to antagonize the fungiFusariumoxysporumf. sp.cucumerinumandBipolarissorokiniana, using the panel confrontation method. Strains with antagonistic ability were identified at morphological, physiological biochemical, and molecular levels. It was found thatBacillussubtilisstrain LM4-3 had stronger nitrogenase activity than other tested strains and reached 244.88 nmol C2H4/(mL·h), whileB.subtilisstrain LHS11-1 had the highest dissolved phosphorus absorption capacity (205.77 mg/L), and the strain PGRS-3 had the greatest secretion of auxin, reaching 40.78 μg/mL in the culture medium. Five bacterial strains were found to have antagonistic activity againstF.oxysporumf. sp.cucumerinum, withB.subtilisstrain FX2-1 providing up to 69.07% suppression. and 51.73% of its fermentation solution. Seven bacterial strains could efficiently antagonizeB.sorokiniana, withB.subtilisstrain FX2-1 achieving 78.17%, the fermentation solution ofB.subtilisLHS11-1 rinsed up to 81.52%. Other bacterial species found to have plant growth promoting or to be antagonistic towards the above two pathogenic fungal species includedBacilluscereus,Bacilluspumilus,BacillussimplexandPseudomonasfluorescens.

    plant growth promoting rhizobacteria (PGPR); growth characteristics;Fusariumoxysporumf. sp.cucumerinum;Bipolarissorokiniana; antimicrobial activity; identification

    10.11686/cyxb2015353http://cyxb.lzu.edu.cn

    孫廣正, 姚拓, 趙桂琴, 李建宏, 陳龍, 劉歡. 植物根際促生菌對(duì)兩種真菌病害病原的抑制作用及其鑒定. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 25(8): 154-163.

    SUN Guang-Zheng, YAO Tuo, ZHAO Gui-Qin, LI Jian-Hong, CHEN Long, LIU Huan. An assessment of the level of control of two fungal pathogens by various plant growth promoting rhizobacteria. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(8): 154-163.

    2015-07-15;改回日期:2015-10-21

    國家自然基金(31360584)和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-08-C)資助。

    孫廣正(1988-),男,甘肅慶陽人,在讀碩士。E-mail: sunfanfan885@163.com

    Corresponding author. E-mail: yaotuo@gsau.edu.cn

    猜你喜歡
    根腐病發(fā)酵液抑制率
    中藥單體對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用
    番茄萎蔫膨果慢 當(dāng)心根腐病
    茴香根腐病 防治有辦法
    血栓彈力圖評(píng)估PCI后氯吡格雷不敏感患者抗血小板藥物的療效
    飼用南瓜根腐病的發(fā)生原因及防治措施
    連翹內(nèi)生真菌的分離鑒定及其發(fā)酵液抑菌活性和HPLC測(cè)定
    日本莢蒾葉片中乙酰膽堿酯酶抑制物的提取工藝優(yōu)化*
    桑黃纖孔菌發(fā)酵液化學(xué)成分的研究
    中成藥(2018年1期)2018-02-02 07:20:03
    番茄根腐病的發(fā)生與防治
    上海蔬菜(2016年5期)2016-02-28 13:18:10
    鹽度變化對(duì)生物發(fā)光細(xì)菌的毒性抑制作用研究
    国产成人a∨麻豆精品| 人妻一区二区av| 欧美日韩黄片免| netflix在线观看网站| 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲免费av在线视频| 18在线观看网站| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲国产日韩一区二区| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 久久久精品区二区三区| 欧美人与性动交α欧美软件| 国产成人精品久久二区二区免费| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 免费在线观看黄色视频的| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 99精国产麻豆久久婷婷| 成年人免费黄色播放视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 美女视频免费永久观看网站| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 中文字幕人妻熟女乱码| 国产成人影院久久av| 欧美日韩综合久久久久久| 精品视频人人做人人爽| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 久热爱精品视频在线9| 91精品国产国语对白视频| 精品一区二区三区av网在线观看 | 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产日韩欧美在线精品| 久久久久久久国产电影| 五月天丁香电影| 国产1区2区3区精品| 国产精品一区二区在线不卡| 亚洲免费av在线视频| 人人妻人人澡人人看| av网站免费在线观看视频| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产欧美亚洲国产| 精品人妻在线不人妻| 无遮挡黄片免费观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲精品国产区一区二| 秋霞在线观看毛片| 一级黄色大片毛片| 99九九在线精品视频| 日日爽夜夜爽网站| 久久ye,这里只有精品| av又黄又爽大尺度在线免费看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 色网站视频免费| 亚洲,欧美精品.| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲伊人色综图| 亚洲国产成人一精品久久久| 韩国高清视频一区二区三区| 成年人午夜在线观看视频| 亚洲成人手机| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 各种免费的搞黄视频| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产成人免费观看mmmm| 母亲3免费完整高清在线观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产不卡av网站在线观看| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产午夜精品一二区理论片| 少妇精品久久久久久久| 日本欧美视频一区| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 在线观看www视频免费| 美女视频免费永久观看网站| 啦啦啦啦在线视频资源| 欧美成人午夜精品| 秋霞在线观看毛片| 飞空精品影院首页| 一级黄片播放器| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 男人爽女人下面视频在线观看| 搡老岳熟女国产| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲精品国产区一区二| 热re99久久精品国产66热6| 久久久久久免费高清国产稀缺| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 美女国产高潮福利片在线看| 国产精品久久久久成人av| 91九色精品人成在线观看| 亚洲av片天天在线观看| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 欧美中文综合在线视频| 操出白浆在线播放| 观看av在线不卡| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 一区二区av电影网| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产极品粉嫩免费观看在线| 精品人妻在线不人妻| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | av不卡在线播放| 欧美乱码精品一区二区三区| 久久精品国产综合久久久| 人妻人人澡人人爽人人| 国精品久久久久久国模美| 国产亚洲欧美精品永久| 国产男人的电影天堂91| 大码成人一级视频| 成年女人毛片免费观看观看9 | 久久中文字幕一级| 国产成人精品久久久久久| 伊人亚洲综合成人网| 永久免费av网站大全| 男女下面插进去视频免费观看| 满18在线观看网站| 99国产综合亚洲精品| 国产高清不卡午夜福利| 国产男女超爽视频在线观看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产精品.久久久| videosex国产| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲人成77777在线视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 欧美激情极品国产一区二区三区| 欧美日韩精品网址| a级毛片在线看网站| 男女之事视频高清在线观看 | 国产女主播在线喷水免费视频网站| 美女大奶头黄色视频| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产成人影院久久av| 香蕉国产在线看| 国产高清不卡午夜福利| 免费观看人在逋| 天天添夜夜摸| 免费观看人在逋| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 日日摸夜夜添夜夜爱| 久久国产精品人妻蜜桃| 91老司机精品| 欧美久久黑人一区二区| 日日爽夜夜爽网站| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 9热在线视频观看99| 女性被躁到高潮视频| 欧美精品亚洲一区二区| 久久久久国产精品人妻一区二区| 在现免费观看毛片| 一区二区三区乱码不卡18| 中文字幕精品免费在线观看视频| 欧美性长视频在线观看| 韩国高清视频一区二区三区| 成人国产一区最新在线观看 | 只有这里有精品99| 久久性视频一级片| 啦啦啦在线免费观看视频4| 69精品国产乱码久久久| 午夜老司机福利片| 亚洲国产av新网站| 日本vs欧美在线观看视频| 各种免费的搞黄视频| 国产精品一区二区免费欧美 | 久久久久国产一级毛片高清牌| 啦啦啦在线观看免费高清www| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 久久精品国产综合久久久| 日韩 亚洲 欧美在线| 少妇粗大呻吟视频| 18禁观看日本| 成年动漫av网址| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲第一青青草原| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 满18在线观看网站| 十八禁人妻一区二区| 黄色片一级片一级黄色片| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 午夜免费鲁丝| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲欧美激情在线| 91成人精品电影| 一区二区日韩欧美中文字幕| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 在线看a的网站| 成年人黄色毛片网站| 亚洲欧洲国产日韩| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 欧美久久黑人一区二区| 一本综合久久免费| 又紧又爽又黄一区二区| 美女视频免费永久观看网站| 国产主播在线观看一区二区 | 亚洲国产av影院在线观看| 青青草视频在线视频观看| 亚洲情色 制服丝袜| 久久精品国产综合久久久| 午夜两性在线视频| 亚洲少妇的诱惑av| 国产午夜精品一二区理论片| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 99久久人妻综合| 国产又爽黄色视频| 亚洲,欧美,日韩| 丝袜美腿诱惑在线| 男女免费视频国产| 亚洲人成电影观看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 午夜久久久在线观看| 久久精品久久精品一区二区三区| 亚洲精品国产av成人精品| 女性被躁到高潮视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 男女午夜视频在线观看| 一区福利在线观看| 国产一区二区三区综合在线观看| 成年美女黄网站色视频大全免费| 欧美日韩视频精品一区| 国产精品免费大片| 亚洲 欧美一区二区三区| a级毛片黄视频| 国产精品久久久久久精品古装| 婷婷色av中文字幕| 日韩精品免费视频一区二区三区| 欧美黄色片欧美黄色片| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 在线观看免费日韩欧美大片| 首页视频小说图片口味搜索 | 国产日韩欧美在线精品| 国产成人一区二区在线| 欧美精品av麻豆av| 午夜久久久在线观看| 亚洲成人手机| 又紧又爽又黄一区二区| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 乱人伦中国视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 90打野战视频偷拍视频| 日韩av在线免费看完整版不卡| 美女主播在线视频| www.精华液| 又黄又粗又硬又大视频| 国产成人欧美| 国产欧美日韩一区二区三 | 欧美日韩黄片免| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 国产三级黄色录像| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲av电影在线进入| 久久99一区二区三区| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 中国美女看黄片| 免费高清在线观看视频在线观看| 人成视频在线观看免费观看| 免费不卡黄色视频| 精品少妇久久久久久888优播| 下体分泌物呈黄色| 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲精品一二三| 久久精品久久久久久久性| 国产日韩欧美亚洲二区| 1024香蕉在线观看| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 中国美女看黄片| 成人国语在线视频| 一级毛片女人18水好多 | 一区福利在线观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| av在线播放精品| 亚洲av综合色区一区| 在线天堂中文资源库| 1024视频免费在线观看| 夫妻午夜视频| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产成人一区二区在线| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 99热网站在线观看| 91精品国产国语对白视频| 少妇 在线观看| 国产免费又黄又爽又色| 久久人妻福利社区极品人妻图片 | 热99国产精品久久久久久7| 嫩草影视91久久| 高清视频免费观看一区二区| 久久久久久久久久久久大奶| 国产精品亚洲av一区麻豆| 丝袜美足系列| 中文字幕制服av| 人妻一区二区av| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产免费一区二区三区四区乱码| www.自偷自拍.com| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲伊人久久精品综合| av国产久精品久网站免费入址| 欧美亚洲日本最大视频资源| 免费在线观看完整版高清| 天天操日日干夜夜撸| 一本色道久久久久久精品综合| 看免费av毛片| 日韩一区二区三区影片| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 只有这里有精品99| 精品欧美一区二区三区在线| 免费日韩欧美在线观看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲中文av在线| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 五月天丁香电影| 精品一区二区三卡| 天堂中文最新版在线下载| 国产麻豆69| 色播在线永久视频| 在线观看www视频免费| 男女午夜视频在线观看| 九草在线视频观看| av线在线观看网站| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 老鸭窝网址在线观看| 午夜久久久在线观看| netflix在线观看网站| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 高清视频免费观看一区二区| 国产精品 国内视频| 性少妇av在线| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产精品国产三级国产专区5o| 久久精品国产a三级三级三级| 亚洲久久久国产精品| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 婷婷色麻豆天堂久久| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 操美女的视频在线观看| 国产成人精品久久二区二区免费| 亚洲精品国产av蜜桃| 黄片小视频在线播放| 亚洲欧美精品自产自拍| 成人国产av品久久久| 麻豆av在线久日| 精品久久蜜臀av无| 多毛熟女@视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 久久毛片免费看一区二区三区| 一二三四社区在线视频社区8| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 亚洲av在线观看美女高潮| 成年人免费黄色播放视频| 又大又黄又爽视频免费| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 午夜福利一区二区在线看| 国产免费福利视频在线观看| 日韩av免费高清视频| 热99国产精品久久久久久7| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 免费观看人在逋| 在线av久久热| 精品福利观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产又色又爽无遮挡免| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 男女午夜视频在线观看| 90打野战视频偷拍视频| 桃花免费在线播放| 老司机影院成人| 一区二区日韩欧美中文字幕| 国产色视频综合| 亚洲av片天天在线观看| 男女午夜视频在线观看| 精品免费久久久久久久清纯 | 免费观看a级毛片全部| 久久国产亚洲av麻豆专区| 欧美成人精品欧美一级黄| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 女人精品久久久久毛片| 一区二区三区乱码不卡18| 美女中出高潮动态图| 国产精品偷伦视频观看了| 欧美大码av| 麻豆乱淫一区二区| 考比视频在线观看| 精品国产乱码久久久久久男人| 免费高清在线观看视频在线观看| 欧美少妇被猛烈插入视频| 久久ye,这里只有精品| 亚洲精品国产区一区二| 99re6热这里在线精品视频| 少妇人妻久久综合中文| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 国产日韩欧美亚洲二区| 人成视频在线观看免费观看| 国产成人一区二区三区免费视频网站 | 99国产综合亚洲精品| 操美女的视频在线观看| 中文字幕av电影在线播放| 欧美成人精品欧美一级黄| 久久中文字幕一级| 777米奇影视久久| 精品少妇久久久久久888优播| 久久久久国产精品人妻一区二区| h视频一区二区三区| 一区二区三区精品91| 男女边吃奶边做爰视频| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产又色又爽无遮挡免| av有码第一页| 国产精品偷伦视频观看了| 欧美精品av麻豆av| 一级a爱视频在线免费观看| 亚洲男人天堂网一区| 久久99精品国语久久久| 欧美精品av麻豆av| 嫩草影视91久久| 99国产综合亚洲精品| 欧美中文综合在线视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| 午夜免费观看性视频| 精品福利永久在线观看| svipshipincom国产片| 亚洲精品国产区一区二| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 久久久久久久精品精品| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产熟女欧美一区二区| 精品高清国产在线一区| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 久久久精品94久久精品| 一区福利在线观看| av网站在线播放免费| 日本欧美视频一区| 中文字幕色久视频| 精品亚洲成国产av| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 国产精品二区激情视频| 久久热在线av| 宅男免费午夜| 国产激情久久老熟女| 丝袜喷水一区| 久久精品成人免费网站| 午夜日韩欧美国产| 免费在线观看完整版高清| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产视频一区二区在线看| 国产男女超爽视频在线观看| 国产高清国产精品国产三级| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲av国产av综合av卡| 一级毛片女人18水好多 | 一区二区av电影网| 亚洲专区国产一区二区| 天天添夜夜摸| 久久午夜综合久久蜜桃| 男女午夜视频在线观看| 欧美精品一区二区免费开放| 一本大道久久a久久精品| 国产在线视频一区二区| 各种免费的搞黄视频| 老汉色∧v一级毛片| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 一级毛片女人18水好多 | 亚洲一区二区三区欧美精品| 丁香六月欧美| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 免费在线观看黄色视频的| 最近手机中文字幕大全| 精品人妻熟女毛片av久久网站| av又黄又爽大尺度在线免费看| 99热全是精品| 免费观看av网站的网址| 久久久久精品国产欧美久久久 | 又大又黄又爽视频免费| 欧美人与性动交α欧美软件| 自线自在国产av| 欧美精品一区二区大全| 青春草亚洲视频在线观看| 天天影视国产精品| 久久99精品国语久久久| 老司机影院成人| 久久av网站| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 国产高清国产精品国产三级| videos熟女内射| 高清黄色对白视频在线免费看| xxxhd国产人妻xxx| 亚洲国产欧美日韩在线播放| a级毛片在线看网站| av在线播放精品| 亚洲,欧美精品.| 国产97色在线日韩免费| 999精品在线视频| 国产av精品麻豆| 天堂8中文在线网| 国产日韩欧美亚洲二区| 欧美精品一区二区免费开放| av国产久精品久网站免费入址| 亚洲男人天堂网一区| 成人国产av品久久久| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产成人精品无人区| 国产亚洲精品第一综合不卡| 又黄又粗又硬又大视频| 精品人妻熟女毛片av久久网站| svipshipincom国产片| 在线观看一区二区三区激情| 美女主播在线视频| 丝袜脚勾引网站| 丝袜美腿诱惑在线| 日日摸夜夜添夜夜爱| 欧美黑人精品巨大| 爱豆传媒免费全集在线观看| 亚洲欧美一区二区三区国产| 久久人妻熟女aⅴ| 91老司机精品| 国产不卡av网站在线观看| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲三区欧美一区| 成年美女黄网站色视频大全免费| 99久久综合免费| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 久久免费观看电影| 国产精品一区二区免费欧美 | 国产黄色视频一区二区在线观看| 亚洲九九香蕉| www.精华液| 欧美97在线视频| 又大又黄又爽视频免费| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 最近中文字幕2019免费版| 国产片内射在线| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲熟女毛片儿| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 亚洲中文日韩欧美视频| 欧美变态另类bdsm刘玥| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 国产精品久久久久久精品古装| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲第一av免费看| 国产成人影院久久av| 午夜91福利影院| 在线观看一区二区三区激情| 久久九九热精品免费| 黄色a级毛片大全视频| 午夜免费成人在线视频| 在线观看人妻少妇| 十八禁人妻一区二区| 9色porny在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 日韩欧美一区视频在线观看| 久久99一区二区三区| 国产成人av教育| 精品国产乱码久久久久久男人| 亚洲av男天堂| 手机成人av网站| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产成人精品无人区| xxxhd国产人妻xxx| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| xxx大片免费视频| 日本五十路高清| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 秋霞在线观看毛片| 日韩av不卡免费在线播放| 欧美性长视频在线观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 精品少妇久久久久久888优播| 久久av网站| 国产男女内射视频| 免费少妇av软件| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲国产成人一精品久久久| 中文欧美无线码| 97精品久久久久久久久久精品| 色精品久久人妻99蜜桃| 大片免费播放器 马上看| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国产成人av激情在线播放| 99国产精品免费福利视频| 国产激情久久老熟女| 国产一卡二卡三卡精品| 亚洲一码二码三码区别大吗| 精品少妇内射三级| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产片内射在线| 午夜福利一区二区在线看| 久久ye,这里只有精品| 久久av网站| 国产99久久九九免费精品| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产精品一区二区在线不卡| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 夫妻午夜视频|