對甜菜夜蛾具有殺蟲活性的Bt菌株cry1Ca基因研究

王　楊,　周子珊,　劉永磊,　韓　榕,　張林靜*,　張　杰*

(1. 山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,臨汾　041004; 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京　100193)

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對甜菜夜蛾具有殺蟲活性的Bt菌株cry1Ca基因研究

王楊1,2,周子珊2,劉永磊2,韓榕1,張林靜1*,張杰2*

(1. 山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,臨汾041004; 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100193)

根據(jù)已報道的14個cry1Ca基因,設(shè)計能夠擴(kuò)增cry1Ca全長基因的簡并引物。利用該引物對本實(shí)驗(yàn)室分離的472株Bt菌株進(jìn)行篩選。PCR擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)22株菌含有cry1Ca基因。對22株菌株進(jìn)行cry基因多樣性分析,結(jié)果獲得5種類型酶切圖譜,表明這些菌株分為5種類型。SDS-PAGE結(jié)果顯示22株菌均表達(dá)約130 ku的蛋白。Western Blotting結(jié)果證實(shí)這些株菌中cry1Ca基因均正常表達(dá)。提取菌株的晶體蛋白,經(jīng)胰蛋白酶活化,對甜菜夜蛾[Spodopteraexigua(Hübner)]進(jìn)行初步生測,結(jié)果表明22株菌中活化的Cry蛋白對甜菜夜蛾均表現(xiàn)出很強(qiáng)的毒殺作用。進(jìn)一步從5個類型的菌中各挑選一株毒力較高的菌株進(jìn)行LC50的測定,結(jié)果證實(shí)它們均具有很高毒力,其中,T1-E12(0.087 μg/g)、B16-C8(0.103 μg/g)、T1-B8(0.202 μg/g)的活性與陽性對照菌株G03(0.090 μg/g)相當(dāng),具有生產(chǎn)應(yīng)用潛力。本研究為新型高效Bt菌株的挖掘奠定了基礎(chǔ)。

蘇云金芽胞桿菌;cry1Ca基因;甜菜夜蛾;致死中濃度

甜菜夜蛾[Spodopteraexigua(Hübner)]屬鱗翅目夜蛾科,作為一種世界性的多食性害蟲,長期為害包括棉花、番茄、大豆等在內(nèi)的重要經(jīng)濟(jì)作物[1]。在中國,甜菜夜蛾的為害程度日趨嚴(yán)重,給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失[2]。由于化學(xué)殺蟲劑的濫用,已導(dǎo)致害蟲抗性上升、環(huán)境污染等嚴(yán)重后果。因此,亟待加強(qiáng)Bt等生物農(nóng)藥的研究和利用。

蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis,簡稱Bt),是一種能夠特異性毒殺害蟲的革蘭氏陽性細(xì)菌,殺蟲活性主要由cry基因所編碼的殺蟲蛋白起作用[3]。由于Bt殺蟲蛋白具有對靶標(biāo)害蟲特異性毒殺以及對非靶標(biāo)生物如小鼠、人等哺乳動物安全、無毒害等特點(diǎn)[4-5],已經(jīng)成為世界上應(yīng)用最為廣泛的微生物殺蟲劑[6-7]。1988年第一個cry1Ca基因被克隆,1990年Honée首次報道了這個cry1Ca基因表達(dá)產(chǎn)物對甜菜夜蛾具有高毒殺作用[8]。迄今為止,全球已有14個cry1Ca基因公布,來自我國的cry1Ca基因數(shù)量達(dá)到8個(Bt殺蟲蛋白國際命名委員會網(wǎng)站—http:∥www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)。國內(nèi)多家單位先后篩選出對甜菜夜蛾高毒力的Bt菌株,如S18-4[9]、WY-190[10]和Hcy系列[11]、CZE99985[12]、G03[13]等菌株。

本實(shí)驗(yàn)室在前期篩選對甜菜夜蛾高毒力菌株的基礎(chǔ)上[14],繼續(xù)加大力度,采用菌株分型結(jié)合PCR-RFLP技術(shù),選取了已報道對甜菜夜蛾具有高毒力的cry1Ca基因[8,15-16]作為切入點(diǎn),對我們近兩年新分離的Bt菌株進(jìn)行活性篩選與基因鑒定,發(fā)掘?qū)μ鸩艘苟昃哂懈咝⑾x活性的菌株,發(fā)現(xiàn)了一批高毒力菌株,這些菌株的共同特點(diǎn)就是都含有cry1Ca基因。本研究為高效毒殺甜菜夜蛾的Bt菌株的發(fā)掘與利用創(chuàng)造了條件。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1研究菌株來源

472株野生Bt菌株為本實(shí)驗(yàn)室從國內(nèi)土壤中分離、篩選并保存。

陽性對照菌株:HD-1Ca7(cry1Ca7基因轉(zhuǎn)入HD 73-工程無晶體突變株),以及G03野生Bt菌株,含有cry1Aa、cry1Ac、cry1Ca、cry2Ab基因,是由河北農(nóng)林科學(xué)院植保所分離,對甜菜夜蛾等夜蛾科害蟲具有高毒力。

1.1.2培養(yǎng)基

液體LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨 1%,酵母抽提物0.5%,NaCl 1%,pH調(diào)至7.0,121 ℃滅菌20 min。

液體1/2 LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨 0.5%,酵母抽提物 0.25%,NaCl 0.5%,調(diào)pH至7.0,121 ℃滅菌20 min。

1.1.3試蟲及人工飼料來源

甜菜夜蛾試蟲由武漢科諾生物科技股份有限公司提供;甜菜夜蛾試蟲人工飼料由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所棉花害蟲組提供。

1.1.4主要生化試劑

引物由上海生工生物工程股份有限公司合成;核酸聚合酶、限制性內(nèi)切酶以及標(biāo)準(zhǔn)DNA、蛋白marker購自大連TaKaRa寶生物工程有限公司;胰蛋白酶(1∶250)購自北京索萊寶生物科技有限公司;第一抗體:小鼠來源單抗,購自美國一龍(Envirologix)公司;第二抗體:HRP標(biāo)記的羊抗鼠單抗,購自美國Sigma公司;顯色液:SuperSignal?West Pico Chemiluminescent Substrate試劑盒購自Thermo Scientific公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1cry1Ca基因簡并引物設(shè)計

通過從Bt殺蟲蛋白國際命名委員會網(wǎng)站—http:∥www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/網(wǎng)址查詢獲得目前已報道的cry1Ca第4等級基因共有14個,除cry1Ca10、cry1Ca14外的12條基因編碼序列能夠通過GenBank登錄號從NCBI上下載;將12條基因序列進(jìn)行多序列比對,設(shè)計出能夠擴(kuò)增cry1Ca基因全長的簡并引物。

設(shè)計引物序列,上游引物5′-ATGGAGGAAAATAATCAAAATC-3′,下游引物5′-ATTASTCCTTATGGAGGAATAA-3′。

1.2.2Bt菌株基因組DNA的提取

基因組DNA提取參考張彥蕊等[17]的方法。

1.2.3Bt菌株cry1Ca基因鑒定

對472個基因組進(jìn)行分組,以5～7個菌株基因組混合作為一組模板,利用cry1Ca基因簡并引物首先進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增,然后對能夠擴(kuò)增出信號的混合基因組再分別進(jìn)行第二輪篩選,最終確定到菌株。

PCR擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性45 s,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸3.5 min,30次循環(huán);72 ℃延伸10 min。

PCR反應(yīng)體系:2×PCRTaqMixture 10 μL,引物(10 μmol/L)各1 μL,DNA模板1 μL,超純水7 μL,總計20 μL體系。

1.2.4cry1Ca基因的擴(kuò)增、克隆與測序分析

包括Cry1Ca原毒素在內(nèi)的所有130 ku Cry蛋白都包含一個位于N末端、600氨基酸的活性區(qū)域[18](C末端與殺蟲作用無關(guān))。因此從基因的5′端到約2.2 kb設(shè)計引物,利用PrimeStar高保真聚合酶擴(kuò)增,產(chǎn)物連接載體送測序。設(shè)計引物序列:上游引物5′-ATGGAGGAAAATAATCAAAATC-3′,下游引物5′-AATTAAAAGCTTATACCCGT-3′。

PCR擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性45 s,50 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,35次循環(huán);72 ℃延伸10 min。

PCR反應(yīng)體系:2×PrimeStar 10 μL,引物(10 μmol/L)各1 μL,DNA模板1 μL,超純水7 μL,總計20 μL體系。

測序交由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.5菌株晶體形態(tài)觀察

利用1/2 LB培養(yǎng)基對供試菌株培養(yǎng)30 h,BX 63顯微鏡(日本Olympus)進(jìn)行100×油鏡觀察并拍照,具體方法參見文獻(xiàn)[19]。

1.2.6菌株cry基因多樣性分析

采用PCR-RFLP技術(shù)對篩選出的野生菌株進(jìn)行cry基因類型的多樣性分析;簡并引物及PCR-RFLP流程參考束長龍建立的方法[20]。該對簡并引物是作者根據(jù)多類cry基因的保守區(qū)同源序列經(jīng)過聚類分析所設(shè)計,利用HinfⅠ限制性內(nèi)切酶對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切,能夠展示出不同帶型的酶切圖譜,有助于對不同Bt菌株的cry基因組成進(jìn)行差別鑒定。

參考引物序列:上游引物con_1f序列5′-TATGCWCAAGCWGCCAATYTWCATYT-3′,下游引物con_5r序列5′-GGRATAAATTCAATTYKRTCWA-3′。

PCR擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min,38 ℃退火2 min,72 ℃延伸2 min,30次循環(huán);72 ℃延伸10 min。

PCR反應(yīng)體系:2×PCRTaqMixture 15 μL,引物(10 μmol/L)各1 μL,DNA模板1 μL,超純水12 μL,總計30 μL。

PCR酶切體系:PCR產(chǎn)物10 μL,酶切緩沖液3 μL,HinfⅠ 1 μL,超純水16 μL,37 ℃反應(yīng)2 h。

1.2.7Cry蛋白提取、胰蛋白酶消化以及定量

菌株Cry蛋白提取采用1/2 LB液體培養(yǎng)基、重復(fù)溶解的方法進(jìn)行提取,具體詳見Zhou等的方法[19]。菌株提取Cry蛋白的SDS-PAGE分析參考薩姆布魯克等[21]的方法進(jìn)行;并以1.0 μg(濃度為0.2 mg/mL)牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白進(jìn)行條帶定量,定量采用圖像分析軟件(Image J)測定電泳條帶灰度值,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)BSA濃度計算Cry蛋白濃度。參考Bravo文獻(xiàn)[22]選擇胰蛋白酶(1∶250)對提取的Cry蛋白進(jìn)行消化:按照質(zhì)量比1∶10(胰蛋白酶∶Cry蛋白質(zhì))加入胰蛋白酶,37 ℃下消化2 h,繼而對消化蛋白條帶進(jìn)行SDS-PAGE分析、定量。

1.2.8Western Blotting對篩選菌株cry1Ca基因表達(dá)檢測

對供試菌株所提取Cry蛋白的消化產(chǎn)物進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳:2塊凝膠重復(fù),其中1塊作為平行膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色,另一塊用于Western Blotting分析。利用eBlot快速轉(zhuǎn)印儀(中國Genscript)10 min將膠上蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,5%脫脂奶粉(1×TBS-T溶解)室溫封閉2 h;1×TBS-T漂洗3次,每次10 min;加入TBS-T稀釋的鼠抗Cry1Ca蛋白單克隆抗體(1∶1 000),室溫孵育1 h;1×TBS-T漂洗3次,每次10 min;加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗(1∶2 000),室溫孵育1 h;1×TBS-T漂洗3次,每次10 min;膜上加顯色液,利用ImageQuant LAS 4000 mini凝膠成像儀(美國GE Healthcare)進(jìn)行曝光、拍照。

1.2.9甜菜夜蛾殺蟲活性的測定

甜菜夜蛾殺蟲活性的初步測定:處理組樣品為所篩選22株野生Bt菌株、對照菌株G03、HD-1Ca7菌株提取的Cry蛋白,共計24組;添加一定比例胰蛋白酶的50 mmol/L Na2CO3(pH=10.0)溶液設(shè)立為陰性對照組。按照10 g/重復(fù)稱取人工飼料分別置于規(guī)格為60 mm的培養(yǎng)皿中,分別加入1 mL待測樣品溶液,并將其充分混合均勻。每處理組設(shè)初始濃度70 μg/g、1/10初始濃度7 μg/g,每個濃度2個重復(fù),每重復(fù)接初孵試蟲30頭。完成分裝并放置于26 ℃光照培養(yǎng)箱(光周期L∥D=12 h∥12 h)進(jìn)行為期7 d的培養(yǎng)。每天檢查培養(yǎng)箱內(nèi)溫度、相對濕度及飼料是否變質(zhì);到期分別調(diào)查試蟲死、活蟲數(shù)目,統(tǒng)計并計算校正死亡率[23]。校正死亡率計算公式如下:

校正死亡率(%)=[(處理組死亡率-對照組死亡率)/(1-對照組死亡率)]×100%。

菌株LC50值測定:選擇對照菌株G03、HD-1Ca7菌株以及經(jīng)PCR-RFLP分析、cry基因組成有差異的菌株進(jìn)行復(fù)篩;LC50梯度設(shè)立6.000、2.000、0.667、0.222、0.074、0.025 μg/g共6個濃度,每個濃度3個重復(fù),每重復(fù)接30頭初孵試蟲,其他流程同初篩。參考Vincent[24]的方法,利用SPSS 13.0軟件進(jìn)行LC50值的計算。

2　結(jié)果與分析

2.1含有cry1Ca基因菌株鑒定與測序分析

利用所設(shè)計引物對472個提取的野生Bt菌株基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增,經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳,最終篩選發(fā)現(xiàn)22株野生Bt菌株能夠擴(kuò)增出大小為3 570 bp的明顯條帶(圖1)。測序結(jié)果同已知的cry1Ca基因進(jìn)行比對,結(jié)果發(fā)現(xiàn)22條基因5′端到約2.2 kb序列同cry1Ca7基因的活性區(qū)域序列完全相同。

圖1　22株Bt菌株中cry1Ca基因PCR擴(kuò)增鑒定結(jié)果Fig.1 Amplification results of cry1Ca gene from 22 Bt isolates by PCR

2.2菌株晶體形態(tài)觀察

對22株Bt菌株進(jìn)行光學(xué)顯微鏡晶體形態(tài)觀察,發(fā)現(xiàn)這22株菌株晶體均呈現(xiàn)出與參照菌株G03一致的雙錐體形(圖2)。

圖2　部分Bt菌株晶體形態(tài)的光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果Fig.2 Morphology of partial Bt isolates under optical microscope

2.3利用PCR-RFLP對篩選菌株進(jìn)行cry基因多樣性鑒定

利用該對簡并引物對22株野生菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果顯示從這些菌株基因組中均能夠擴(kuò)增出一條大小約為1.4 kb的明顯條帶(圖3a);繼而對擴(kuò)增的1.4 kb條帶進(jìn)行HinfⅠ限制性內(nèi)切酶酶切,經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果展示出不同酶切圖譜(圖3b)。對酶切圖譜條帶數(shù)目以及大小進(jìn)行分析,確定這22個樣品酶切帶型匯總為5類(圖3c),其中類型1對應(yīng)菌株為B16-C8;類型2對應(yīng)菌株為C12-C8、T1-A2、T1-A5、T1-D7、T1-F10、T3-C12、T3-E10、T4-C10、T5-E8共9株;類型3對應(yīng)菌株為T1-B8;類型4為T1-E12、T1-F1、T2-C8、T2-D2、T2-C12、T2-D10、T3-A8共7株;類型5為B15-B4、T1-E10、T1-E9、T2-C5共4株。G03菌株P(guān)CR-RFLP結(jié)果(圖3d),其酶切圖譜與類型2相似。

圖3　22株Bt菌株cry基因PCR-RFLP鑒定結(jié)果Fig.3　Identification results of cry genes of 22 Bt isolates by PCR-RFLP

2.4Cry蛋白提取、消化、定量

對供試菌株提取的Cry蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析,結(jié)果顯示菌株均表達(dá)分子量大小約為130 ku的蛋白(圖4)。按照條帶掃描情況計算出了Cry蛋白濃度;利用胰蛋白酶按照比例消化原毒素,圖5是2 h消化結(jié)果,130 ku消失,蛋白條帶集中于60 ku附近,并完成了消化條帶的定量計算。

2.5Western Blotting分析結(jié)果

利用Cry1Ca抗體對Cry蛋白消化產(chǎn)物進(jìn)行Western Blotting分析,結(jié)果顯示,樣品在60 ku均獲得較好雜交條帶(圖6 b),與Cry1Ca陽性對照一致。

圖4　部分Bt菌株提取Cry蛋白原毒素的SDS-PAGE分析Fig.4 Partial results of SDS-PAGE analysis of protoxin extracted from screened Bt strains

圖5　胰蛋白酶活化Cry蛋白樣品分析結(jié)果Fig.5 Analysis of Cry protein digested with trypsin

2.6甜菜夜蛾殺蟲活性的測定結(jié)果

經(jīng)定量計算的Cry蛋白消化產(chǎn)物,取終濃度為70、7 μg/g分別對甜菜夜蛾進(jìn)行初步生測,結(jié)果說明供試菌株對甜菜夜蛾均有較高毒力(表1);在70 μg/g濃度下,22株菌株校正死亡率在96%以上(19株菌同對照菌株G03、HD-1Ca7,校正死亡率為100%),且存活蟲體大小同初孵,無明顯增長;7 μg/g濃度下,有18株菌校正死亡率在90%以上,3株菌校正死亡率在84%～90%之間,1株為75.4%。

圖6　Western Blotting分析結(jié)果Fig.6　Analysis of Cry1Ca proteins by Western Blotting

菌株Strain70μg/g死亡率/%Mortality校正死亡率/%Correctedmortality7μg/g死亡率/%Mortality校正死亡率/%Correctedmortality菌株Strain70μg/g死亡率/%Mortality校正死亡率/%Correctedmortality7μg/g死亡率/%Mortality校正死亡率/%CorrectedmortalityB16-C8100.0100.096.796.5T2-C8100.0100.096.796.5C12-C898.298.194.794.4T2-D2100.0100.098.598.4T1-A2100.0100.095.094.7T2-C12100.0100.098.398.2T1-A5100.0100.096.696.4T2-D10100.0100.096.896.6T1-D7100.0100.076.775.4T3-A8100.0100.098.398.2T1-F10100.0100.085.584.7B15-B4100.0100.098.498.3T3-C12100.0100.089.889.2T1-E10100.0100.090.389.8T3-E10100.0100.0100.0100.0T1-E9100.0100.0100.0100.0T4-C10100.0100.093.493.0T2-C5100.0100.095.094.7T5-E8100.0100.096.796.5G03(CK+)100.0100.088.387.7T1-B8100.0100.0100.0100.0HD-1Ca7(CK+)100.0100.098.398.2T1-E1296.896.696.696.4Na2CO3(CK-)5.2—T1-F198.498.396.696.4

1) 左欄22個Bt菌株樣品從上至下按照5類PCR-RFLP酶切圖譜以虛線相隔,進(jìn)行排序。Na2CO3: 50 mmol/L, pH=10.0。

22 Bt isolates in the left column are sorted from top to bottom by 5 patterns of restriction fragment which are separated by dotted line. Na2CO3: 50 mmol/L, pH=10.0.

根據(jù)初步生測活性結(jié)果并結(jié)合基因鑒定酶切圖譜差異分析,從5個類型Bt菌株中各選取1株毒力高的為代表(B16-C8、C12-C8、T1-B8、T1-E12、T1-E10)進(jìn)行LC50測定;生測結(jié)果表明(表2),T1-E12(0.087 μg/g)、B16-C8(0.103 μg/g)、T1-B8(0.202 μg/g)的活性很高,與陽性對照菌株G03(0.090 μg/g)相當(dāng);而菌株C12-C8(0.610 μg/g)、T1-E10(0.677 μg/g)的LC50接近,毒力分別比對照菌株G03低6.8倍和7.5倍。

表2　Bt活化毒素對甜菜夜蛾生物活性測定結(jié)果Table 2　Bioassay results of Bt toxins against the larvae of Spodoptera exigua

3　討論

70多年來,Bt菌株作為微生物殺蟲劑已經(jīng)取得了巨大的成功[6]。雖然Bt在生物農(nóng)藥中所占比例最高,但整個生物農(nóng)藥在農(nóng)藥中所占比重還非常小,因此針對甜菜夜蛾等重要害蟲新型高效Bt菌株的挖掘仍然有很大的發(fā)展空間。

本研究以對甜菜夜蛾高毒力的cry1Ca基因鑒定入手,從472株野生Bt菌株中成功篩選到22株包含cry1Ca基因的野生Bt菌株,并通過Western Blotting分析證實(shí)了這些cry1Ca基因的表達(dá)。利用本實(shí)驗(yàn)室近期建立的、基于PCR-RFLP技術(shù)進(jìn)行菌株分型[20],將這些菌株分為5種類型。在此基礎(chǔ)上,篩選到T1-E12、B16-C8和T1-B8三個菌株,它們對甜菜夜蛾幼蟲的活性與陽性對照G03菌株相當(dāng)。G03菌株是由河北農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所在執(zhí)行“八五”攻關(guān)項目期間分離獲得的,對甜菜夜蛾、棉鈴蟲等夜蛾科以及小菜蛾、亞洲玉米螟等害蟲具有高毒力。目前,該菌株已經(jīng)作為受體菌構(gòu)建了對鱗翅目、鞘翅目害蟲的工程菌株,并于2014年12月獲得農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的轉(zhuǎn)基因生物生產(chǎn)應(yīng)用證書[13],正在進(jìn)行農(nóng)藥登記。這3個高毒力菌株的獲得,將豐富我國殺蟲菌株資源,為新型Bt生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。

cry1Ca第四等級基因自1988年到2015年共報道14個(其中由中國提交的基因有8個,占57.1%);而cry1Ac第四等級基因從1985年到2015年,共報道發(fā)現(xiàn)38個(其中由中國提交的基因有16個,占42.1%)(Bt殺蟲蛋白國際命名委員會網(wǎng)站http:∥www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/),cry1Ca基因的總數(shù)遠(yuǎn)低于cry1Ac基因。從基因鑒定的層面發(fā)現(xiàn),在野生Bt菌株中的豐度和分布,前者遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于后者[25-26]。由此推測:在自然界中,cry1Ca基因可能比cry1Ac基因更加保守,而且在自然界中分布有限。本文研究結(jié)果也印證了這一點(diǎn):472個菌株僅有22個菌株含有cry1Ca基因,而且5種類型的22個菌株中的cry1Ca基因全部為cry1Ca7。因此若要挖掘新型cry1Ca基因仍需付出更大的努力。

Western Blotting結(jié)果證明這些菌株中cry1Ca基因都表達(dá)了Cry1Ca蛋白,生物活性測定結(jié)果顯示供試菌株活化蛋白展示了很高的殺蟲活性;但是這樣的高活性是僅僅來自于Cry1Ca蛋白的單獨(dú)貢獻(xiàn),還是其他Cry蛋白協(xié)同增效,仍然需要進(jìn)一步深入研究。

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(責(zé)任編輯：田喆)

Analysis ofcry1Cagene fromBacillusthuringiensisstrains with high insecticidal activity againstSpodopteraexigua

Wang Yang1,2,Zhou Zishan2,Liu Yonglei2,Han Rong1,Zhang Linjing1,Zhang Jie2

(1. School of Life Sciences, Shanxi Normal University, Linfen041004, China;2. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing100193, China)

One pair of degenerate primers, designed based upon the 14 known sequences ofcry1Cagenes, was used to identifycry1Cagenes from 472 wild isolates ofBacillusthuringiensisscreened in our laboratory, and there were 22 isolates containingcry1Cagenes. Five patterns of restriction fragment were obtained by the analysis ofcrygene diversity depended on PCR-RFLP, indicating that 22B.thuringiensisisolates could be classified as five types. SDS-PAGE analysis results showed that a main protein band with approximate 130 ku molecular mass was detected in each strain. Western Blotting analysis results also demonstrated that Cry1Ca proteins were expressed normally in all of the 22 strains. The preliminary bioassay was conducted with trypsin-activated Cry proteins extracted from 22 Bt isolates against the neonate larvae ofSpodopteraexigua(Hübner). The results showed that all of these strains hade high insecticidal activity against target larvae. The LC50values of the five selected Bt isolates representing five types againstS.exiguawere measured, and the results indicated that the toxicity of the five strains was very high; the insecticidal activity of the strains T1-E12 (0.087 μg/g), B16-C8 (0.103 μg/g) and T1-B8 (0.202 μg/g) was similar to that of the positive strain G03 (0.090 μg/g), and these strains have great potential for commercialization. Our findings will lay the foundation for discovery of novelB.thuringiensisisolates.

Bacillusthuringiensis;cry1Cagene;Spodopteraexigua;LC50

2015-03-16

2015-04-12

國家“863”計劃(2011AA10A203)；轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(2014ZX08009-003-001-004)

E-mail:jzhang@ippcaas.cn; linjingzh@aliyun.com

S 476.11

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.02.004

致謝：感謝武漢科諾生物科技股份有限公司劉華梅博士提供甜菜夜蛾試蟲,感謝中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所棉花害蟲研究組梁革梅研究員提供人工飼料