CCD響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化米曲霉產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的發(fā)酵工藝

王　鵬,蔣　波,王圣海,范　森,林曉珊,張　毅

(華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510006)

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CCD響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化米曲霉產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的發(fā)酵工藝

王鵬,蔣波,王圣海,范森,林曉珊,張毅*

(華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510006)

本文用蔗糖、豆粕粉、玉米粉作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,對產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的米曲霉誘變?nèi)诤暇闞Ⅲ-7進行發(fā)酵實驗,通過Plackett-Burman優(yōu)化實驗,得到影響其發(fā)酵的3個顯著因素,分別為蔗糖濃度、豆粕粉濃度、轉(zhuǎn)速;再通過中心復(fù)合設(shè)計(CCD)響應(yīng)面設(shè)計進一步優(yōu)化米曲霉產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的發(fā)酵工藝,實驗結(jié)果表明,蔗糖、豆粕粉和轉(zhuǎn)速之間存在著交互作用,其中豆粕粉濃度與轉(zhuǎn)速之間的交互作用顯著,得到最優(yōu)工藝參數(shù)為:蔗糖濃度為5.95%、豆粕粉濃度為1.60%、轉(zhuǎn)速為165 r/min。經(jīng)驗證,在最優(yōu)發(fā)酵工藝條件下,米曲霉產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力達到870.21 U/g,與預(yù)測值895.68 U/g接近,誤差為0.028%。

米曲霉,果糖基轉(zhuǎn)移酶,Plackett-Burman 優(yōu)化,響應(yīng)面設(shè)計,發(fā)酵

低聚糖一般是由3～10個單糖通過糖苷鍵連接起來的新型功能性糖。蔗果低聚糖(Fructo-oligosacchrides,FOS)又名低聚果糖或寡果糖,是新型低聚糖的一種,以蔗糖為底物,經(jīng)過果糖基轉(zhuǎn)移酶(Frucosyltransferase)的作用,在蔗糖的果糖殘基C1和C2位置以β-1,2-糖苷鍵連接1～3個果糖分子形成的低聚糖[1]。低聚果糖不僅能增加腸內(nèi)有益菌的生長,有效抑制有害菌的繁殖,提高免疫力,延緩衰老[2],還能改善脂質(zhì)代謝、降低血脂和膽固醇、促進礦物質(zhì)的吸收、利于維生素合成等[3]。目前,FOS的商品化生產(chǎn)主要是以高濃度的蔗糖作底物利用微生物產(chǎn)生的具有轉(zhuǎn)果糖基活力的酶轉(zhuǎn)化而來[4]。能產(chǎn)生果糖基轉(zhuǎn)移酶的微生物有曲霉Aspergillussp.、節(jié)桿菌Arthrobactersp.、枯草桿菌Bacillussubtilis、酵母Zymomonasmobilis、鏈孢霉Fusariumsp.等[5-7]。而米曲霉(Aspergillusoryzae)由于菌落生產(chǎn)快,基本無毒性,常作為發(fā)酵食品的生產(chǎn)菌株。米曲霉是一種好氣性真菌,屬于半知菌亞門曲霉屬。米曲霉菌絲是由多細(xì)胞組成,菌絲一般呈黃白色、黃綠色、黃褐色。1943年,Hestrin 等使用菌株Aerobacterlevanicum(NCIB 9966)生產(chǎn)果聚糖,并詳細(xì)研究了該菌株的產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的催化機理及其轉(zhuǎn)移性[8]。Muramatsu等在1988年篩選到一株產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶菌株的曲霉AspergillussydowiIAM2544,并研究了產(chǎn)物低聚果糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)[9]。Balken研究小組在1991年從曲霉phoenicisCBS294.80的發(fā)酵液中提取出β-呋喃果糖苷酶,該酶的酶活力在60 ℃時達到最高,將其生產(chǎn)FOS時,產(chǎn)率達到60%。近年來,通過固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶商品化生產(chǎn)FOS,因有諸如酶能反復(fù)利用、避免菌體細(xì)胞污染、可免去脫色、除鹽工序等優(yōu)點成為了研究和開發(fā)的熱點[10-11]。響應(yīng)面分析法是采用多元二次回歸方法作為函數(shù)估計的工具,將多因子實驗中因素與指標(biāo)的相互關(guān)系用多項式近似擬合,依此可對函數(shù)的響應(yīng)面和等高線進行分析,研究因子與響應(yīng)面之間、因子與因子之間的相互關(guān)系。本文采用何小妮等人誘變篩得的具有穩(wěn)定高產(chǎn)果糖基酶的米曲霉菌株[12-13],應(yīng)用響應(yīng)面法考察米曲霉發(fā)酵產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶工藝中各因素對酶活的影響,對發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化,旨在為低聚果糖的生產(chǎn)與開發(fā)利用提供技術(shù)參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菌種米曲霉誘變?nèi)诤暇闞Ⅲ-7,實驗室篩選得到;PDA斜面、平板培養(yǎng)基,稱取PDA培養(yǎng)基40.1 g,溶于1000 mL蒸餾水中配得;搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(成分:蔗糖5%,豆粕粉2%,玉米粉0.3%)。

DRP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱上海森信實驗儀器有限公司;SUKUN全溫振蕩培養(yǎng)器上海蘇坤實業(yè)有限公司;Waters1525高效液相色譜儀美國Waters公司。

1.2實驗方法

1.2.1單細(xì)胞懸浮液的制備移取10 mL無菌水至長有成熟孢子的PDA斜面,再用接種環(huán)將孢子刮至溶液,然后將含孢子的無菌水移至含玻璃珠的無菌三角瓶中,搖瓶振蕩使孢子分散均勻,并移取適量無菌水使其濃度稀釋至105個/mL。

1.2.2種子液的制備取孢子懸浮液200 μL接種到含有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,30 ℃,150 r/min搖床培養(yǎng)24 h,作為接種到發(fā)酵罐中的種子液。

1.2.3發(fā)酵工藝優(yōu)化的研究將200 μL米曲霉孢子懸浮液接種到含有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中,按一定條件(溫度、轉(zhuǎn)速、pH、豆粕粉濃度、蔗糖濃度、玉米粉濃度、NaCl濃度)進行搖瓶發(fā)酵,利用高效液相色譜法測得低聚果糖的含量,并計算果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活。

在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上選取溫度、轉(zhuǎn)速、pH、豆粕粉濃度、蔗糖濃度、玉米粉濃度、NaCl濃度7個因素為自變量,果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活為響應(yīng)值,根據(jù)Plackett-Burman設(shè)計7因素3水平篩選實驗。

由Plackett-Burman實驗優(yōu)化結(jié)果,設(shè)計爬坡方向,所得最優(yōu)結(jié)果作為CCD響應(yīng)面實驗的中心點,再設(shè)計三因素五水平CCD響應(yīng)面實驗(α=1.682)。

表1　CCD響應(yīng)面設(shè)計的因素及水平編碼表Table 1　The factors and levels of code table of CCD design

1.2.4菌絲果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活檢測方法稱取10 g白砂糖、90 g蒸餾水于250 mL的三角瓶中,放至45 ℃、150 r/min的搖床預(yù)熱、溶解,再稱取0.30 g米曲霉菌絲至以上三角瓶中反應(yīng)60 min;取1 mL反應(yīng)液于沸水中滅活10 min,在10000 r/min的條件下離心10 min,用0.22 μm針孔濾膜過濾后,取上清液利用HPLC法檢測蔗果三糖(GF2)的含量。高效液相色譜法檢測酶活條件如下:

檢測器:Waters2410 型示差折光檢鍘器;色譜柱:氨基鍵合柱為Inertsil NH2,填料粒度5 μm,柱長4.6 mm×250 mm;柱溫:40 ℃;流動相為乙腈(色譜純)/水=72/28;流速為1.0 mL/min;進樣量:10 μL。

另外進行菌絲水分檢測,稱取米曲霉菌絲1.0 g左右于105 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中,放置4 h后取出,烘干,檢測水分,綜合計算菌絲干基的酶活性。

果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活定義為:在上述條件下,每1 min產(chǎn)生1 μmol GF2所需的酶量為1個活力單位(U)。根據(jù)酶活力的定義,按下式計算每克產(chǎn)酶菌絲體的酶活力X(U/g):

X=(10×1000×GF2)/[0.504×t×m×(1-y)]

式(1)

式中y，指含水量。

2　結(jié)果與討論

2.1Plackett-Burman實驗優(yōu)化結(jié)果與分析

在單因素實驗中,米曲霉菌株開始隨著蔗糖和豆粕粉濃度的增加,菌株的酶活先升高再降低,生物量先升高后基本不變,分別在蔗糖濃度為5%、豆粕粉濃度在2%時,菌絲體的發(fā)酵酶活達到最高;在玉米粉濃度為0.3%時,米曲霉菌絲體酶活及生物量達到最大值;當(dāng)在培養(yǎng)基中添加0.1%濃度的NaCl時,最有利于米曲霉的生長,同時有利于果糖基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)生;在對發(fā)酵條件的優(yōu)化實驗中,菌株在偏酸性條件下有利于產(chǎn)酶和菌體生長,在pH為5時,菌株產(chǎn)酶及生物量最高;低轉(zhuǎn)速時,菌體酶活力較低,且菌絲體在發(fā)酵培養(yǎng)基中凝結(jié)成塊,高轉(zhuǎn)速條件下,菌體暗綠,開始長孢子,菌絲體酶活開始下降,轉(zhuǎn)速為150 r/min時,菌絲體酶活最高;當(dāng)溫度在30 ℃時,可得最高酶活,溫度高于或低于30 ℃時,都不利于該菌株產(chǎn)酶和生長。

表2　Plackett-Burman實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2　The design and results of Plackett-Burman experiment

表3　干基酶活(U/g)的方差分析Table 3　The analysis of variance dry base enzyme activity(U/g)

將影響米曲霉發(fā)酵產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活的七個單因素:發(fā)酵溫度、搖床轉(zhuǎn)速、發(fā)酵pH、培養(yǎng)基豆粕粉濃度、蔗糖濃度、玉米粉濃度、NaCl濃度運用Plackett-Burman實驗,對其進行優(yōu)化,實驗設(shè)計及結(jié)果如表2,并采用Minitab軟件對表2進行分析,得到各因素的顯著性結(jié)果,如表3。

當(dāng)因素的p<0.05時,為顯著性因素。由表3知,轉(zhuǎn)速(p=0.002<0.05)、蔗糖濃度(p=0.013<0.05)、豆粕粉濃度(p=0.015<0.05)為顯著性因素。由效應(yīng)值的正負(fù)號,可知在實驗范圍內(nèi)有正效應(yīng)的因素有蔗糖濃度、轉(zhuǎn)速,原因可能是蔗糖作為米曲霉生長的碳源,而另一方面蔗糖是果糖基轉(zhuǎn)移酶的作用底物,增加蔗糖濃度,一定程度上可以誘導(dǎo)該酶的產(chǎn)生,而增加轉(zhuǎn)速則一方面可以提高溶氧傳質(zhì),另一方面可以使菌絲體分散[14],有利于米曲霉菌絲的生長及產(chǎn)酶;有負(fù)效應(yīng)的因素是豆粕粉濃度,是因為增大豆粕粉濃度時,培養(yǎng)基中氮源過多,菌體生長過于旺盛,導(dǎo)致pH呈堿性,從而不利于米曲霉的生長以及產(chǎn)酶。方差分析中,R2=91.50%,說明此模型擬合較好。故從影響米曲霉發(fā)酵產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活的7個單因素中得到3個顯著性因素:轉(zhuǎn)速、蔗糖濃度、豆粕粉濃度。

由Plackett-Burman實驗的優(yōu)化結(jié)果知,轉(zhuǎn)速、蔗糖濃度對酶活的影響是正向效應(yīng),豆粕粉濃度對酶活的影響是負(fù)向效應(yīng),以此設(shè)計爬坡方向,轉(zhuǎn)速、蔗糖濃度依次遞增,豆粕粉濃度依次遞減,實驗結(jié)果如表4。

表4　最陡爬坡實驗設(shè)計及其結(jié)果Table 4　The design and its results of the steepest climbing experiment

由表4得:第2組的酶活最高,故以第2組的實驗參數(shù)作為響應(yīng)面實驗的中心點,開展響應(yīng)面實驗。

2.2響應(yīng)面實驗發(fā)酵優(yōu)化結(jié)果與分析

根據(jù)爬坡實驗的結(jié)果,以第2組的實驗參數(shù):轉(zhuǎn)速180 r/min,蔗糖濃度5.70%,豆粕粉濃度1.90%為響應(yīng)面實驗中心點,每個因素設(shè)置-α、-1、0、1、+1、+α五個水平,設(shè)計CCD響應(yīng)面實驗,如表1。

再利用Design-Expert 8.0設(shè)計響應(yīng)面實驗,以X1、X2、X3為自變量,以酶活為響應(yīng)值,實驗結(jié)果如表5。其中實驗序號1～20為析因?qū)嶒?1～2、9、15～16、18為6個中心實驗,用以估計實驗誤差。

表5　中心復(fù)合設(shè)計(CCD)響應(yīng)面設(shè)計及實驗結(jié)果Table 5　The design and experimental results of central composite design(CCD)response surface

對表5中的數(shù)據(jù)用Design Expert 8.0軟件做回歸分析,得到酶活的預(yù)測值,其中酶活的預(yù)測值Y對蔗糖濃度X1、豆粕粉濃度X2、轉(zhuǎn)速X3的三元二次回歸方程為:

Y=-1619.08+943.72X1-368.03X2+3.53X3+166.07X1X2-1.52X1X3+12.00X2X3-82.58X12-755.86X22-0.06X32

式(2)

由表6模型回歸系數(shù)方差分析可知,方程因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯,線性回歸系數(shù)值p=0.0018<0.05,表現(xiàn)為顯著性;失擬項系數(shù)值p=0.0614>0.05,表現(xiàn)為不顯著性,表明實驗?zāi)Ｐ蛿M合度較好,并且復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=87.40%,二次方程的擬合度高,自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著,說明此模型預(yù)測結(jié)果比較準(zhǔn)確。由F檢驗得,X3>X2>X1,即轉(zhuǎn)速>豆粕粉濃度>蔗糖濃度,說明轉(zhuǎn)速對酶活力影響最大,原因可能為轉(zhuǎn)速很大程度上影響了米曲霉發(fā)酵的傳質(zhì)和溶氧。X3、X2X3達到了極其顯著的水平,X1X2、X1X3不顯著,其中蔗糖濃度與豆粕粉濃度、蔗糖濃度與轉(zhuǎn)速、豆粕粉濃度與轉(zhuǎn)速存在交互作用,其交互作用效果如圖1所示。

表6　各因素的估計回歸系數(shù)Table 6　Factors estimate of regression coefficients

圖1　各因素之間的交互作用及其對酶活的影響情況Fig.1　Interaction between each factor and their influence on enzyme activity

應(yīng)用響應(yīng)面分析法對回歸模型進行分析,得到的最優(yōu)實驗參數(shù)及相應(yīng)的酶活為:蔗糖濃度為5.95%,豆粕粉濃度為1.60%,轉(zhuǎn)速為165 r/min,酶活為895.68 U/g。采用實驗所得的最佳培養(yǎng)基配方,進行3次平行實驗,培養(yǎng)48 h后測定菌絲體酶活,所測酶活為870.21 U/g,與預(yù)測值895.68 U/g接近,誤差為0.028%,驗證該模型能較好的預(yù)測實際發(fā)酵情況。

3　結(jié)論

本文的研究內(nèi)容為運用經(jīng)融合誘變得到的穩(wěn)定性產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的米曲霉菌株,得到其優(yōu)化的發(fā)酵工藝條件。首先采用Minitab軟件通過Plackett-Burman實驗篩選出米曲霉產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶發(fā)酵的顯著影響因素,再用Design Expert軟件聯(lián)合CCD響應(yīng)面實驗,對發(fā)酵工藝進行進一步優(yōu)化。實驗結(jié)果表明,蔗糖濃度、豆粕粉濃度、轉(zhuǎn)速是米曲霉產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活的3個顯著影響因素,并且轉(zhuǎn)速對酶活力影響最大。此外,蔗糖濃度、豆粕粉濃度和轉(zhuǎn)速之間存在著交互作用,其中豆粕粉與轉(zhuǎn)速之間的交互作用顯著。同時,米曲霉產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為:蔗糖濃度5.95%、豆粕粉濃度為1.60%、轉(zhuǎn)速為165 r/min,經(jīng)驗證實驗可知在最優(yōu)發(fā)酵工藝條件下,米曲霉產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活達到870.21 U/g,與預(yù)測值895.68 U/g接近,誤差為0.028%,表明該模型能較好的預(yù)測實際發(fā)酵情況,為低聚果糖中試及工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論基礎(chǔ)。

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Optimization of fermentation technology for production of fructosyltransferase withAspergillusoryzaeusing CCD response surface methods

WANG Peng,JIANG Bo,WANG Sheng-hai,FAN Sen,LIN Xiao-shan,ZHANG Yi*

(School of Bioscience and Bioengineering,South China University of Technology,Guangzhou 510006,China)

In order to produce fructosyltransferase in large scale,it is necessary to study and optimize the process conditions ofAspergillusoryzaestrains fermentation. Using sucrose,soybean meal powder and corn flour as the basic medium for fructosyltransferase synthesis in the cells,three significant factors that affect the fermentation course were selected through the Plackett-Burman optimization experiment. With analysis of the central composite design(CCD)response surface methods,the fermentation process has been further optimized and the results showed that:there were interactions between the concentration of sucrose,soybean meal powder and the rotation speed. The interaction between the concentration of soybean meal powder and the rotation speed was mainly significant. The best technical parameters were obtained as followed:the concentration of sucrose was 5.95%,the concentration of soybean meal powder was 1.60%,and the rotation speed was 165r/min. Under the optimal condition of fermentation,the enzyme activity of fructosyltransferase produced by fusion strainAspergillusoryzaeRIII-7 reached 870.21 U/g. It is close to the predictive value of 895.68 U/g,with an error of 0.028.

Aspergillusoryzae;fructosyltransferase;Plackett-Burman optimization;RSM;fermentation

2015-06-08

王鵬(1989-)，男，碩士，研究方向：發(fā)酵工程，E-mail:Mrwang_youxiang@163.com。

張毅(1964-)，男，博士，副教授，研究方向：發(fā)酵工程，E-mail:btyzhang@scut.edu.cn。

廣東省科技廳產(chǎn)學(xué)研資助項目(2013B090600028)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)03-0246-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.043