楊小玉,王玉紅,王 彥,萬青云,劉元元,薛 蕓,李 靜,閻 超,,*
(1.上海交通大學藥學院,上海 200240;2.上海通微分析技術有限公司,上海 201203)
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楊小玉1,王玉紅2,王彥1,萬青云1,劉元元1,薛蕓1,李靜2,閻超1,2,*
(1.上海交通大學藥學院,上海 200240;2.上海通微分析技術有限公司,上海 201203)
建立了一種同時測定飲料中主要限用人工合成甜味劑:安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖和阿斯巴甜的反相高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法。采用核殼型HALO色譜柱,甲醇/甲酸-三乙胺緩沖溶液(pH=4.5)為流動相,梯度洗脫,ELSD檢測,結果表明5種甜味劑在4.5 min內能夠實現(xiàn)完全分離。線性范圍為5 μg/mL~500 μg/mL,線性相關性系數(shù)大于0.997,方法最低檢出限為2 μg/mL,定量限為5 μg/mL。在3個添加水平下,樣品的加標回收率為83.0%~106.7%,相對標準偏差為0.84%~3.37%。該方法方便、快速、適用性強并可快速推廣,可實現(xiàn)飲料中多種人工合成甜味劑的同時分離檢測,同時也適用于無紫外吸收的甜味劑的檢測。
反相高效液相色譜,蒸發(fā)光散射檢測器,核殼型色譜柱,人工合成甜味劑
甜味劑(sweeteners)是一類賦予食品甜味的重要食品添加劑[1],按其來源可分為天然甜味劑和人工合成甜味劑。由于人工合成甜味劑的甜度是蔗糖的幾十倍至幾千倍,在人體內不被代謝吸收、不提供熱量,對肥胖、高血壓、糖尿病、齲齒等患者有益,加之又具有高效、經(jīng)濟等優(yōu)點,在食品特別是飲料行業(yè)被廣泛應用。在我國,允許使用的人工合成甜味劑主要有:安賽蜜,阿斯巴甜,糖精(及鈉、鉀、鈣鹽),三氯蔗糖,阿力甜,甜蜜素和紐甜等。然而,近年來甜味劑的濫用現(xiàn)象層出不窮[2],如超種類、超范圍、超限量地使用甜味劑。據(jù)統(tǒng)計,我國食品中添加的人工合成甜味劑使用量過大,發(fā)達國家人工合成添加劑在整個添加劑中占3%~5%的比例,而我國使用人工合成甜味劑的比例則超過了40%。同時研究也已表明人體攝入過多的人工合成甜味劑弊大于利,并且為了改善口感,提高甜味劑的穩(wěn)定性,人工合成甜味劑大多數(shù)情況下都以多種成分復配添加,而非單一使用,而現(xiàn)有的國家標準測定組分單一[3-6],應用面狹窄,所以有必要建立一種能夠同時檢測多種人工合成甜味劑的分析方法[7-10]。
目前,人工合成甜味劑的測定方法主要有分光光度法、氣相色譜法、毛細管電泳[11-12]、離子色譜法[13]和高效液相色譜法[14-15]等,其中反相高效液相色譜法是應用最廣的分析檢測方法;又因為某些人工合成甜味劑(如甜蜜素,三氯蔗糖)沒有紫外吸收,選擇通用型檢測器[16-17]則成為必然。
核殼型填料色譜柱是一種新型色譜柱,運用創(chuàng)新性熔融核技術制備,其優(yōu)點為超高柱效、高流速下低譜帶展寬、相對較低的反壓、出眾的耐用性和穩(wěn)定性等,該色譜柱可在48 s內實現(xiàn)6種苯甲酸類物質(尿嘧啶,鄰苯二甲酸,2-氟苯甲酸,3-硝基苯甲酸,3-氟苯甲酸,間甲苯酸)的分離。整體考慮檢測成本以及方法的普及,本研究采用HALO-RP-HPLC-ELSD[18]方法,主要針對飲料中的安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖和阿斯巴甜5種人工合成甜味劑的同時分離測定進行了系統(tǒng)研究,最終實現(xiàn)了5種人工合成甜味劑在4.5 min內完全分離,得到了令人滿意的定性定量結果。
1.1材料與儀器
碳酸型飲料,茶飲料,功能性飲料以及果汁調和類飲料等超市購買;98%安賽蜜阿拉丁試劑有限公司;99%甜蜜素阿拉丁試劑有限公司;98%阿斯巴甜阿拉丁試劑有限公司;98%三氯蔗糖阿拉丁試劑有限公司;98%糖精鈉TCI。
EasySep TM-1020高效液相色譜儀上海通微分析技術有限公司;UM-5000蒸發(fā)光散射檢測器上海通微分析技術有限公司;KQ2200B型超聲波清洗器昆山超聲儀器有限公司;FA1004電子天平上海恒平科學儀器有限公司;離心機上海安亭科學儀器廠;氮吹儀上海安譜科學儀器有限公司;固相萃取裝置上海安譜科學儀器有限公司;色譜柱:HALO-C18,4.6 mm×150 mm,2.7 μm美國Advanced Materials Technology,ATM公司。
1.2緩沖液與標準溶液的配制
甲酸-三乙胺緩沖液(pH=4.5)的配制:準確量取500 mL純水置于溶劑瓶中,依次加入0.4 mL甲酸和1.25 mL三乙胺,超聲待用。標準儲備液的配制:分別準確稱取5種人工合成甜味劑0.2 g,置于同一100 mL容量瓶中,用緩沖溶液溶解并定容,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后,置于冰箱保存?zhèn)溆?。標準工作溶液的配?用pH為4.5的甲酸-三乙胺緩沖溶液將上述標準儲備液逐級稀釋為2、5、10、20、50、100、150、200、300、400、500 μg/mL的系列標準溶液,置于冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3樣品前處理
碳酸型飲料,茶飲料,功能性飲料以及果汁調和類飲料是人工合成甜味劑的主要添加對象。對于實際樣品的前處理方法,也以上述類型的飲料樣品為目標,參考相關的國標方法建立。
準確量取樣品溶液2 mL于5 mL離心管中,于超聲波清洗器中震蕩脫氣后,加入等量的水,超聲提取1 h;將提取液置于離心機中離心5 min,取上清液經(jīng)過SPE固相萃取C18小柱,首先以4 mL緩沖溶液清洗2次,再以2 mL甲醇洗脫;收集甲醇洗脫液在氮吹儀上進行常溫吹干濃縮;加入1 mL緩沖溶液溶解,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后,加水定容至2 mL作為HPLC待測樣品溶液[18]。
2.1HPLC分析條件確定
2.1.1流動相體系的確定實驗中考察了甲醇/水、甲醇/緩沖液和乙腈/緩沖液不同流動相體系下對5種人工合成甜味劑的分離影響。結果表明,使用緩沖溶液可明顯增加樣品的分離度并改善色譜峰形;而甲醇/緩沖液和乙腈/緩沖液對比來說,甲醇/緩沖液條件下的信噪比最高,而乙腈的洗脫能力較強,系統(tǒng)壓力較低,分離速度更快,但其中安賽蜜的保留時間非常接近死時間,考慮實際樣品中可能存在的雜質干擾,本研究中首選甲醇/緩沖液體系作為流動相。
圖1 5種甜味劑標準溶液的HPLC-ELSD 圖譜 Fig.1 HPLC-ELSD chromatograms of five sweeteners注:(1)安賽蜜;(2)糖精鈉;(3)甜蜜素; (4)三氯蔗糖;(5)阿斯巴甜; 條件:色譜柱:HALO-C18,4.6 mm×150 mm,2.7 μm; 流速:0.5 mL/min;載氣流量:3.5 L/min;蒸發(fā)溫度:40 ℃。
2.1.2pH對分離結果的影響實驗中考察了緩沖溶液pH分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5時對5種人工合成甜味劑的分離影響。結果表明,pH變化對樣品保留性質有較為明顯的影響,各樣品的保留時間隨著pH的增大而變小,其中pH=3.0時,安賽蜜和糖精鈉,三氯蔗糖和阿斯巴甜色譜峰重疊無法分開,pH大于4.0時,5種甜味劑都可實現(xiàn)完全分離,保留時間的差別不大,考慮到阿斯巴甜在pH=4.3左右時穩(wěn)定性最好,因此,本研究選擇緩沖溶液的最佳pH為4.5。
圖2 流動相pH對各物質分離的影響Fig.2 Effect of pH on the separation of five sweeteners
2.2檢測器的選擇
蒸發(fā)光散射檢測器(Evaporative light-scattering detector,ELSD),是一種自上世紀九十年代開始得到廣泛應用的通用型高效液相色譜質量檢測器,其原理是首先將色譜柱洗脫液霧化形成氣溶膠,然后在加熱的漂移管中將溶劑蒸發(fā),最后余下的不揮發(fā)性溶質顆粒在光散射檢測池中得到檢測。
蒸發(fā)光散射檢測器不僅可彌補常規(guī)紫外檢測(UVD)不能檢測無紫外吸收或只有紫外末端吸收物質的缺陷,而且與同樣可用于無紫外吸收物質檢測的示差折光檢測(RID)相比,靈敏度略高、受溫度等實驗條件影響小和可用于梯度洗脫等優(yōu)點,近年來受到越來越多的分析工作者的重視,已廣泛應用于醫(yī)藥、化工、食品等行業(yè)。所要檢測的五種甜味劑中,甜蜜素和三氯蔗糖沒有紫外吸收,而蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)作為一種通用的檢測器,可以不受物質本身結構的限制,可以適用于任何揮發(fā)性弱于流動相的物質的檢測。因此,可以滿足同時檢測五種甜味劑的需求。
2.2.1 ELSD檢測條件的選擇
2.2.1.1蒸發(fā)溫度的確定保持載氣流速3.0 L/min,以0.1 mg/mL混合標準品溶液的信噪比(S/N)為對象考察ELSD的最佳蒸發(fā)溫度。結果表明,蒸發(fā)溫度在40 ℃時信噪比最高。值得注意的是,超過40 ℃時阿斯巴甜的信噪比顯著下降,可能是其在高溫下不穩(wěn)定所致。因此,本研究選擇最佳蒸發(fā)溫度為40 ℃。
圖3 甜味劑信噪比隨蒸發(fā)溫度的變化Fig.3 The relationship between evaporation temperature and signal-to-noise ratio of sweeteners
2.2.1.2載氣流速的確定保持蒸發(fā)溫度40 ℃,以0.1 mg/mL混合標準品溶液的信噪比(S/N)為對象考察ELSD的最佳載氣流速。結果表明,樣品信噪比隨著載氣流速的增加而增大,這種趨勢在載氣流速到達3.5 L/min后趨于平緩,而基線噪聲則略有增大。為了保證樣品氣溶膠蒸發(fā)完全,降低基線噪聲的干擾,本研究選擇最佳載氣流速為3.5 L/min。
圖4 甜味劑信噪比隨載氣流速的變化Fig.4 The relationship between flow rate of Carrier gas and signal-to-noise ratio of sweeteners
2.3色譜柱的選擇
國標中采用了普通C18柱,每種方法只能分離一種或兩種甜味劑,且需要復雜的梯度條件,出峰時間較長。Wasik,A[18]采用普通C18柱需要12 min才能完全分離5種甜味劑。劉芳[19]采用TOSOH TSK gel ODS-100V色譜柱(15 cm×4.6 mm,3 μm),需要9 min才能完全分離5種甜味劑,并且柱壓較高。故采用常規(guī)的C18柱,難于同時實現(xiàn)5種樣品的快速分離。運用創(chuàng)新性熔融核技術制備而成的新型HALO色譜柱,采用由1.7 μm的無孔核和0.5 μm的多孔殼組成的2.7 μm粒徑的硅膠微球,多孔殼層通過提供較短的傳質路徑以減少了軸向擴散,而實心核則通過提供堅固的支撐結構,以承受高壓。該色譜柱擁有更強的分離能力和超快速的分離性能,可以有效提高柱效,同時不顯著升高柱壓,適用于化合物的快速分離。經(jīng)過色譜條件的優(yōu)化,可以在4.5 min內實現(xiàn)五種甜味劑的完全分離。
色譜條件為:色譜柱:HALO-C18,4.6 mm×150 mm,2.7 μm;流動相A:甲酸-三乙胺緩沖液(pH=4.5),流動相B:甲醇,梯度洗脫程序:0~ 1 min,甲醇維持在33%;1.1 min,甲醇從33%變?yōu)?00%;1.1 ~ 8 min,甲醇維持在100%;流速:0.7 mL/min;蒸發(fā)溫度:40 ℃;載氣類型:空氣;載氣流速:3.5 L/min;載氣壓力:433 kPa;進樣濃度:0.1 mg/mL;進樣量:20 μL。
在此最優(yōu)條件下得到的色譜分離圖如圖5所示。
表1 5種甜味劑的線性方程、線性相關系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限Table 1 Regression equation,correlation coefficients(r),linear ranges,limits of detection(LOD,S/N=3)and limits of quantitation(LOQ,S/N=10)of the five sweeteners
圖5 5種人工合成甜味劑標準品的HPLC-ELSD色譜圖Fig.5 HPLC-ELSD chromatogram of five sweeteners
因考慮要進行實際樣品的測定,為防止安賽蜜的色譜峰與實際樣品中的雜質峰重合,故適當延長了甜味劑的出峰時間至9 min,以保證不受實際樣品雜質的干擾。經(jīng)過一系列方法優(yōu)化,最終確定的色譜條件為:色譜柱:HALO-C18,4.6 mm×150 mm,2.7 μm;流動相A:甲酸-三乙胺緩沖液(pH=4.5),流動相B:甲醇,梯度洗脫程序:0 ~ 3 min,甲醇維持在10%,3 ~ 6 min,甲醇從30%變?yōu)?5%;流速:0.5 mL/min;蒸發(fā)溫度:40 ℃;載氣類型:空氣;載氣流速:3.5 L/min;載氣壓力:433 kPa;進樣濃度:1 mg/mL進樣量:20 μL。
在此最優(yōu)條件下得到的色譜分離圖如圖6所示。
圖6 5種人工合成甜味劑標準品的HPLC-ELSD色譜圖Fig.6 HPLC-ELSD chromatogram of five sweeteners
2.4分析方法學驗證
2.4.1線性范圍及檢出限對1.2節(jié)中的系列標準溶液加入空白樣品中進行測定,以各甜味劑的質量濃度對數(shù)與對應色譜峰的面積對數(shù)進行線性回歸,以信噪比S/N=3計檢出限,S/N=10計定量限,在5~500 μg/mL的范圍內5種甜味劑都具有良好的線性關系,相關性系數(shù)大于0.997。結果見表1。
目前相關人工合成甜味劑的國家標準[3-6]中,安賽蜜、糖精鈉、三氯蔗糖和阿斯巴甜均為單一的HPLC法,其中安賽蜜和甜蜜素的檢出限為4.0 μg/mL,三氯蔗糖的檢出限為4.0 μg/mL,阿斯巴甜的檢出限為2.0 μg/mL。所以,本研究建立的分析方法符合相應國家標準對甜味劑的最低檢出限要求,且可同時分離檢測5種甜味劑樣品,大大提高了工作效率,節(jié)省了檢測成本。
2.4.2回收率以2.3節(jié)最終確定的色譜條件,對實際飲料樣品1進行3個水平的加標回收實驗(n=3)。從表2可以看出,該方法回收率在83.0%~106.7%之間,3次平行測試的相對標準偏差為0.84%~3.37%,表明本分析方法具有良好的準確性和重復性。
表2 樣品1中5種甜味劑的加標量、 添加回收率及其相對標準偏差(n=3)Table 2 Recoveries and relative standard deviations(RSD3)of 5 sweeteners in different samples(n=3)
2.4.3精密度按照2.3節(jié)的色譜條件,以0.1 mg/mL混合標準品溶液連續(xù)進樣6次,6次測定的峰面積相對標準偏差(RSD)為1.90%~3.50%,保留時間RSD為0.06%~0.09%,說明本方法具有良好精密度。
2.5實際樣品分析
表3 三種方法對比情況Table 3 The comparition of three methods
運用本文所建立的分析方法,分別對市售的常見碳酸型飲料,茶飲料進行分離檢測。其中樣品1(碳酸型飲料)產品標注添加:安賽蜜,三氯蔗糖和阿斯巴甜;樣品2(茶飲料)產品標注添加:三氯蔗糖,分析結果如下。圖7為樣品1、樣品2的HPLC-ELSD色譜圖。
圖7 樣品1和2的HPLC-ELSD 色譜圖Fig.7 HPLC-ELSD chromatograms of Sample 1 and 2注:(1)安賽蜜;(2)甜蜜素;(3)三氯蔗糖;(4)阿斯巴甜。
結果表明,將本方法應用于實際樣品分析,均準確的檢出產品所標注添加的人工合成甜味劑,其中樣品1還額外檢出了甜蜜素,樣品2還額外檢出了安賽蜜,甜蜜素,阿斯巴甜。其中樣品1含有的甜味劑量分別為:安賽蜜為123.03 μg/mL,甜蜜素為102.33 μg/mL,三氯蔗糖為93.33 μg/mL,阿斯巴甜為199.53 μg/mL;樣品2含有的甜味劑量分別為:安賽蜜為46.09 μg/mL,甜蜜素為16.59 μg/mL,三氯蔗糖為120.23 μg/mL,阿斯巴甜為15.17 μg/mL,本方法表明該兩種產品均不符合國家標準。從實際應用角度著眼,本分析方法目標針對性強,方便簡便可靠,具有很大的推廣價值。
2.6同現(xiàn)有方法對比情況
該方法使用蒸發(fā)光散射檢測器進行樣品檢測,可同時快速檢測多種無紫外吸收或紫外吸收較弱的甜味劑,且都能滿足或超過國標的最低檢測限要求,為實際操作過程帶來了很大方便。目前已有多篇文章報道甜味劑的分離研究,該方法同現(xiàn)有具有代表性方法進行對比,表現(xiàn)出一些優(yōu)勢,如表3所示。
本文建立了人工合成甜味劑糖精鈉、甜蜜素、阿斯巴甜、安賽蜜和三氯蔗糖的多組分同時檢測的HALO-HPLC-ELSD方法。該方法基于國產高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器平臺,使用核殼型色譜柱,并配套相應的樣品前處理方法,能夠在較短的時間內實現(xiàn)五種甜味劑的完全分離,方法簡便、快速、靈敏度高,主要針對碳酸型飲料和茶飲料,可以利用該方法開展后續(xù)實驗,配合適宜的前處理方法,對功能性飲料,果汁調和類飲料等進行檢測。相比目前國家標準單一甜味劑的檢測方法,本方法大大降低了工作量,易于進行大規(guī)模推廣,為飲料中多種人工合成甜味劑的檢測提供了一種快速且行之有效的方法,同時也為食品安全監(jiān)督管理提供了有力的幫助。
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Simultaneous determination of five intense sweeteners in beverages by core-shell column-HPLC-ELSD
YANG Xiao-yu1,WANG Yu-hong2,WANG Yan1,WAN Qing-yun1,LIU Yuan-yuan1,XUE Yun1,LI Jing2,YAN Chao1,2,*
(1.School of Pharmacy,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200240,China;2.Unimicro(Shanghai)Technologies Co.,Ltd.,Shanghai 201203,China)
An analytical method has been established to detect 5 intense sweeteners(Acesulfame-k,Sodium saccharin,Cyclamate,Sucralose,and Aspartame)simultaneously in beverages by reverse phase high performance liquid chromatography(RP-HPLC). The separation process was carried out on a HALO column with methanol/formic acid—triethylamine buffer solution(pH=4.5)as mobile phase with gradient elution. The quanlification and quantitation were accomplished by the evaporative light scattering detector. The 5 sweeteners were baseline separated in 4.5 minutes. The linear range was from 5 μg/mL to 500 μg/mL,with correlation coefficient greater than 0.997. The LOD was 2 μg/mL and LOQ was 5 μg/mL. An average recovery was between 83.0% to 106.7% and the RSD was 0.84%~ 3.37%. The results indicated that the method was simple,quick,serviceable and applicable to detection of sweeteners in beverage,it was also suitable for the detection of no ultraviolet absorption of sweeteners.
reverse phase high performance liquid chromatography(RP-HPLC);evaporative light scattering detection(ELSD);core-shell column(HALO);sweeteners
2015-07-15
楊小玉(1989-),女,碩士,研究方向:食品安全,E-mail:13651656949@163.com。
閻超(1956-),男,博士,教授,研究方向:代謝組學,E-mail:chaoyan@unimicrotech.com。
上海市科委應用方法開發(fā)項目(12142201400);國家重大科學儀器設備開發(fā)專項(2011YQ150072)。
TS201.7
A
1002-0306(2016)03-0312-06
10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.057