馬鞭草總苷對(duì)大鼠慢性非細(xì)菌性前列腺炎的干預(yù)作用

王琳琳 李寒冰 苗明三河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南鄭州 450046

馬鞭草總苷對(duì)大鼠慢性非細(xì)菌性前列腺炎的干預(yù)作用

王琳琳 李寒冰 苗明三
河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南鄭州 450046

目的探討馬鞭草總苷（TGV）對(duì)大鼠慢性非細(xì)菌性前列腺炎（CNP）的影響。 方法將10月齡健康Wistar大鼠50只前列腺背側(cè)葉注射25%消痔靈造成CNP模型，隨機(jī)分為模型組、前列康（1000 mg/kg）組及TGV高、中、低劑量（120、60、30 mg/kg）組，每組10只，另以10只正常大鼠作為正常組。自造模后第8天起，各給藥組分別灌胃給予相應(yīng)藥物，模型組和正常組灌胃等體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)22 d。給藥結(jié)束后測(cè)定各組大鼠前列腺濕重，計(jì)算前列腺指數(shù)，檢測(cè)前列腺液中白細(xì)胞數(shù)和卵磷脂小體密度，放免法測(cè)定前列腺組織勻漿中白介素-2（IL-2）、白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的含量，HE染色觀察前列腺組織的病理學(xué)變化。 結(jié)果 與模型組比較，TGV高、中、低劑量組大鼠前列腺濕重、前列腺指數(shù)、前列腺液中白細(xì)胞數(shù)及前列腺組織IL-2、TNF-α、IL-1β水平降低，前列腺液中卵磷脂小體密度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。形態(tài)學(xué)觀察顯示：TGV對(duì)CNP大鼠前列腺組織病理學(xué)改變有一定的改善作用。 結(jié)論 TGV對(duì)消痔靈誘導(dǎo)的CNP大鼠具有良好的抑制作用，其作用機(jī)制可能與TGV下調(diào)前列腺組織IL-2、TNF-α、IL-1β水平有關(guān)。

馬鞭草總苷；慢性非細(xì)菌性前列腺炎；白介素-2；白介素-1β；腫瘤壞死因子-α

慢性非細(xì)菌性前列腺炎 （chronic nonbacterial protatitis，CNP）是成年男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見的疾病之一，患者常出現(xiàn)會(huì)陰部、盆骨區(qū)域疼痛和尿頻、尿急、尿痛、排尿不盡、排尿困難等排尿異常癥狀，甚至造成性功能不良，對(duì)患者的生活質(zhì)量影響嚴(yán)重［1］。在以慢性前列腺炎就診的臨床病例中，CNP患者占到九成以上［2］。隨著發(fā)病率的提高，該病的防治已日益為人們所重視。然而由于CNP的發(fā)病機(jī)制和病因目前尚不完全清楚，再加上病程遷延，反復(fù)發(fā)作，雖然現(xiàn)有的治療方法和藥物較多，但總體來說療效理想的較少。近年來，應(yīng)用中醫(yī)藥治療CNP的報(bào)道逐漸增多。馬鞭草又名鳳頸草、鐵馬鞭，是馬鞭草科植物馬鞭草（Verbena officinalis L.）的干燥地上部分，具有活血散瘀、截瘧、解毒、利水消腫之功效［3］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究提示，馬鞭草具有抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等多種生物活性［4］。在民間，馬鞭草被廣泛用于治療慢性前列腺炎［5］、前列腺增生［6］、尿路結(jié)石［7］等泌尿系統(tǒng)疾病，療效確切。本實(shí)驗(yàn)通過考察馬鞭草中的活性成分馬鞭草總苷（total glucosides of Verbena officinalis L.，TGV）對(duì)CNP模型大鼠前列腺指數(shù)、前列腺炎白細(xì)胞數(shù)和卵磷脂小體密度、前列腺組織病理形態(tài)及相關(guān)細(xì)胞因子的影響，探討其部分可能的機(jī)制，也為馬鞭草的進(jìn)一步研究開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性Wistar大鼠，10月齡，體重240～260 g，購于河北省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證編號(hào)：SCXK（冀）2008-1-003，飼養(yǎng)于河南中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物房溫度20～25℃，相對(duì)濕度50%～70%，12 h交替光照，分籠飼養(yǎng)，自由飲水，大鼠全價(jià)營(yíng)養(yǎng)飼料喂養(yǎng)，每日更換墊料，保持籠內(nèi)干爽清潔。

1.2 藥物與試劑

TGV（購自江蘇南京青澤醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：20090327，經(jīng)紫外分光光度法測(cè)定總環(huán)烯醚萜苷含量為50.13%）；前列康片（浙江康恩貝制藥股份有限公司，批號(hào)：20090122，規(guī)格：500 mg/片）；消痔靈注射液（北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)20070405，10mL/支）；戊巴比妥鈉（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司，批號(hào)：F20060715）；注射用青霉素鈉（華北制藥股份有限公司，批號(hào)：X0901038）；冰醋酸（開封化學(xué)試劑總廠，批號(hào)：061208）；大鼠白介素-2（IL-2）、白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）放免試劑盒（北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司，批號(hào)均為20090424）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

FA（N）/JA（N）系列電子天平（上海民橋精密儀器有限公司）；可調(diào)式移液器（上海雷勃分析儀器有限公司）；TGL-16G高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；DY89-1電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Sn-895B型智能放免γ測(cè)量?jī)x（上海原子核研究所四環(huán)儀器一廠）。BX41型奧林巴斯顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

取實(shí)驗(yàn)用大鼠50只適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，參考文獻(xiàn)［8］的方法建立CNP模型：腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥鈉實(shí)施麻醉，仰位固定，用碘伏消毒腹部皮膚，于下腹正中切口達(dá)腹腔，提出膀胱及兩側(cè)精囊，暴露膀胱前列腺背側(cè)葉，準(zhǔn)確注入25%消痔靈注射液0.2 mL/只，送復(fù)臟器，逐層肌肉、皮膚縫合，碘伏消毒傷口，待清醒后放回鼠籠飼養(yǎng)。連續(xù)3 d肌內(nèi)注射青霉素20萬U/kg，以預(yù)防感染。造模后第8天，將造模的50只大鼠隨機(jī)分為模型組、前列康組（陽性對(duì)照藥物，1000 mg/kg，相當(dāng)于成人臨床用量的8倍）和TGV高、中、低劑量組（120、60、30 mg/kg，由預(yù)實(shí)驗(yàn)確定），每組10只。另取10只未參與造模的大鼠設(shè)為正常組。各給藥組灌胃給予相應(yīng)藥物，正常組和模型組分別灌胃等體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)22 d。末次給藥1 h后，對(duì)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.5.1 前列腺濕重和前列腺指數(shù)的測(cè)定 稱體重后處死所有大鼠，迅速剖腹，剝離粘連的結(jié)締組織和脂肪組織，完整取出前列腺，用生理鹽水漂洗干凈后，稱量前列腺濕重，并計(jì)算前列腺指數(shù)。前列腺指數(shù)=前列腺濕重（mg）/體重（g）。

1.5.2 前列腺液白細(xì)胞計(jì)數(shù)和卵磷脂小體密度評(píng)分參考文獻(xiàn)［9］的方法，取前列腺按摩液10～200 μL白細(xì)胞稀釋液（1%醋酸溶液）中，用滴管吹打均勻后充于細(xì)胞計(jì)數(shù)板中，低倍鏡下計(jì)數(shù)四角上4個(gè)大方格內(nèi)的白細(xì)胞數(shù)，乘以50即為1 μL前列腺液內(nèi)的白細(xì)胞總數(shù)。另取前列腺液10 μL均勻涂片，光鏡下觀察卵磷脂小體密度，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)：滿視野4分，3/4視野3分，1/2視野2分，1/4視野1分［10］。

1.5.3 前列腺組織IL-2、IL-1β、TNF-α水平的測(cè)定［11］精密稱取200 mg前列腺組織，用眼科剪剪碎，加入生理鹽水1 mL，置于冰浴中勻漿。隨后將組織勻漿在4℃下以3000 r/min離心15 min（離心半徑70 mm）。取上清液按試劑盒說明書測(cè)定前列腺組織中IL-2、IL-1β、TNF-α水平。

1.5.4 前列腺組織形態(tài)學(xué)的觀察 取剩余前列腺組織用生理鹽水漂洗干凈，濾紙吸干表面水分，用10%甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察前列腺組織形態(tài)學(xué)變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)CNP大鼠體重、前列腺濕重和前列腺指數(shù)的影響

各組之間大鼠體重比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05），表明造模和給藥對(duì)大鼠體重增長(zhǎng)速度均無明顯影響，各組大鼠前列腺濕重和前列腺指數(shù)具有可比性。與正常組比較，模型組大鼠前列腺濕重和前列腺指數(shù)顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，TGV高、中、低劑量組和前列康組大鼠前列腺濕重和前列腺指數(shù)均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠體重、前列腺濕重及前列腺指數(shù)的比較（±s，n=10）

表1 各組大鼠體重、前列腺濕重及前列腺指數(shù)的比較（±s，n=10）

注：與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；TGV：馬鞭草總苷；“-”表示未給藥

組別 劑量［mg/（kg·d）］體重（g）前列腺濕重（mg）前列腺指數(shù)（mg/g）正常組模型組前列康組TGV高劑量組TGV中劑量組TGV低劑量組--1000 120 60 30 325.87±18.58 308.12±23.03 321.24±28.18 315.96±64.29 308.47±35.80 306.12±21.23 450.73±89.84 611.72±126.75*513.18±56.44#474.63±66.27##525.61±43.84#528.30±65.51#1.51±0.39 2.09±0.22*1.62±0.35##1.54±0.38##1.74±0.18##1.70±0.35##

2.2 對(duì)CNP大鼠前列腺液中白細(xì)胞數(shù)及卵磷脂小體密度的影響

與正常組比較，模型組大鼠前列腺液中白細(xì)胞數(shù)顯著增多（P＜0.01），卵磷脂小體密度顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，TGV高、中、低劑量組和前列康組前列腺液中白細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.01），卵磷脂小體密度顯著升高（P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠前列腺液中白細(xì)胞數(shù)、卵磷脂小體密度比較（±s，n=10）

表2 各組大鼠前列腺液中白細(xì)胞數(shù)、卵磷脂小體密度比較（±s，n=10）

注：與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；TGV：馬鞭草總苷；“-”表示未給藥

組別 劑量［mg/（kg·d）］白細(xì)胞數(shù)（×109/L）卵磷脂小體密度評(píng)分（分）正常組模型組前列康組TGV高劑量組TGV中劑量組TGV低劑量組--1000 120 60 30 2.97±0.90 7.20±1.44*2.85±0.53##3.21±0.83##3.90±1.43##4.00±0.82##3.30±0.42 1.60±0.48*2.90±0.54##3.10±0.36##2.80±0.32##2.64±0.48##

2.3 對(duì)CNP大鼠前列腺組織IL-2、IL-1β、TNF-α的影響

與正常組比較，模型組大鼠前列腺組織IL-2、IL-1β、TNF-α水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，TGV高、中、低劑量組和前列康組大鼠前列腺組織IL-2、IL-1β、TNF-α的水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠前列腺組織IL-2、IL-1β、TNF-α水平比較（±s，n=10）

表3 各組大鼠前列腺組織IL-2、IL-1β、TNF-α水平比較（±s，n=10）

注：與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；TGV：馬鞭草總苷；IL-2：白介素-2；IL-1β：白介素-1β；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；“-”表示未給藥

組別 劑量［mg/（kg·d）］IL-2 （ng/mL）IL-1β （ng/mL）TNF-α （ng/mL）正常組模型組前列康組TGV高劑量組TGV中劑量組TGV低劑量組--1000 120 60 30 1.10±0.20 2.12±0.87*1.40±0.29#1.37±0.33#1.46±0.34#1.39±0.33#0.032±0.006 0.134±0.066*0.043±0.021##0.042±0.023##0.059±0.053#0.083±0.037#0.461±0.122 1.494±0.357*0.680±0.171##0.694±0.235##0.799±0.212##0.906±0.232##

2.4 對(duì)CNP大鼠前列腺組織形態(tài)的影響

光鏡下觀察各組大鼠前列腺組織切片，正常組前列腺腺體形態(tài)正常，腺腔大小均勻，腺腔內(nèi)大量粉染的分泌物，間質(zhì)未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維組織增生；模型組腺腔明顯縮小，部分腺腔閉鎖呈實(shí)體狀，腺腔內(nèi)分泌物減少甚至消失，間質(zhì)水腫增寬，間質(zhì)內(nèi)可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維組織增生明顯。前列康組和TGV高劑量組前列腺腺腔擴(kuò)大，腺腔內(nèi)分泌物增多，間質(zhì)內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維組織增生少見；TGV中劑量組腺腔部分恢復(fù)正常，部分腺腔內(nèi)分泌物增多，間質(zhì)內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕，纖維組織增生也明顯減少；TGV低劑量組病理表現(xiàn)與模型組相似。見圖1。

圖1 大鼠前列腺組織HE染色結(jié)果（100×）

3 討論

CNP病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制還不確定，可能是多種因素綜合作用的結(jié)果。近年來研究發(fā)現(xiàn)，慢性炎癥的

病理改變大多是繼細(xì)菌感染后刺激機(jī)體所發(fā)生的免疫反應(yīng)所致，與細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)的異常改變密切相關(guān)［13］。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)［14-15］，慢性前列腺炎患者前列腺液或者精液中IL-2、TNF-α、IL-1β水平顯著高于正常人，證明IL-2、TNF-α、IL-1β確實(shí)參與了慢性前列腺炎的疾病過程。IL-2是由活化T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一種重要的細(xì)胞因子，與細(xì)胞表面受體結(jié)合后，可激發(fā)細(xì)胞增殖信號(hào)并誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的活化與增殖，在清除致病物的同時(shí)，亦可產(chǎn)生正常組織損傷［16-17］。IL-1β是由單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和其他類型細(xì)胞在應(yīng)答感染時(shí)產(chǎn)生的細(xì)胞因子，通過核因子κB（NF-κB）使巨噬細(xì)胞和其他細(xì)胞分泌其他細(xì)胞因子，并產(chǎn)生氧自由基、蛋白酶、花生四烯酸等代謝產(chǎn)物，致使內(nèi)皮細(xì)胞受損，炎癥癥狀加重［18］。TNF-α作為重要的促炎性細(xì)胞因子，能提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞及淋巴細(xì)胞表達(dá)多種黏附分子，誘導(dǎo)趨化因子產(chǎn)生，介導(dǎo)炎癥細(xì)胞向炎癥局部聚集，造成炎癥、纖維細(xì)胞增生、組織損傷等病理變化［19-20］。因此，通過檢測(cè)前列腺組織IL-2、TNF-α、IL-1β的表達(dá)水平，可以評(píng)價(jià)慢性前列腺炎的治療效果。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TGV能顯著降低CNP大鼠前列腺組織中IL-2、TNF-α、IL-1β的水平，控制炎性細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大，從而減輕炎性反應(yīng)。

TGV是馬鞭草中的主要活性部位，以環(huán)烯醚萜苷類物質(zhì)為主要成分。本研究通過前列腺背側(cè)葉注射消痔靈的方法誘導(dǎo)制備CNP大鼠模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，TGV能有效降低CNP大鼠前列腺濕重、前列腺指數(shù)、升高前列腺液卵磷脂小體密度，恢復(fù)前列腺腺體形態(tài)，減輕間質(zhì)水腫、炎細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維組織增生，顯著改善CNP的癥狀，提示TGV對(duì)CNP具有較好的治療作用，其機(jī)制可能與抑制前列腺局部IL-2、TNF-α、IL-1β等促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生有關(guān)。

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Effect of total glucosides of Verbena officinalis L.on rat model for chronic nonbacterial prostatitis

WANG Linlin LI Hanbing MIAO Mingsan
College of Pharmacy，He'nan University of Traditional Chinese Medicine，He'nan Province，Zhengzhou 450046，China

Objective To investigate the effect of total glucosides of Verbena officinalis L.（TGV）on rat model for chronic nonbacterial prostatitis（CNP）.Methods CNP model was established by injection of 25% Xiaozhiling through dorsal part of prostate for 50 healthy Wistar rats aged 10 months，the rats were randomly divided into 5 groups，which were model group，Qianliekang （1000 mg/kg）group，high-dose，middle-dose，low-dose （120，60，30 mg/kg）of TGV group，with 10 rats in each group.Besides，10 normal rats were recruited as normal group.Since the 8th day of modeling，the rats of each administered group have been treated with corresponding medicine by intragastric administration，the model group and normal group were given same volume of normal saline by intragastric administration，once daily，for 22 consecutive days.After delivery，the wet weight and prostate index in rat prostate were measured and calculated，and the number of white blood cells and the density of lecithin body in prostatic fluid were observed，the levels of interleukin-2（IL-2），interleukin-1β（IL-1β）and tumor necrosis factor-α（TNF-α）in prostate tissue of rats were detected by radioimmunoassay，and the rat prostate tissue morphology changes were observed by light microscopy after treatment. Results Compared with model group，the wet weight of prostate，the prostate index，the number of white blood cells in prostatic fluid，and the levels of IL-2，IL-1β，TNF-α in prostate tissue of the high-dose，middle-dose，low-dose of TGV group were decreased，and the density of lecithin body in prostatic fluid was increased，the differences were statistically significant（P＜0.01 or P＜0.05）.Morphological observation indicated that TGV could improve pathological conditions of prostate tissue of CNP rats to some extent.Conclusion TGV has certain therapy effect on CNP rats induced by Xiaozhiling，which may be related to its regulating the levels of IL-2，IL-1β and TNF-α.

Total glucosides of Verbena officinalis L.；Chronic nonbacterial prostatitis；Interleukin-2；Interleukin-1β；Tumor necrosis factor-α

R697.3

A

1673-7210（2016）06（a）-0004-04

2016-02-03本文編輯：張瑜杰）

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81173474）；河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目（16A350017）；河南中醫(yī)學(xué)院苗圃工程項(xiàng)目（MP2011-06）。

王琳琳（1983.2-），女，中藥學(xué)碩士；研究方向：中藥藥理學(xué)。

苗明三（1965.3-），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥新藥研究與開發(fā)。