正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化屈曲花總黃酮的超聲波輔助提取工藝

鄧思節(jié),漢斯·格里格森

(重慶大學(xué)生物工程學(xué)院,生物流變科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400044)

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正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化屈曲花總黃酮的超聲波輔助提取工藝

鄧思節(jié),漢斯·格里格森*

(重慶大學(xué)生物工程學(xué)院,生物流變科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400044)

本文采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計法優(yōu)化了超聲波輔助提取屈曲花總黃酮的工藝條件。首先,通過單因素實(shí)驗(yàn)研究乙醇濃度、提取時間、料液比和超聲波功率對總黃酮得率的影響。然后,利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計法優(yōu)化最佳提取工藝。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,乙醇濃度對屈曲花總黃酮得率的影響最大,其次依次為提取時間、料液比、超聲波功率。最佳的提取條件為乙醇濃度85%、料液比1∶70、提取時間15 min、超聲波功率100 W。在該條件下,總黃酮得率為2.456%。本文為工業(yè)化應(yīng)用提供了參考標(biāo)準(zhǔn),也為廣泛開發(fā)利用屈曲花藥物資源提供了良好的參考價值。

屈曲花,黃酮,超聲波輔助提取,正交實(shí)驗(yàn)

屈曲花(Iberisamara)為十字花科屈曲花屬一年生草本植物[1-2],又名珍珠球、蜂室花等,原產(chǎn)于南歐,主要集中在地中海區(qū)域[1],目前已由人工引種栽培。研究表明,屈曲花鮮植株中富含多種活性成分[1,3-5],如有機(jī)胺類、芥子油甙類和黃酮類物質(zhì)[2-3]。黃酮類物質(zhì)屬于天然多酚類抗氧化劑,可有效清除體內(nèi)的氧自由基,減緩衰老,也可預(yù)防癌癥,而且還具有一定的抗菌作用[6]。因此,無論是在藥物還是在保健食品方面,屈曲花都有著廣闊的應(yīng)用前景。

提取植物中黃酮類物質(zhì)時,影響總黃酮得率的因素很多,而且在同一因素的不同水平下的總黃酮得率也會有很大差別。因此,需要綜合考慮選擇恰當(dāng)?shù)姆椒▉韮?yōu)化提取工藝。傳統(tǒng)的提取中草藥黃酮類物質(zhì)的方法主要有乙醇浸提法[7]、乙醇加熱回流提取法[8]、索氏回流法提取[8-9]等。這些方法雖然成本低、操作簡單,但是存在著損失大、周期長、工序繁瑣、得率低等缺點(diǎn)。近年來出現(xiàn)了許多新工藝,如超聲輔助提取[10]、微波輔助提取[11]、超高壓提取[12]等。這些新工藝的應(yīng)用使得中草藥的提取既符合傳統(tǒng)的中醫(yī)理論,也使得有效成分的得率提高和達(dá)到了純度提高的目的。相比之下,超聲輔助提取不僅高效低廉,而且更易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

目前還沒有對屈曲花總黃酮提取工藝研究的報道。綜合考慮,本文利用超聲波輔助提取屈曲花中的總黃酮,并采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計對乙醇濃度、料液比、提取時間以及超聲功率這四個因素進(jìn)行驗(yàn)證和全面優(yōu)化,以確定最佳提取工藝。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

屈曲花種子廣州田野風(fēng)園林綠化有限公司,干燥、粉碎后過60目備用;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品Sigma公司;95%乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為國產(chǎn)分析純。

KEUV-8500紫外可見分光光度計上海坤科儀器設(shè)備有限公司;SB-5200DTD超聲清洗儀蘇州江東精密儀器有限公司;FW100萬能高速粉碎機(jī)天津市泰斯特儀器有限公司;FA1204B電子天平上海精密科學(xué)儀器有限公司;FD-1D-50壓蓋掛瓶型真空冷凍干燥機(jī)北京醫(yī)博康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;CS101-3ANB電熱鼓風(fēng)干燥箱重慶永生實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液與標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.1.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱取120 ℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg,置于100 mL容量瓶中,加30%乙醇適量,超聲處理使溶解,放冷。稀釋、定容為0.10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密量取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 mL分別置入7只25 mL容量瓶中,各加水至6 mL,加5% NaNO2溶液1 mL,搖勻,靜置6 min;加10% Al(NO3)3溶液1 mL,搖勻,靜置6 min;加入4% NaOH溶液10 mL,定容至刻度,搖勻,放置15 min后立即在510 nm波長處測定吸光度(A),空白為不加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。以吸光度為橫坐標(biāo),濃度(C,mg/mL)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2樣品的制備與樣品中總黃酮的測定屈曲花種子原材料于60 ℃的烘箱中干燥48 h后,用萬能粉碎機(jī)將其粉碎,然后真空冷凍干燥成粉,貯藏于干燥器內(nèi)備用。精密稱取2.0000 g屈曲花粉末置200 mL燒杯中,加入20 mL 75%乙醇溶液,功率為200 W間歇式超聲波提取20 min,抽濾,加水定容至200 mL,從濾液中取2.0 mL按照1.2.1.2方法測定OD510 nm,并計算總黃酮得率。

1.2.3單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1乙醇濃度對屈曲花總黃酮得率的影響精密稱取2.0000 g屈曲花粉末6份,按料液比 1∶30(g/mL)分別加入體積分?jǐn)?shù)為45%、55%、65%、75%、85%和95%的乙醇溶液,搖勻后靜置25 min。設(shè)置超聲功率80 W提取時間15 min,將提取液抽濾后,加水定容至200 mL,從濾液中取2.0 mL按照 1.2.1.2方法測定屈曲花提取液吸光度,并計算出總黃酮得率。

1.2.3.2提取時間對屈曲花總黃酮得率的影響精密稱取2.0000 g屈曲花粉末6份,按料液比 1∶30(g/mL)加入75%的乙醇溶液,搖勻后靜置25 min。設(shè)置超聲功率80 W,提取時間分別為5、10、15、20、30和40 min。將提取液抽濾后,加水定容至200 mL,從濾液中取2.0 mL按照 1.2.1.2方法測定屈曲花提取液吸光度,并計算出總黃酮得率。

1.2.3.3料液比對屈曲花總黃酮得率的影響精密稱取2.0000 g屈曲花粉末6份,分別加入75%的乙醇溶液20、40、60、80和100 mL,即料液比分別為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70和1∶80 g/mL,搖勻后靜置25 min。設(shè)置超聲功率80 W,提取時間15 min。將提取液抽濾后,加水定容至200 mL,從濾液中取2.0 mL按照 1.2.1.2方法測定屈曲花提取液吸光度,并計算出總黃酮得率。

1.2.3.4超聲波功率對屈曲花總黃酮得率的影響精密稱取2.0000 g屈曲花粉末6份,按料液比1∶30(g/mL)加入75%的乙醇溶液,搖勻后靜置25 min。設(shè)置提取時間15 min,超聲功率分別為80、100、120、140、160和180 W。將提取液抽濾后,加水定容至200 mL,從濾液中取2.0 mL按照 1.2.1.2方法測定屈曲花提取液吸光度,并計算出總黃酮得率。

1.2.4正交實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取乙醇濃度(A)、提取時間(B)、料液比(C)和超聲波功率(D)四個因素的三個水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),建立L9(34)正交表,見表1,以屈曲花總黃酮得率(Y)為評價指標(biāo),采用SPSS statistic 19.0數(shù)據(jù)分析軟件,對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

表1　正交設(shè)計實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1　Factors and levels in the orthogonal design

1.3總黃酮得率的計算

總黃酮得率要根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計算。每次實(shí)驗(yàn)測定屈曲花提取液吸光度并將其換算成總黃酮的質(zhì)量濃度,而后根據(jù)下列公式得出總黃酮得率:

式(1)

式中,C為提取液總黃酮的質(zhì)量濃度(mg/mL);V為測量時定容體積(mL);V1為檢測時所取提取液體積(mL);V2為提取后定容體積(mL);m為屈曲花樣品質(zhì)量(g)。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有的實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,利用Excel、origin 7.5和SPSS statistic 19.0對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與討論

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)1.2.1.2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以吸光度為橫坐標(biāo),濃度(C,mg/mL)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液在實(shí)驗(yàn)中的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為:

C=0.0863A-0.0002,R2=0.9996

式(2)

式中,C為蘆丁濃度(mg/mL);A為吸光度值。

2.2單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1乙醇濃度對屈曲花總黃酮得率的影響由圖1可知,乙醇濃度在 45%～85%范圍內(nèi)時,隨著乙醇濃度增加,屈曲花總黃酮得率增加,但乙醇濃度超過85%時,屈曲花總黃酮得率反而下降。根據(jù)相似相溶原理,極性相近可達(dá)到最大溶出度。當(dāng)乙醇濃度小于85%時,隨著乙醇濃度的增大,乙醇對屈曲花顆粒的作用力增強(qiáng),促進(jìn)了黃酮類物質(zhì)在乙醇溶液中的溶解,從而使得總黃酮提取率增加;當(dāng)乙醇濃度大于85%時,溶劑的極性減弱,與黃酮類物質(zhì)的極性差距增加,從而導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)溶出率下降,總黃酮提取率反而降低。因此,選取乙醇濃度75%、85%和95%作為正交實(shí)驗(yàn)條件。

圖1　乙醇濃度對總黃酮得率的影響Fig.1　Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids

2.2.2提取時間對屈曲花總黃酮得率的影響由圖2可知,在10 min內(nèi),隨時間的延長,屈曲花總黃酮提取率幾近線性增加。超過10 min后,屈曲花總黃酮不再增加,反而線性下降。隨著超聲時間的延長,溶劑充分浸透屈曲花顆粒,促進(jìn)了顆粒中總黃酮的充分溶出,使得總黃酮提取率增加。超聲時間過久,超聲波的空化效應(yīng)會破壞某些黃酮類物質(zhì)并使其分解。因此,選擇超聲時間5、10和15 min作為正交實(shí)驗(yàn)條件。

圖2　提取時間對總黃酮得率的影響Fig.2　Effect of extraction time on extraction yield of total flavonoids

2.2.3料液比對屈曲花總黃酮得率的影響由圖3可知,料液比在1∶30～1∶60范圍內(nèi)時,屈曲花總黃酮得率隨料液比的增加顯著提高。其原因可能是隨著料液比的增加,屈曲花顆粒與乙醇溶劑之間的接觸面也增加,提高了黃酮類物質(zhì)向溶劑中轉(zhuǎn)移的擴(kuò)散系數(shù),使得原料中更多的黃酮溶入提取劑中。當(dāng)料液比超過1∶60 時,黃酮的提取率有明顯的下降趨勢。因此,選擇料液比1∶50、1∶60和1∶70 g/mL作為正交實(shí)驗(yàn)條件。

圖3　料液比對總黃酮得率的影響Fig.3　Effect of material-liquid ratio on extraction yield of total flavonoids

2.2.4超聲波功率對屈曲花總黃酮得率的影響由圖4可知,當(dāng)超聲波功率在80～100 W時,隨著超聲波功率的增大,超聲波的作用逐漸加強(qiáng),屈曲花總黃酮得率緩慢增加。當(dāng)超聲波功率達(dá)到100 W 時,屈曲花中總黃酮得率達(dá)到最大,之后呈下降的趨勢。超聲功率的增大,促進(jìn)了黃酮類物質(zhì)從屈曲花顆粒內(nèi)部溶出,從而使得總黃酮提取率增大;而較大超聲波功率可能使屈曲花中的某些黃酮類成分遭到破壞,導(dǎo)致黃酮得率有所下降。更重要的是,不同超聲波功率下的總黃酮得率之間并沒有顯著性差異。因此,選擇超聲波功率80、100和120 W作為正交實(shí)驗(yàn)條件。

圖4　超聲波功率對總黃酮得率的影響Fig.4　Effect of ultrasonic power on extraction yield of total flavonoids

2.3正交實(shí)驗(yàn)

以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ),選取乙醇濃度(A)、提取時間(B)、液料比(C)和超聲波功率(D)四個因素為自變量,以屈曲花中總黃酮得率(Y)為指標(biāo),根據(jù)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn),計算出總黃酮得率,實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2,方差分析結(jié)果見表3。

由表2極差分析可知,影響屈曲花中總黃酮得率的四個因素順序?yàn)?A(乙醇濃度)>B(提取時間)>C(料液比)>D(超聲波功率)。方差分析表3顯示乙醇濃度對屈曲花中總黃酮得率影響表現(xiàn)極顯著(p<0.01),提取時間對屈曲花中總黃酮得率影響表現(xiàn)顯著(p<0.05)。正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計得出的最佳提取工藝條件組合為A2B3C3D2,即乙醇濃度為85%,提取時間為15 min、料液比為1∶70和超聲波功率100 W。在該優(yōu)化條件下平行實(shí)驗(yàn)3次,總黃酮平均得率為2.456%。

表2　屈曲花黃酮提取工藝L9(34)正交實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2　Experimental design and corresponding results of orthogonal design

表3　方差分析結(jié)果Table 3　Variance analysis

注：F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00；**為差異極顯著(p<0.01),*為差異顯著(p<0.05)。

3　結(jié)論

本文在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,利用實(shí)驗(yàn)設(shè)計軟件SPSS statistic 19.0優(yōu)化了屈曲花總黃酮提取工藝條件。在正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計所選條件范圍內(nèi),乙醇濃度對屈曲花總黃酮得率的影響最大,其次為提取時間,然后是料液比,超聲波功率影響最小。正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計得出的最佳提取工藝條件為乙醇濃度85%、提取時間15 min、料液比1∶70、超聲功率100 W。在該優(yōu)化條件下平行實(shí)驗(yàn)3次,總黃酮平均得率為2.456%。

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Optimization on the ultrasonic-assisted extraction of total flavonoids fromIberisamarabased on orthogonal experimental design

DENG Si-jie,HANS Gregrensen*

(Key Laboratory of Biorheological Science and Technology,Ministry of Education College of Bioengineering,Chongqing University,Chongqing 400044,China)

Orthogonal experimental design was applied to optimize the extraction process of total flavonoids fromIberisamarausing an ultrasonic-assisted extraction method in this study. The effects of ethanol concentration,extraction time,solid-to-liquid ratio and ultrasonic power on the extraction yield of total flavonoids were investigated by single-factor experiment,and then the extraction conditions were optimized by orthogonal experimental design. The results displayed that the ethanol concentration was the most key factor,followed by extraction time,solid-to-liquid ratio and ultrasonic power,in turn. The best extraction conditions were obtained as follows:ethanol concentration 85%,solid-to-liquid ratio 1∶70,extraction time 15 min and ultrasonic power 100 W. Under these optimized conditions,the yield of total flavonoids fromIberisamarawas 2.456%. This study offered not only a reference standard for industrial applications,but also has a promising prospect and value for widely exploitation and utilization ofIberisamararesource.

Iberisamara;flavonoids;ultrasonic-assisted extraction;orthogonal experiment

2015-06-18

鄧思節(jié)(1990-),女,碩士研究生,研究方向:天然產(chǎn)物的分離與提取,E-mail:18875208325@163.com。

漢斯·格里格森(1962-),男,博士,教授,研究方向:軟組織生物力學(xué)及新型醫(yī)療器械,E-mail:hag@giome.org。

TS255.1

B

1002-0306(2016)03-0275-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.049