2種嵩草屬牧草休眠期內(nèi)生細(xì)菌多樣性研究

楊成德，王玉琴，陳秀蓉,張振粉，薛莉，王穎，姚玉玲

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070)

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2種嵩草屬牧草休眠期內(nèi)生細(xì)菌多樣性研究

楊成德，王玉琴，陳秀蓉*,張振粉，薛莉，王穎，姚玉玲

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070)

采用稀釋平板法從兩種嵩草屬牧草休眠期根和種子中分離到23株內(nèi)生細(xì)菌，測定了其抑菌、溶磷、固氮和產(chǎn)IAA等生物學(xué)功能，并通過16S rDNA 基因序列分析進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明，兩牧草根和種子中內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量和群落組成存在明顯差異；線葉嵩草內(nèi)生細(xì)菌的種類比矮生嵩草豐富；矮生嵩草根部內(nèi)生細(xì)菌比種子中豐富，而線葉嵩草種子內(nèi)生細(xì)菌較根部豐富；種子存放時(shí)間影響內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量；20株可繼代培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌中具有抑菌、溶磷、固氮和產(chǎn)IAA生物功能的菌株分別占總菌株數(shù)的35%，55%，45%和25%。獲得15株內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA 基因序列，經(jīng)同源性比較，其分別屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)、葉桿菌屬(Phyllobacterium)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、微桿菌屬(Microbacterium)、原小單孢菌屬(Promicromonospora)和鞘氨醇盒菌屬(Sphingopyxis)，且芽孢桿菌屬細(xì)菌為其優(yōu)勢種群。

嵩草屬；內(nèi)生細(xì)菌；鑒定；多樣性；生物功能

幾乎所有植物中都伴隨有內(nèi)生細(xì)菌[1-2]，其與宿主植物在長期共同進(jìn)化過程中形成密切關(guān)系，是植物微生物生態(tài)系統(tǒng)的主要成員[3]。隨著植物內(nèi)生細(xì)菌研究的不斷深入，明確了其通過抑菌、溶磷和固氮等生物功能，增強(qiáng)了宿主植物的抗病性、抗旱性及生長競爭能力等[4-5]，成為近年來研究的熱點(diǎn)，特別是相關(guān)功能方面的研究報(bào)道較多。植物內(nèi)生細(xì)菌可分泌吲哚乙酸(IAA)[6-7]，促進(jìn)植物根的生長及分布，有利于從土壤中吸收更多的營養(yǎng)物質(zhì)；內(nèi)生固氮菌生活在植物體內(nèi)，避免了化合態(tài)氮的抑制及土著微生物的競爭，表現(xiàn)出更高的固氮效率[8-9]；楊成德等[10]也從內(nèi)生細(xì)菌中擴(kuò)增出了nifH基因片段。關(guān)于內(nèi)生細(xì)菌抑菌能力[11-17]和溶磷能力[7,11]方面的報(bào)道較多；另外，植物內(nèi)生細(xì)菌具有激活植物基本抗病性或誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗病性的潛力[18]，還可以提高植物抗重金屬鹽的能力[19]；所以，植物內(nèi)生細(xì)菌具有豐富的功能多樣性，是植物病害生物防治、內(nèi)生固氮菌篩選及抗病性誘導(dǎo)等功能的天然菌源，也是研究植物與微生物互作的良好材料，具有極高的理論研究價(jià)值和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，也具有開發(fā)為微生物源農(nóng)藥或肥料的巨大潛力[20-21]。

植物內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量和種類存在豐富多樣性[22-23]，且在不同宿主及不同器官的種類、數(shù)量、群落結(jié)構(gòu)和多樣性存在較大的差異[24-25]。矮生嵩草(Kobresiahumilis)和線葉嵩草(Kobresiacapillifolia)是高寒草地的多年生草本植物，草質(zhì)柔軟，抗逆性強(qiáng)，營養(yǎng)價(jià)值高，為高寒草地的優(yōu)良牧草。目前，關(guān)于高寒草地嵩草屬生長期內(nèi)生細(xì)菌已有報(bào)道[6-7,15]，但是，有關(guān)休眠期種子及根系內(nèi)生細(xì)菌方面的研究未見報(bào)道。因此，為了明確休眠期內(nèi)生細(xì)菌的多樣性，本試驗(yàn)從2種嵩草屬牧草種子及根系中分離純化其內(nèi)生細(xì)菌，研究其種類及抑菌、溶磷和產(chǎn)IAA等功能，以期為明確2種嵩草屬牧草休眠期內(nèi)生細(xì)菌的多樣性提供依據(jù)，也為高寒草地特有植物內(nèi)生細(xì)菌的開發(fā)和利用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)地概況

位于甘肅省天?？h金強(qiáng)河甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)高寒草原試驗(yàn)站前金桿溝山麓兩側(cè)，北緯37°11′-37°18′、東經(jīng)102°23′-102°47′，海拔2900～3200 m，年均溫-0.1 ℃，全年大于0 ℃年積溫1380 ℃；無絕對無霜期，冷季長達(dá)7個(gè)月，植物生長季為120～140 d，年降水量416 mm，多為地形雨，集中于7-9月；10月底至第2年4月為降雪期；年蒸發(fā)量1592 mm；植被主要為草本植物。

1.2試驗(yàn)材料

供試內(nèi)生細(xì)菌：分離自2011年11月進(jìn)入休眠期的矮生嵩草和線葉嵩草的根系及2011年10月采集的種子，種子內(nèi)生細(xì)菌分離時(shí)間為2011年12月和2012年12月。

供試病原菌：馬鈴薯枯萎病菌(Fusariumavenaceum)、馬鈴薯壞疽病菌(Phomafoveata)和馬鈴薯炭疽病菌(Colletotrichumcoccodes)，均為甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

供試培養(yǎng)基：肉汁胨培養(yǎng)基(NA)用于內(nèi)生菌的活化和保存[26]；馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)用于植物病原真菌的培養(yǎng)和對峙試驗(yàn)[26]；金氏(King)培養(yǎng)基用于菌株產(chǎn)IAA的測定；Pikovaskaia培養(yǎng)基(PKO)用于菌株溶解無機(jī)磷的測定；蒙金娜培養(yǎng)基用于測定菌株溶解有機(jī)磷的能力[27]；阿須貝無氮培養(yǎng)基用于固氮能力測定[28]。

1.3內(nèi)生細(xì)菌的分離

將牧草的根和種子表面消毒，即對根用水沖洗干凈后稱取1 g，在無菌條件下依次用10% NaClO浸泡3 min，0.1%升汞浸泡10 min，處理間均用無菌水沖洗3～4 次；稱取1 g種子，計(jì)算粒數(shù)后消毒方法同根。取最后1次無菌水沖洗液0.2 mL涂布NA 培養(yǎng)基，檢驗(yàn)表面滅菌效果。將消毒后的材料置于無菌的盛有少量石英砂的研缽中磨碎(加入5 mL生理鹽水)，取上清液梯度稀釋到濃度為10-1～10-3，取3個(gè)稀釋度的菌懸液各0.2 mL涂布于NA平板上，重復(fù)3次，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，根據(jù)菌落形態(tài)分類劃線純化，將純化后的菌種4 ℃保存于NA斜面上[29]。同時(shí)根據(jù)菌落數(shù)計(jì)算每g根和種子中的內(nèi)生細(xì)菌總數(shù)及每粒種子帶內(nèi)生細(xì)菌數(shù)，利用新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性分析。

1.4內(nèi)生細(xì)菌的功能多樣性

1.4.1拮抗能力測定采用平皿對峙法測定抑菌效果，即將經(jīng)PDA培養(yǎng)基上活化的病原真菌打成直徑6 mm的菌餅接種于PDA培養(yǎng)基平板中央，再將活化后的內(nèi)生細(xì)菌點(diǎn)接于距菌餅2.5 cm處，每平板接4點(diǎn)，以點(diǎn)接無菌水為對照，重復(fù)3次，置25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，對照滿皿后測量抑菌圈(cm)并計(jì)算抑菌率[9-10]。

1.4.2溶磷能力測定將內(nèi)生細(xì)菌接于Pikovaskaia培養(yǎng)基(PKO)或蒙金娜培養(yǎng)基平板上，每皿接5點(diǎn)，重復(fù)3次，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，觀察并測量菌株在培養(yǎng)基平板上形成的溶磷圈大小。根據(jù)溶磷圈直徑/菌落直徑(D/d值)確定內(nèi)生細(xì)菌的溶磷能力[9-10]。

1.4.3固氮能力測定經(jīng)活化的供試菌株用無菌生理鹽水配制菌懸液，以200 μL分別接種于阿須貝無氮平板(涂布)和液體培養(yǎng)基內(nèi)，3次重復(fù)，以接種無菌水為對照，28 ℃培養(yǎng)(液體振蕩120 r/min)，在第3和7天目測其生長狀況，平板上有菌落和三角瓶內(nèi)培養(yǎng)基變渾濁者為陽性[30]。

1.4.4產(chǎn)生 IAA能力測定標(biāo)準(zhǔn)曲線采用純3-IAA制作。將經(jīng)King培養(yǎng)液培養(yǎng)12 d的菌懸浮液和空白對照離心(4 ℃，10000 r/min，10 min)，取上清液4 mL加等量比色液，在黑暗中靜置30 min，立即測定OD530值，重復(fù)測3次，以加比色液的空白對照調(diào)零。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出內(nèi)生細(xì)菌分泌IAA的量[30]。

1.516S rDNA基因序列分析鑒定

內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA基因序列擴(kuò)增引物序列為：引物1：5′-CCG GAT CCA GAG TTT GAT CAT GGC TCA GCA-3′，引物2：5′-CGG GAT CCT ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3′，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；擴(kuò)增和檢測方法等具體參考文獻(xiàn)[9]進(jìn)行，與GenBank數(shù)據(jù)庫 (http://www.ncbi.nlm.nihgov/blast.cgi) 中序列相似性比較，并用Clustal(1.8)軟件進(jìn)行多重序列比較和用Mega(4.0)軟件鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位。

2　結(jié)果與分析

2.1內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量多樣性

休眠期根內(nèi)生細(xì)菌分離結(jié)果表明，矮生嵩草2011年根中內(nèi)生細(xì)菌有3個(gè)種類，分別命名為ASG1、ASG2和ASG3，內(nèi)生細(xì)菌總數(shù)為3.5×105cfu/g；線葉嵩草2011年休眠期根內(nèi)分離到5種內(nèi)生細(xì)菌，分別命名為XSG1、XSG2、XSG3、XSG4和XSG5，多于矮生嵩草，但內(nèi)生細(xì)菌數(shù)為0.5×105cfu/g(表1)，顯著低于矮生嵩草(P<0.05)。

表1　休眠期根和種子內(nèi)生細(xì)菌

注:同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note：The different letters in the same column indicate significant differences atP<0.05 level, the same below.

矮生嵩草種子中2011年共分離到4種類型，分別命名為ASZ1、ASZ2、ASZ3和ASZ4，內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量為1.44×105cfu/g，低于根內(nèi)，每粒種子帶菌數(shù)為1.12×102cfu/粒；2012年種子中內(nèi)生細(xì)菌分離到3個(gè)種類，分別命名為2ASZ1、2ASZ2和2ASZ3，內(nèi)生細(xì)菌總數(shù)為0.13×105cfu/g，每粒種子帶菌數(shù)為0.38×102cfu/粒(表1)，顯著低于2011年(P<0.05)。

線葉嵩草種子中2011年分離得到4個(gè)種類，分別命名為XSZ2、XSZ2′、XSZ3和XSZ4，內(nèi)生細(xì)菌數(shù)為22.27×105cfu/g，顯著高于根內(nèi)數(shù)量，也顯著高于矮生嵩草(P<0.05)，每粒種子帶菌數(shù)為19.39×102cfu/粒；2012年種子分離得到4個(gè)種類，與2011年沒有變化，分別命名為2XSZ1、2XSZ2、2XSZ3和2XSZ4，內(nèi)生細(xì)菌數(shù)為2.14×105cfu/g，每粒種子帶菌數(shù)為2.37×102cfu/粒(表1)，顯著低于2011年，但顯著高于矮生嵩草(P<0.05)。

2.2內(nèi)生細(xì)菌功能多樣性

在所分離得到的23株內(nèi)生細(xì)菌中，有20株可以進(jìn)行繼代培養(yǎng)，并對其進(jìn)行了抑菌、溶磷、固氮和產(chǎn)IAA功能測定。抑菌能力測定結(jié)果表明(表2)，對馬鈴薯枯萎病菌、馬鈴薯壞疽病菌和馬鈴薯炭疽病菌有拮抗能力的菌株所占比例分別為35%，25%和30%；對馬鈴薯枯萎病菌和馬鈴薯壞疽病抑菌能力最好的菌株均為XSG4，抑菌率分別為70.93%和75.00%，對馬鈴薯炭疽病菌拮抗能力最好的菌株為2XSZ4，抑菌率為79.36%，且拮抗菌株對其抑菌效果較其他2種病原菌好，抑菌率多在70%以上；對3種病原菌均有拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌分別為XSG4、ASZ4、2XSZ3、2XSZ4和2ASZ2，占總菌株的25%，特別是XSG4對3種病原真菌的抑菌率均在70%以上，表現(xiàn)出良好的抑菌活性。

表2　牧草內(nèi)生細(xì)菌抑菌能力測定

-:表明無抑菌能力或抑菌能力較弱Without antibacterial activity.

對內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行溶磷、固氮和產(chǎn)IAA能力測定結(jié)果表明(表3)，有9個(gè)菌株具有固氮能力，占總菌株的45%；5個(gè)菌株具有溶解有機(jī)磷的能力，占總菌株的25%，10個(gè)菌株具有溶解無機(jī)磷的能力，占總菌株的50%，XSZ2、XSZ2′、ASZ1、XSG1和XSG4同時(shí)具有溶解有機(jī)磷和無機(jī)磷的能力，占總菌株的25%，特別是XSZ2′對兩種磷溶解能力較強(qiáng)，XSZ3、ASZ2、ASZ4、ASG3、XSG2和XSG3具有溶解無機(jī)磷的能力，且溶磷能力較強(qiáng)；5株菌在含或不含色氨酸的培養(yǎng)基上均可分泌IAA，占總菌株的25%，其中ASZ2在含色氨酸的培養(yǎng)基上分泌IAA的量達(dá)4.52 mg/L。

表3　牧草內(nèi)生細(xì)菌溶磷、固氮和產(chǎn)IAA能力測定

-：無功能Without biological function; +：有功能With biological function.

2.3內(nèi)生細(xì)菌種類多樣性

20株可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌中有15株成功提取其基因組DNA并擴(kuò)增出16S rDNA 序列。經(jīng)16S rDNA序列相似性分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育分析(圖1)，表明2種嵩草屬牧草分離到的內(nèi)生細(xì)菌屬于7個(gè)屬8個(gè)種，且2XSZ2，2ASZ3和2XSZ4屬于芽孢桿菌屬，但種的分類地位有待于進(jìn)一步研究，XSZ4和2ASZ1在屬水平的分類地位待定。7個(gè)屬分別為芽孢桿菌屬(Bacillus)、葉桿菌屬(Phyllobacterium)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、微桿菌屬(Microbacterium)、原小單孢菌屬(Promicromonospora)和鞘氨醇盒菌屬(Sphingopyxis)，其中線葉嵩草中分離到5種，分別是B.amyloliquefaciens、Phyllobacteriumtrifolii、S.epidermidis、Paenibacilluspolymyxa和M.oxydans，矮生嵩草分離到6種，分別是B.amyloliquefaciens、B.thuringiensis、Paenibacilluspolymyxa、M.oxydans、Promicromonosporaumidemergens和S.bauzanensis。線葉嵩草根部內(nèi)生細(xì)菌分別屬于Phyllobacterium.trifolii、Paenibacilluspolymyxa和M.oxydans，種子內(nèi)生細(xì)菌屬于B.amyloliquefaciens、S.epidermidis和M.oxydans。矮生嵩草根部內(nèi)生細(xì)菌分別屬于Promicromonosporaumidemergens和S.bauzanensis，種子內(nèi)生細(xì)菌屬于B.amyloliquefaciens、B.thuringiensis、Paenibacilluspolymyxa和M.oxydans。該結(jié)果表明，牧草內(nèi)生細(xì)菌種類豐富，具有豐富的遺傳多樣性，但在不同牧草或器官種類有差別。在上述15個(gè)內(nèi)生細(xì)菌中，6株屬于芽孢桿菌屬細(xì)菌，說明芽孢桿菌屬細(xì)菌為2種牧草內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢菌群。

圖1　牧草內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1　Phylogenetic tree of endophytic bacteria isolated from pasture based on the 16S rDNA sequence

3　討論與結(jié)論

植物內(nèi)生菌的生境特殊性決定了其既有理論研究的廣度和深度，又有廣泛的應(yīng)用潛力，是潛力巨大且尚待開發(fā)的微生物新資源。本文首次研究了線葉嵩草和矮生嵩草休眠期內(nèi)生細(xì)菌在不同部位的多樣性，矮生嵩草2011年根中內(nèi)生細(xì)菌總數(shù)為3.5×105cfu/g，種子中內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量為1.44×105cfu/g；線葉嵩草2011年休眠期根中內(nèi)生細(xì)菌總數(shù)為0.5×105cfu/g，明顯低于矮生嵩草，種子中內(nèi)生細(xì)菌數(shù)為22.27×105cfu/g，多于矮生嵩草，說明矮生嵩草根部比種子中內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量多，而線葉嵩草種子中內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量較根部多。Gagne等[31]曾認(rèn)為由于大多內(nèi)生細(xì)菌來源于根際土壤，所以根部的內(nèi)生細(xì)菌含量最高，本研究中矮生嵩草與其觀點(diǎn)一致，但是線葉嵩草種子內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量比根部數(shù)量多，這可能與牧草種類及不同器官存在差異有關(guān)[24-25]。另外，矮生嵩草2012年種子中內(nèi)生細(xì)菌數(shù)為0.134×105cfu/g，線葉嵩草2012年種子內(nèi)生細(xì)菌數(shù)為2.14×105cfu/g，2種牧草種子內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量均顯著低于2011年，說明種子存放時(shí)間影響其內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量。植物為內(nèi)生細(xì)菌提供相對穩(wěn)定的生存環(huán)境，而內(nèi)生細(xì)菌可以通過抑菌、固氮、溶磷和產(chǎn)IAA等方式促進(jìn)植物的生長。因此，利用內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行生物防治或作為生物肥料，較其他微生物制劑有顯著的優(yōu)勢。本研究表明，嵩草屬牧草內(nèi)生細(xì)菌存在著抗馬鈴薯壞疽病、馬鈴薯枯萎病和馬鈴薯炭疽病3種病原真菌的抗菌資源，可用于馬鈴薯貯藏期病害防治的潛力。牧草中還存在溶磷、固氮和產(chǎn)IAA的內(nèi)生細(xì)菌，這些菌株可能對牧草獲得營養(yǎng)及抗逆方面具有重要的生物功能，且XSG4同時(shí)具有抑菌、溶磷、產(chǎn)IAA和固氮4種能力，ASZ4具有抑菌、產(chǎn)IAA和溶磷3種能力，ASZ2具有固氮、產(chǎn)IAA和溶磷3種能力，另外，有8株菌同時(shí)具有2種生物功能，這一結(jié)果表明內(nèi)生細(xì)菌具有豐富的生物功能多樣性，也在生產(chǎn)中具有開發(fā)為微生物肥料或農(nóng)藥的潛力。

本試驗(yàn)中多功能內(nèi)生細(xì)菌XSG4和ASZ4屬于類芽孢桿菌屬的多粘類芽孢桿菌，ASZ2屬于芽孢桿菌屬，這兩個(gè)屬均為目前報(bào)道較多的內(nèi)生細(xì)菌，且具有多種可利用的生物特性。如胡飛等[32]報(bào)道的多粘類芽胞桿菌DN-1 對水稻紋枯病有較好防治效果；陳雪麗等[33]報(bào)道了多粘類芽孢桿菌BRF-1和枯草芽孢桿菌BRF-2菌懸液及其無菌代謝物不僅對黃瓜和番茄枯萎病具有較好的防治效果, 且具有明顯的促進(jìn)生長作用；郭芳芳等[34]報(bào)道的多粘類芽孢桿菌對番茄猝倒病具有較好的防治效果。本研究結(jié)果與其一致。

本研究首次對2種嵩草屬牧草休眠期內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了16S rDNA 序列分析，結(jié)果表明，高寒草地內(nèi)生細(xì)菌在不同的植物間存在差異，在同種植物的不同部位也存在差異。線葉嵩草分離到5種內(nèi)生細(xì)菌，矮生嵩草分離到6種，線葉嵩草根部分離得到的內(nèi)生細(xì)菌與矮生嵩草根部分離到的種不同，但是兩牧草種子中分離到的內(nèi)生細(xì)菌有兩種是相同的。2種牧草的內(nèi)生細(xì)菌分為7個(gè)屬8個(gè)種說明嵩草屬牧草內(nèi)生細(xì)菌具有豐富的多樣性，且芽孢桿菌屬細(xì)菌是2種牧草內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢菌群，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14,17,22-23]，這可能與芽孢桿菌屬細(xì)菌抗逆性強(qiáng)有關(guān)；另外，內(nèi)生細(xì)菌中有3個(gè)菌株在種水平及2個(gè)菌株在屬水平的分類地位需進(jìn)一步研究，說明該生境牧草內(nèi)生細(xì)菌中有新的微生物種類。本研究中內(nèi)生細(xì)菌所屬的7個(gè)屬中，只有芽孢桿菌是常見的內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢種群，其他6個(gè)屬均為不常見屬，這可能與本試驗(yàn)大多數(shù)菌株分離自高寒草地休眠期牧草根系和種子有關(guān)。本研究僅利用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌的培養(yǎng)，但許多研究已證實(shí)通過傳統(tǒng)的分離方法鑒定的微生物只占環(huán)境微生物總數(shù)的0.1%～10%[23]，不能充分展示微生物的多樣性狀況，且一部分植物內(nèi)生細(xì)菌由于人工環(huán)境不適宜而不能進(jìn)行繼代培養(yǎng)。因此，為了更全面地了解牧草內(nèi)生細(xì)菌多樣性的真實(shí)水平及其物種組成，有必要利用非培養(yǎng)方法對其組織內(nèi)未培養(yǎng)微生物進(jìn)行研究。另外，本試驗(yàn)僅利用16S rDNA 序列分析方法對內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了鑒定，還需利用生理生化試驗(yàn)及(G+C)%等進(jìn)一步鑒定。

References：

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Diversity of endophytic bacteria isolated fromKobresiaduring winter dormancy

YANG Cheng-De, WANG Yu-Qin, CHEN Xiu-Rong*, ZHANG Zhen-Fen, XUE Li, WANG Ying, YAO Yu-Ling

CollegeofPlantProtection，GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China

Twenty three strains of endophytic bacteria were isolated from the roots and seeds of dormant plants in winter of two species ofKobresia, using the dilution plate method. The isolated bacteria were identified by sequence analysis of their 16S rDNA. Then their biological properties, including antimicrobial activity, phosphorus solubilisation, nitrogen fixation and production of IAA, were determined. There were significant differences in the number of endophytic bacteria and their community composition in the roots and seeds of the twoKobresiaspecies.Kobresiacapillifoliahad a higher species diversity of endophytic bacteria thanKobresiahumilis. Endophytic bacteria were more abundant in roots than in seeds forK.humilis, but the opposite was true inK.capillifolia. The amount of endophytic bacteria was affected by the seed storage time. Twenty strains among the isolated endophytic bacteria displayed biological activity. including antimicrobial properties, phosphorus solubilisation, nitrogen fixation and production of IAA. The, numbers of strains with these respective capabilities were 35%, 55%, 45% and 25%, respectively, of the total number of bacteria. Fifteen taxa were identified among the 16S rDNA gene sequences of the endophytic bacteria isolated. They included the generaBacillus,Phyllobacterium,Staphylococcus,Paenibacillus,Microbacterium,PromicromonosporaandSphingopyxis. Among these,Bacilluswas the dominant species.

Kobresia; endophytic bacteria; identification; diversity; biological function

10.11686/cyxb2015368http://cyxb.lzu.edu.cn

楊成德, 王玉琴, 陳秀蓉, 張振粉, 薛莉, 王穎, 姚玉玲. 2種嵩草屬牧草休眠期內(nèi)生細(xì)菌多樣性研究. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 25(8): 136-144.

YANG Cheng-De, WANG Yu-Qin, CHEN Xiu-Rong, ZHANG Zhen-Fen, XUE Li, WANG Ying, YAO Yu-Ling. Diversity of endophytic bacteria isolated fromKobresiaduring winter dormancy. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(8): 136-144.

2015-07-20；改回日期：2015-10-12

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No. 31160122)資助。

楊成德(1975-)，男，甘肅武都人，副教授，博士。E-mail: yangcd@gsau.edu.cn

Corresponding author. E-mail: chenxiurong@gsau.edu.cn