植物根際促生菌對(duì)兩種真菌病害病原的抑制作用及其鑒定

孫廣正，姚拓，趙桂琴，李建宏，陳龍，劉歡

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院, 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室,中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心,甘肅 蘭州 730070)

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植物根際促生菌對(duì)兩種真菌病害病原的抑制作用及其鑒定

孫廣正，姚拓*，趙桂琴，李建宏，陳龍，劉歡

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院, 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室,中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心,甘肅 蘭州 730070)

利用鉬藍(lán)比色法、乙炔還原法和高效液相色譜法分別測(cè)定了分離自5種植物根際的19株細(xì)菌溶磷、固氮和分泌生長素特性；用平板對(duì)峙生長法測(cè)定了19株細(xì)菌對(duì)黃瓜枯萎病菌和小麥根腐病菌的抑制作用；結(jié)合菌株形態(tài)、生理生化反應(yīng)，利用分子生物學(xué)方法鑒定了其中8株優(yōu)良細(xì)菌。結(jié)果表明，菌株BacillussubtilisLM4-3固氮酶活性較高[244.88 nmol C2H4/(mL·h)]；菌株B.subtilisLHS11-1溶磷能力較強(qiáng)(205.77 mg/L)；菌株P(guān)GRS-3分泌IAA能力較好(40.78 μg/mL)。5株菌株能夠有效拮抗黃瓜枯萎病菌，其中B.subtilisFX2-1抑菌活性較強(qiáng)(活菌抑制率69.07%，發(fā)酵液抑制率51.73%)。7株菌株能夠有效拮抗小麥根腐病菌，其中B.subtilisFX2-1抑菌活性較強(qiáng)(活菌抑制率 78.17%)，B.subtilisLHS11-1發(fā)酵液抑制率高達(dá)81.52%。其他具有較好促生或拮抗上述兩種病原真菌的菌株經(jīng)鑒定，分別屬于蠟樣芽孢桿菌(B.cereus，菌株XX1)、短小芽孢桿菌(B.pumilus，菌株F1-4和LX22)、簡(jiǎn)單芽孢桿菌(B.simplex，菌株XX6)和熒光假單胞桿菌(Pseudomonasfluorescens，菌株XX5)。

PGPR菌；促生特性；黃瓜枯萎病菌；小麥根腐病菌；抑菌作用；鑒定

植物病害是植物在生物或非生物因子影響下，在生理、形態(tài)和組織上發(fā)生一系列的病理變化，使植物不能正常地生長發(fā)育，并出現(xiàn)各種病態(tài)，從而影響經(jīng)濟(jì)效益的現(xiàn)象[1]。黃瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌黃瓜?；?Fusariumoxysporumf. sp.cucumerinum)引起，是一種世界性的植物維管束病害，其發(fā)病程度與土壤中病原微生物累積數(shù)量密切相關(guān)，研究表明土壤中尖孢鐮刀菌數(shù)量大于103/g，即可使黃瓜致病[2]。該病是黃瓜連作障礙中最主要的因素之一，近年來有愈來愈嚴(yán)重的趨勢(shì)，嚴(yán)重影響生產(chǎn)[3]。此外，該菌還引起馬鈴薯(Solanumtuberosum)、茄子(Solanummelongena)、棉花(Gossypiumhirsutum)等多種農(nóng)作物病害。小麥根腐病是由麥根腐平臍蠕孢(Bipolarissorokiniana)引起，該病害的發(fā)生與土壤、種子帶菌量和耕作栽培制度等因素密切相關(guān)，能使小麥(Triticumaestivum)減產(chǎn)20%～60%[4]。此外，該菌還能危害禾本科等多種植物，是根部的主要病原之一。目前，黃瓜枯萎病和小麥根腐病防治主要依賴化學(xué)農(nóng)藥。然而，長期大量施用化學(xué)農(nóng)藥導(dǎo)致農(nóng)藥殘留及環(huán)境污染，危害人類健康并破壞生態(tài)平衡，同時(shí)也使病原菌產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性。因此，探尋可持續(xù)控制病害的新途徑已經(jīng)迫在眉睫。

近年來研究表明，植物根際促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)通過改變土壤中難溶性元素的形態(tài)，從而促進(jìn)植物吸收(如固氮、解磷等)，或者合成利于植物生長發(fā)育的物質(zhì)(如生長素等)和間接方式促進(jìn)植物生長，同時(shí)一些菌還能抑制或減輕某些植物病原菌生長和繁殖[5]。近年來，國外學(xué)者對(duì)PGPR菌用于生物防治的研究很多，取得了許多寶貴成果。但是，我國這方面工作稍顯落后，絕大多數(shù)工作只限于菌株的分離篩選方面，對(duì)于其綜合特性的研究還很少。另一方面，分離鑒定優(yōu)良PGPR菌株，并系統(tǒng)研究其促生抗病特性，對(duì)于進(jìn)一步開發(fā)這一寶貴資源也具有重要意義。鑒于此，本研究以分離自5種植物根際的19株菌為原始材料，測(cè)定了菌株的溶磷能力、固氮酶活性和分泌生長素特性；研究了細(xì)菌對(duì)黃瓜枯萎病菌和小麥根腐病菌的抑制作用；鑒定了優(yōu)良拮抗菌株。以期為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上控制黃瓜枯萎病和小麥根腐病提供新的生物防治資源。

1　材料與方法

1.1材料

細(xì)菌：分離自苜蓿(Medicagosativa)、小麥、玉米(Zeamays)、三葉草(Trifoliumpretense)和高原早熟禾(Poaalpigena)根際(表1)，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院草地微生物實(shí)驗(yàn)室提供的19株細(xì)菌，菌株代號(hào)分別為JM170、JM92、LX191、G、JX59、LX22、LX81、LHS11-1、LM4-3、4N4、P2-1、PGRS-3、XX1、XX2、XX5、XX6、FX1、FX2-1和F1-4。

植物病原真菌：黃瓜枯萎病菌(F.oxysporumf. sp.cucumerinum)和小麥根腐病菌(B.sorokiniana)。

培養(yǎng)基：PDA (potato dextrose agar)[6]、LB (luria bertani)、PKO (pikovskaya)、King’s B和NFM (nitrogen-free medium)[7]。

1.2方法

1.2.1菌株溶磷性能測(cè)定點(diǎn)接菌株至PKO培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)7 d，觀察菌落周圍有無溶磷圈，測(cè)定菌落直徑與溶磷圈直徑，定性判斷菌株溶磷能力；制備菌株懸浮液(108cfu/mL)，接種0.5 mL菌懸液于50 mL PKO液體培養(yǎng)基中，(28 ℃，160 r/min)培養(yǎng)10 d，在4 ℃下離心(10000 r/min) 15 min，用鉬藍(lán)比色法測(cè)上清液有效磷(P)含量，每菌株3次重復(fù)[7]。

1.2.2菌株固氮酶活性測(cè)定在15 mL血清瓶中加入5 mL NFM半固體培養(yǎng)基，將菌株分別接于該培養(yǎng)基，以等量的無菌培養(yǎng)液為對(duì)照(CK)。28 ℃培養(yǎng)2 d后，用注射器從血清瓶中抽出1 mL氣體，同時(shí)又注入等量C2H2氣體，28 ℃培養(yǎng)2～3 d。然后用微量進(jìn)樣器從該瓶中抽取混合氣體50 μL注入氣相色譜儀(GC)的進(jìn)樣柱中，從顯示屏上觀察C2H2、C2H4峰面積。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上通過乙烯峰面積得到乙烯量，運(yùn)用外標(biāo)法計(jì)算固氮酶活性[7]，每菌株3個(gè)重復(fù)。

1.2.3菌株分泌IAA能力測(cè)定取30 mL在KB培養(yǎng)基上生長12 d的懸浮液，(4 ℃，10000 r/min)離心10 min，將上清液在冷凍干燥儀中干燥至10 mL，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，pH調(diào)至2.8，加入20 mL乙酸乙酯，振蕩5 min，兩相分層后轉(zhuǎn)移乙酸乙酯層，下層溶液用20 mL乙酸乙酯再提取1次，合并乙酸乙酯層于50 mL磨口燒瓶中。在45 ℃水浴中加熱，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮，溶于0.6%冰乙酸中，然后定容2 mL，過0.45 μm有機(jī)系濾膜，供高效液相色譜儀測(cè)定[7]。

1.2.4優(yōu)良拮抗菌初篩試驗(yàn)時(shí)間為2014年3-11月，采用平板對(duì)峙法測(cè)定細(xì)菌對(duì)病原真菌的拮抗作用[6]。將病原菌菌餅(直徑為6 mm)置于PDA培養(yǎng)基中心，在中心1.8 cm等距離四點(diǎn)接同一細(xì)菌(用加液槍將菌液垂直滴加在培養(yǎng)基平面上)，25 ℃培養(yǎng)，當(dāng)對(duì)照菌絲在半徑為45 mm培養(yǎng)基上長滿時(shí)，測(cè)量真菌距細(xì)菌近端的半徑。每種組合3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。抑菌率=[(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑]×100%。并在顯微鏡下(10×40)觀察拮抗菌與真菌菌絲交界處的菌絲，了解拮抗菌對(duì)病原菌菌絲形態(tài)的影響。

1.2.5優(yōu)良拮抗菌復(fù)篩將初篩得到的拮抗菌制備成無菌發(fā)酵液[8]進(jìn)行復(fù)篩。將無菌發(fā)酵液與45 ℃左右的PDA培養(yǎng)基按1∶9制成固體培養(yǎng)基，以不含無菌發(fā)酵液的(加同樣比例的無菌水)PDA平板為對(duì)照。在平板中央接病原菌菌餅，25 ℃培養(yǎng)，當(dāng)對(duì)照菌絲在半徑為45 mm培養(yǎng)基上長滿時(shí)，測(cè)量菌落直徑并計(jì)算抑菌率。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.6優(yōu)良拮抗菌株鑒定對(duì)兩種病原真菌具有優(yōu)良抑制作用的菌株LX22、LHS11-1、LM4-3、XX1、XX5、XX6、FX2-1和F1-4進(jìn)行鑒定。菌株的形態(tài)特征觀察及生理生化測(cè)定參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[9]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[10]。

16S rDNA序列分析：首先對(duì)菌株革蘭氏染色。然后提取菌株的總DNA。選用細(xì)菌通用引物1429R-27F，1429R：5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；27F：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′；50 μL PCR反應(yīng)體系組成：25 μL預(yù)混酶(dNTP，Mg2+，PCR buffer，PCR酶)，引物(10 μmol/L)各2 μL，模板2 μL (50 ng/μL)，ddH2O 19 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)30次，72 ℃再延伸10 min。擴(kuò)增后，取4 μL的樣品在1%的瓊脂糖凝膠上(80 V電壓)進(jìn)行電泳，并將檢測(cè)合格樣品送交測(cè)序(上海生工生物工程有限公司)。將序列在GenBank中進(jìn)行相似性分析，用ClustalX 1.8進(jìn)行多重序列比對(duì)，用Mega 5.0中鄰接法進(jìn)行發(fā)育樹構(gòu)建，其中枝長代表分歧程度，各枝上的數(shù)字表示500次自舉(Bootstrap)重抽樣分析的支持百分比。

1.3統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2　結(jié)果與分析

2.1菌株促生特性

19株細(xì)菌溶磷、固氮及分泌IAA能力見表1，菌株LM4-3固氮酶活性顯著好于其他菌株(P<0.05)，達(dá)到244.88 nmol C2H4/(mL·h)；菌株LHS11-1和LX191的溶磷能力顯著好于其他菌株(P<0.05)，分別達(dá)到205.77和205.71 mg/L，兩者之間差異不顯著(P>0.05)；菌株LX191分泌IAA能力顯著好于其他菌株(P<0.05)，達(dá)到40.78 μg/mL。其中，菌株JM92、4N4、P2-1、JM170、LHS11-1和FX2-1兼具溶磷、固氮及分泌IAA特性。

表1　菌株促生特性

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示經(jīng)Duncan氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05)?！?”表示促生特性微弱，“*”待鑒定。下同。

Note:Values in the Table are mean±SD. Values followed by different lowercase letters in the same column are significantly different atP<0.05 level by Duncan’s new multiple range test. “-” indicates weak growth promoting properties, “*”not identified. The same below.

2.2優(yōu)良拮抗菌初篩

2.2.1菌株與黃瓜枯萎病菌拮抗培養(yǎng)4 d后，19株細(xì)菌中5株對(duì)黃瓜枯萎病菌具有抑制作用，菌株LHS11-1和FX2-1的抑菌活性較好，抑制率均大于40% (表2)，和其他3株相比，抑菌能力極顯著(P<0.01)。5株拮抗菌隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，抑制率均提高。培養(yǎng)9 d后，F(xiàn)X2-1具有較好的抑菌活性，抑制率達(dá)到69.07%。LHS11-1和FX2-1能夠明顯抑制病原菌菌絲的生長(圖1A2)，抑菌能力極顯著(P<0.01)。培養(yǎng)10 d后，對(duì)照菌落在平板上長滿(圖1A1)。

2.2.2菌株與小麥根腐病菌拮抗在培養(yǎng)3 d后，19株細(xì)菌中7株對(duì)小麥根腐病菌具有抑制作用，F(xiàn)X2-1的抑菌活性較好，抑制率大于60% (表2)，抑菌能力極顯著(P<0.01)。在培養(yǎng)7 d后，F(xiàn)X2-1和LHS11-1對(duì)小麥根腐病菌的抑制率達(dá)到70%以上。FX2-1具有較好的抑菌活性，抑菌能力極顯著高于其他6株拮抗菌(P<0.01)。FX2-1和LHS11-1不僅表現(xiàn)出較好的抑菌能力，拮抗菌菌株自身還可以形成較大的菌落(圖1B2)。培養(yǎng)8 d后，對(duì)照菌落在平板上長滿(圖1B1)。

2.3優(yōu)良拮抗菌復(fù)篩

2.3.1菌株發(fā)酵液與黃瓜枯萎病菌拮抗培養(yǎng)4 d后，LHS11-1和FX2-1發(fā)酵液對(duì)黃瓜枯萎病菌的抑制率均達(dá)17.54%(表3)，但兩者之間差異不顯著(P>0.01)。培養(yǎng)9 d后，F(xiàn)X2-1發(fā)酵液抑菌能力較好，抑制率為51.73%，相比其他4種菌差異極顯著(P<0.01)。

表2　菌株對(duì)兩種病原真菌拮抗作用

注：同列不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01),不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note:Different capital letters mean significant differences atP<0.01; different small letters mean significant differences atP<0.05. The same below.

圖1　拮抗菌與兩種真菌病原平板對(duì)峙(部分)Fig.1　The panel confrontation of bio-control strains and two fungous pathogens (part)　A：黃瓜枯萎病菌；B：小麥根腐病菌。3～4為光鏡照片，放大倍數(shù)為10×40。A1：對(duì)照；A2：菌株LHS11-1處理；A3：對(duì)照，正常菌絲；A4：菌株LHS11-1處理，菌絲彎曲，分枝增多；B1：對(duì)照；B2：菌株FX2-1處理；B3：對(duì)照，正常菌絲；B4：菌株FX2-1處理，菌絲分枝增多，內(nèi)陷。A: F. oxysporum f. sp. cucumerinum; B: B. sorokiniana. 3-4 are micrographs made by optical microscope at a magnification of 10×40. A1: CK; A2: Strain LHS11-1 treatment; A3: CK, normal mycelium; A4: Strain LHS11-1 treatment, the bending mycelium, increased branches; B1: CK; B2: Strain FX2-1 treatment; B3: CK, normal mycelium; B4: Strain FX2-1 treatment, increased and retracted mycelium branches.

2.3.2菌株發(fā)酵液與小麥根腐病菌拮抗在培養(yǎng)3 d后，LHS11-1和FX2-1的發(fā)酵液對(duì)小麥根腐病菌有抑制作用，抑制率分別為72.87%和55.81%(表3)。其他細(xì)菌的發(fā)酵液對(duì)小麥根腐病菌幾乎沒有抑制作用。在培養(yǎng)7 d后，LHS11-1的發(fā)酵液抑菌能力較強(qiáng)，抑制率達(dá)到81.52%，和其他6種細(xì)菌相比，抑制率差異極顯著(P<0.01)。LM4-3、XX6和LX22抑菌作用微弱。

2.4拮抗菌對(duì)病原菌菌絲生長影響

2.4.1拮抗菌對(duì)黃瓜枯萎病菌菌絲生長抑制作用LHS11-1使黃瓜枯萎病菌菌絲分枝增多，扭曲變形，內(nèi)容物質(zhì)減少(圖1A4)。菌株FX2-1使菌絲發(fā)生內(nèi)陷，細(xì)胞內(nèi)含物質(zhì)減少。菌株LM4-3、菌株XX1和F1-4使菌絲內(nèi)容物減少。對(duì)照呈均勻絲狀，內(nèi)含物質(zhì)較多(圖1A3)。

2.4.2拮抗菌對(duì)小麥根腐病菌菌絲生長抑制作用LHS11-1、LM4-3、XX1、XX6、FX2-1和LX22使小麥根腐病菌的菌絲變粗，發(fā)生不同程度的彎曲變形(圖1B4)。菌株XX5使菌絲分枝增多，內(nèi)陷呈枯萎狀，細(xì)胞內(nèi)含物質(zhì)減少。對(duì)照菌絲呈均勻絲狀，直角分支(圖1B3)。

表3　菌株發(fā)酵液對(duì)兩種病原真菌拮抗及抑制率

2.5優(yōu)良拮抗菌株鑒定

2.5.1菌株形態(tài)特征與生理生化特性8株優(yōu)良拮抗菌中，XX5為革蘭氏陰性菌，其余均為革蘭氏陽性菌，所有菌株生長速度較快。根據(jù)其生理生化特性(表4)，參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[9]、《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[10]以及參考文獻(xiàn)[11-12]中的參考菌株，初步確定LHS11-1和FX2-1為枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，XX1為蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)，LX22、LM4-3和F1-4為短小芽孢桿菌(B.pumilus)，XX6為簡(jiǎn)單芽孢桿菌(B.simplex)，XX5為熒光假單胞桿菌(P.fluorescens)。

表4　菌株生理生化特性

+：菌株反應(yīng)陽性；-：菌株反應(yīng)陰性；NT：沒有測(cè)定。+: Strains were positive; -: Strains were negative; NT: No determination.

2.5.216S rDNA序列分析8株細(xì)菌PCR產(chǎn)物電泳圖如圖2，所有菌株的16S rDNA序列全長在1500～2000 bp之間。經(jīng)Blast相似性分析，選取20個(gè)典型菌株的16S rDNA序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果如圖3。綜合以上形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)結(jié)果，確定LHS11-1和FX2-1為枯草芽孢桿菌(B.subtilis)(序列登錄號(hào)分別為：KR811366和KR811367)，XX1為蠟樣芽孢桿菌(B.cereus) (登錄號(hào)：KR811368)；LM4-3、F1-4和LX22為短小芽孢桿菌(B.pumilus) (登錄號(hào)分別為：KR811370、KR811372和KR811374)；XX6為簡(jiǎn)單芽孢桿菌(B.simplex) (登錄號(hào)：KR811373)；XX5為熒光假單胞桿菌(P.fluorescens) (登錄號(hào)：KR811375)。

圖2　菌株16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳Fig.2　Electrophoresis of PCR amplification 16S rDNA of tested strains　　　M: DL2000; 1: 菌株Strain LHS11-1; 2: 菌株Strain LM4-3; 3: 菌株Strain F1-4; 4: 菌株Strain XX6; 5: 菌株Strain LX22; 6: 菌株Strain XX5; 7: 菌株Strain FX2-1; 8: 菌株Strain XX1.

圖3　菌株16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3　Phylogenetic tree of tested strains based on 16S rDNA sequences

3　討論

3.1菌株促生特性

通過測(cè)定19株細(xì)菌的促生特性，發(fā)現(xiàn)具有溶磷能力的菌株13株，具有固氮酶活性的菌株14株，能夠分泌生長素的菌株10株。兼具3種促生特性的菌株6株，分別是菌株JM92、4N4、P2-1、JM170、LHS11-1和FX2-1。 分離自高原早熟禾的菌株P(guān)GRS-3分泌IAA能力較好，達(dá)到40.78 μg/mL。連翠飛等[13]研究發(fā)現(xiàn)菌株CX-5-2培養(yǎng)120 h產(chǎn)IAA能力較好，達(dá)到1.19 μg/mL，但是赤霉素含量達(dá)到108.63 μg/mL；分離自苜蓿的菌株LM4-3固氮酶活性較好，達(dá)到244.88 nmol C2H4/(mL·h)。王秀呈等[14]分離獲得48株內(nèi)生菌，其中HerbaspirillumseropedicaeDX35固氮酶活性最高，為181.21 nmol C2H4/(mL·h)。14株細(xì)菌固氮酶活性差別較大，這可能與采集地點(diǎn)土壤狀況、植物種類不同有關(guān)；鉬藍(lán)比色法定量測(cè)定菌株的溶磷能力，溶磷圈與菌落直徑大小的比值(D/d)隨著時(shí)間變化而變化，大多數(shù)溶磷菌株的D/d值在第10天時(shí)處于穩(wěn)定狀態(tài)[15]，Chen等[16]發(fā)現(xiàn)這與培養(yǎng)基中的磷酸鈣和蛋黃卵磷脂含量有關(guān)。本研究中溶磷能力較強(qiáng)為分離自紅三葉草的菌株LHS11-1，溶磷量達(dá)到205.77 μg/mL。顧杰等[17]研究發(fā)現(xiàn)3株菌的溶磷能力為41.63，37.76和39.78 μg/mL。由此可見本研究中的菌株促生特性明顯好于其他學(xué)者研究的菌株，均為PGPR菌，但這些菌株對(duì)植物的促生效果有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

3.2菌株對(duì)兩種病害病原抑制作用

近年來，農(nóng)作物復(fù)種指數(shù)及種植密度持續(xù)增加，使土壤養(yǎng)分嚴(yán)重失衡，導(dǎo)致植物病害發(fā)生嚴(yán)重，使農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的經(jīng)濟(jì)損失每年達(dá)40%～60%，嚴(yán)重地塊可達(dá)80%以上[18]。利用生物防治已成為學(xué)者們的研究重點(diǎn)[19]。卜春亞等[20]從黃瓜根際篩選得到的拮抗菌j-28對(duì)黃瓜枯萎病菌的抑菌帶達(dá)到11.0 mm，具有較強(qiáng)的抑制作用，并且拮抗菌j-28有較廣的抑菌譜，對(duì)黃瓜灰霉病菌、馬鈴薯干腐病菌和茄子黃萎病菌等均具有很強(qiáng)的拮抗作用。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)拮抗菌LHS11-1和FX2-1拮抗效果明顯，對(duì)黃瓜枯萎病菌的抑制率分別達(dá)到67.38%和69.07%，對(duì)小麥根腐病菌的抑制率分別達(dá)到71.03%和78.17%。因此，對(duì)菌株LHS11-1和FX2-1是否具有較廣譜的抑菌性有待進(jìn)一步研究。

拮抗菌防治植物病害的作用機(jī)制主要有營養(yǎng)和空間位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)、分泌抗菌物質(zhì)、寄生和誘導(dǎo)植物體抗性等。研究發(fā)現(xiàn)PGPR在植物幼根表面定殖時(shí)能夠形成一層均勻的保護(hù)層，保護(hù)了病原菌的侵染位點(diǎn)，減低了侵染機(jī)會(huì)[21]。并且通過產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、溶菌酶、木聚糖酶和胞外殼聚糖酶等對(duì)土壤中的大分子物質(zhì)進(jìn)行降解，在給植物提供營養(yǎng)的同時(shí)減少植物病害的發(fā)生[22]。趙帥等[23]研究發(fā)現(xiàn)HD-087產(chǎn)抗菌物質(zhì)能造成黃瓜枯萎病病原菌菌絲畸形、分生孢子萌發(fā)受抑制，5倍發(fā)酵稀釋液對(duì)孢子萌發(fā)的抑制率達(dá)72.1%。Chen等[24]研究表明，B.subtilisB579無菌培養(yǎng)液導(dǎo)致黃瓜枯萎病菌菌絲畸形，抑制孢子萌發(fā)，B579培養(yǎng)液灌根接種防治效果可達(dá)73.6%。本研究主要從拮抗菌分泌抗菌物質(zhì)及其對(duì)真菌菌絲形態(tài)的影響角度對(duì)拮抗菌抑菌機(jī)理進(jìn)行初步探索，對(duì)菌株后續(xù)的研究有一定的參考價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)拮抗菌LHS11-1和FX2-1發(fā)酵液對(duì)兩種病害均有一定的抑制作用，對(duì)黃瓜枯萎病菌的抑制率分別為45.69%和51.73%，對(duì)小麥根腐病菌的抑制率分別達(dá)到81.52%和67.67%。拮抗菌發(fā)酵液對(duì)黃瓜枯萎病的抑制率較活菌的抑制率降低，可能是活菌抑制由空間位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)和抗菌物質(zhì)等共同起作用。對(duì)小麥根腐病菌的抑制率較活菌的抑制率提高，可能是主要通過次生代謝產(chǎn)物起抑制作用。利用光學(xué)顯微鏡對(duì)拮抗菌抑菌機(jī)理的初步研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)兩種土傳病害病原菌菌絲具有顯著的致畸作用，可以使菌絲發(fā)生不同程度的膨大變形，使菌絲內(nèi)容物釋放，最終導(dǎo)致病原菌的細(xì)胞壁破裂，菌絲斷裂，病原菌消亡?？赡苁沁@種畸變作用造成了病原菌菌絲失活，影響了病原菌的生長。對(duì)其是否存在其他的拮抗機(jī)制有待于進(jìn)一步的探索研究。

3.3優(yōu)良拮抗菌株鑒定

16S rDNA序列分析是微生物分類學(xué)中重要的方法，通過16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)序列比較分析，可快速準(zhǔn)確地對(duì)微生物進(jìn)行鑒定分類。本試驗(yàn)對(duì)8株優(yōu)良拮抗菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征初步鑒定，再利用16S rDNA基因測(cè)序確定LHS11-1和FX2-1為枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，LM4-3、F1-4和LX22為短小芽孢桿菌(B.pumilus)；XX6為簡(jiǎn)單芽孢桿菌(B.simplex)；XX1為蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)；XX5為熒光假單胞桿菌(P.fluorescens)。國內(nèi)外大量學(xué)者發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬和假單胞菌屬能夠很好地定殖于植物根部，既能促進(jìn)植物根系生長也能防治一些病害的發(fā)生，如Smith等[25]發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌(B.cereus) UW85能夠定殖于植物根際，并證實(shí)了其抑制病害細(xì)菌與植物間的相互關(guān)系。Ryu等[26]發(fā)現(xiàn)B.subtilisGB03誘導(dǎo)擬南芥對(duì)鹽害的忍耐力，并且該菌株產(chǎn)生的一些揮發(fā)性有機(jī)物是促使其產(chǎn)生誘導(dǎo)體系忍耐力的決定性物質(zhì)。

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An assessment of the level of control of two fungal pathogens by various plant growth promoting rhizobacteria

SUN Guang-Zheng, YAO Tuo*, ZHAO Gui-Qin, LI Jian-Hong, CHEN Long, LIU Huan

CollegeofPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity,KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,MinistryofEducation,PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince,Sino-U.S.CentersforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China

The capacity for dissolved phosphorus absorption, the nitrogenase activity and the secretion of auxin of 19 strains of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) acquired from five plant species were tested by molybdenum blue colorimetry, acetylene reduction assay and high performance liquid chromatography, respectively. All 19 strains were tested for ability to antagonize the fungiFusariumoxysporumf. sp.cucumerinumandBipolarissorokiniana, using the panel confrontation method. Strains with antagonistic ability were identified at morphological, physiological biochemical, and molecular levels. It was found thatBacillussubtilisstrain LM4-3 had stronger nitrogenase activity than other tested strains and reached 244.88 nmol C2H4/(mL·h), whileB.subtilisstrain LHS11-1 had the highest dissolved phosphorus absorption capacity (205.77 mg/L), and the strain PGRS-3 had the greatest secretion of auxin, reaching 40.78 μg/mL in the culture medium. Five bacterial strains were found to have antagonistic activity againstF.oxysporumf. sp.cucumerinum, withB.subtilisstrain FX2-1 providing up to 69.07% suppression. and 51.73% of its fermentation solution. Seven bacterial strains could efficiently antagonizeB.sorokiniana, withB.subtilisstrain FX2-1 achieving 78.17%, the fermentation solution ofB.subtilisLHS11-1 rinsed up to 81.52%. Other bacterial species found to have plant growth promoting or to be antagonistic towards the above two pathogenic fungal species includedBacilluscereus,Bacilluspumilus,BacillussimplexandPseudomonasfluorescens.

plant growth promoting rhizobacteria (PGPR); growth characteristics;Fusariumoxysporumf. sp.cucumerinum;Bipolarissorokiniana; antimicrobial activity; identification

10.11686/cyxb2015353http://cyxb.lzu.edu.cn

孫廣正, 姚拓, 趙桂琴, 李建宏, 陳龍, 劉歡. 植物根際促生菌對(duì)兩種真菌病害病原的抑制作用及其鑒定. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 25(8): 154-163.

SUN Guang-Zheng, YAO Tuo, ZHAO Gui-Qin, LI Jian-Hong, CHEN Long, LIU Huan. An assessment of the level of control of two fungal pathogens by various plant growth promoting rhizobacteria. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(8): 154-163.

2015-07-15；改回日期：2015-10-21

國家自然基金(31360584)和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-08-C)資助。

孫廣正(1988-)，男，甘肅慶陽人，在讀碩士。E-mail: sunfanfan885@163.com

Corresponding author. E-mail: yaotuo@gsau.edu.cn