姬松茸發(fā)酵條件的優(yōu)化及其動(dòng)力學(xué)分析

曹新志,趙迎慶,游見(jiàn)明,劉　佳,任林生

(1.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院,四川自貢 643000;2.山東省臨沂思科生物科技有限公司,山東臨沂 276000)

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姬松茸發(fā)酵條件的優(yōu)化及其動(dòng)力學(xué)分析

曹新志1,趙迎慶2,游見(jiàn)明1,劉佳1,任林生1

(1.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院,四川自貢 643000;2.山東省臨沂思科生物科技有限公司,山東臨沂 276000)

在搖瓶條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上對(duì)姬松茸分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了3 L發(fā)酵罐分配發(fā)酵研究,基于Logistic和LuedekingPiret方程描述姬松茸菌體生長(zhǎng)、胞外多糖、底物消耗的代謝規(guī)律。結(jié)果表明最適培養(yǎng)條件為轉(zhuǎn)速152 r/min、通氣0.58 m3/h、接種量6%、溫度24.6 ℃、pH6.4。在此條件下，胞外多糖含量6.955 g/L，菌體干重1.420 g/100 mL。菌體生長(zhǎng)和胞內(nèi)活性多糖生成是同步的,得到描述分批發(fā)酵過(guò)程的動(dòng)力學(xué)數(shù)學(xué)模型和模型參數(shù),同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型參數(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證比較,模型計(jì)算與實(shí)驗(yàn)結(jié)果較好擬合。產(chǎn)活性多糖屬于偶聯(lián)型以及模型可用于預(yù)測(cè)發(fā)酵過(guò)程。

姬松茸,液體發(fā)酵,胞外多糖,動(dòng)力學(xué)分析

姬松茸(AgaricusblazeiMurill)又稱(chēng)“巴西蘑菇”、“小松菇”、“柏氏蘑菇”,在分類(lèi)學(xué)上隸屬于真菌門(mén)(Aumycota)、擔(dān)子菌亞門(mén)(Basidiomycotina)、層菌綱(Hymenomycetes),傘菌目(Agaricales),蘑菇科(Agaricaceae),蘑菇屬(Agaricus)[1],是1種珍稀的食藥兼用真菌[2]。在巴西圣保羅市周邊的草原、秘魯、美國(guó)加利福尼亞州、福羅里達(dá)州都有自然生長(zhǎng)的姬松茸。1945年首次被美國(guó)真菌學(xué)家A.Murrill發(fā)現(xiàn)。1967年比利時(shí)的海涅曼博士鑒定其為新種與雙孢菇同屬[3]。隨后,姬松茸傳到日本。1992年我國(guó)福建省從日本引進(jìn)了姬松茸并進(jìn)行栽培。此后才由福建傳到其他各個(gè)省份[4]。由于栽培姬松茸的溫度、濕度等條件比較苛刻,所以我國(guó)北方很少栽培姬松茸。

在以往對(duì)姬松茸液體發(fā)酵的研究中,大都停留在搖瓶發(fā)酵階段,但是要實(shí)現(xiàn)其大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)就必須經(jīng)歷發(fā)酵罐的放大實(shí)驗(yàn),所以從搖瓶到發(fā)酵罐的放大是發(fā)酵產(chǎn)品開(kāi)發(fā)過(guò)程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。但與搖瓶發(fā)酵相比發(fā)酵罐的發(fā)酵溫度、pH、罐壓、溶氧、轉(zhuǎn)速等發(fā)酵參數(shù)更容易檢測(cè)和控制,二者的區(qū)別主要體現(xiàn)在發(fā)酵罐可以對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)實(shí)時(shí)監(jiān)控,同時(shí)兩者在供氧能力和剪切力上也有較大的差別。本研究在搖瓶發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)上進(jìn)行了3 L發(fā)酵罐的發(fā)酵條件優(yōu)化,期望為進(jìn)一步工藝放大提供依據(jù)。

同時(shí)本文還研究了姬松茸的菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)和基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)以及胞外多糖產(chǎn)生動(dòng)力學(xué),應(yīng)用動(dòng)力學(xué)模型可以預(yù)測(cè)菌絲體的生長(zhǎng)狀態(tài),可以更為方便的通過(guò)動(dòng)力學(xué)模型實(shí)現(xiàn)對(duì)發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)化控制,同時(shí)這也為姬松茸液體發(fā)酵進(jìn)一步放大培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

姬松茸菌種(AgaricusBlazeiMurill)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菌種保藏中心提供;工業(yè)玉米漿天津利發(fā)隆化工科技有限公司;蔗糖、麥粒自貢農(nóng)貿(mào)市場(chǎng);液體母種發(fā)酵培養(yǎng)基馬鈴薯200 g,麩皮10 g,蔗糖20 g,KH2PO42 g,MgSO4.5H2O 0.2 g,蒸餾水1000 mL,pH自然;液體發(fā)酵培養(yǎng)基[5]蔗糖57.5 g/L,工業(yè)玉米漿2.05 g/L,KH2PO42 g/L,MgSO4.5H2O 0.2 g/L,VB10.01 g/L,蒸餾水1000 mL,pH自然;麥粒培養(yǎng)基煮熟的麥粒200 g,蔗糖10 g,KH2PO42 g,MgSO4.5H2O 0.2 g,碳酸鈣10 g,pH自然。

Biotech-3BGH 3 L發(fā)酵罐上海保興生物設(shè)備工程有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1Plackett-Burman設(shè)計(jì)Plackett-Burman設(shè)計(jì)法是一種兩水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,該法實(shí)驗(yàn)次數(shù)少同時(shí)可以將眾多的考察因素的影響效應(yīng)作主次排序,因此該方法被廣泛的應(yīng)用到生物工藝過(guò)程優(yōu)化中[6]。

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)以及食用菌發(fā)酵罐發(fā)酵的規(guī)律,實(shí)驗(yàn)選取的因素及編碼水平見(jiàn)表1,以菌體干重、胞外多糖含量為評(píng)價(jià)指標(biāo),利用design-expert 8.0軟件進(jìn)行Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

表1　Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼表Table 1　The factor and coding of the Plackett-Burman

1.2.2中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)響應(yīng)面分析法(Response Surface Analysis)是一種從多因素系統(tǒng)中尋求最佳條件的數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法[7],最常用的是二次回歸旋轉(zhuǎn)中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(Central Composite Design)和中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(Box-Behnken)[8]。利用design-expert 8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合得二次回歸方程,通過(guò)響應(yīng)面分析,分析模型顯著性、各因素的主效應(yīng)和交互效應(yīng),進(jìn)而尋求最優(yōu)影響因子的水平,最終得到最適液體發(fā)酵條件。

對(duì)于二因子數(shù)學(xué)模型可表述為:

Y=a0+a1x1+a2x2+a12x1x2+a11x12+a22x22

式(1)

上式中,Y為響應(yīng)值即姬松茸胞外多糖含量,a0為截距,a1、a2、a11、a22均為回歸模型的系數(shù)。

根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果進(jìn)行Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),以溫度、轉(zhuǎn)速、通氣、pH為自變量,接種量控制在8%,分別用A、B、C、D表示,并用-1、0、1代表編碼水平,以胞外多糖含量Y作為響應(yīng)值,實(shí)驗(yàn)因素水平見(jiàn)表2。

表2　實(shí)驗(yàn)因素水平Table 2　The factor of the Box-Behnken

1.2.3動(dòng)力學(xué)模型的建立在分批發(fā)酵過(guò)程中,發(fā)酵模型往往是根據(jù)微生物生長(zhǎng)、菌體代謝以底物消耗之間關(guān)聯(lián)建立的,然后通過(guò)實(shí)踐不斷的去驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性,這樣才能更好的去控制發(fā)酵過(guò)程。在本章節(jié)的研究中主要按菌體生長(zhǎng)、底物消耗、胞外多糖的積累三者之間的關(guān)系來(lái)對(duì)姬松茸液體發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行研究。

1.2.4姬松茸菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型目前對(duì)微生物菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型應(yīng)用廣泛的是Monod方程[9],Monod方程為典型的非結(jié)構(gòu)模型,該模型著眼于整個(gè)微生物群體的變化,不考慮個(gè)體細(xì)胞水平的變化,但相關(guān)表明研究Monod方程僅適用于細(xì)胞群體生長(zhǎng)緩慢且細(xì)胞密度較低的發(fā)酵環(huán)境[10],發(fā)酵過(guò)程中不應(yīng)存在高濃度底物抑制、代謝物反饋抑制、營(yíng)養(yǎng)物不足等導(dǎo)致的菌體生長(zhǎng)緩慢現(xiàn)象。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)發(fā)酵液中蔗糖濃度小于4.5 g/L時(shí)菌體生長(zhǎng)速率明顯下降并伴有溶菌現(xiàn)象,這說(shuō)明發(fā)酵液中的限制性底物對(duì)菌體生長(zhǎng)的限制性不能忽略,因此Monod方程不能做用作姬松茸菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型。

分批發(fā)酵生長(zhǎng)環(huán)境固定,所以在培養(yǎng)基各營(yíng)養(yǎng)成分固定情況下,從姬松茸發(fā)酵代謝分析可知,菌體生長(zhǎng)會(huì)有一個(gè)最大值點(diǎn),根據(jù)以上假設(shè)姬松茸菌體生長(zhǎng)曲線應(yīng)為S型,這與種群生長(zhǎng)規(guī)律類(lèi)似,在研究限制空間種群增長(zhǎng)規(guī)律時(shí)應(yīng)用廣泛的則為L(zhǎng)ogistic方程。Logistic方程是典型的S型曲線[11],這說(shuō)明Logistic方程可以很好地反映分批發(fā)酵過(guò)程中菌絲體生長(zhǎng)規(guī)律。Logistic方程模型見(jiàn)公式(2)。

μ=dX/dt=μmax(1-X/Xmax)

式(2)

式(2)中X:菌絲體干重,單位g/100 mL;t:發(fā)酵時(shí)間,單位h;μ:比生長(zhǎng)速率;μmax代表最大細(xì)胞比生長(zhǎng)速率;Xmax代表最大菌體濃度,單位g/100 mL。將(2)式積分得:

X(t)=(X0eμmaxt)/[1-X0/Xmax(1-eμmaxt)]

式(3)

表3　Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值Table 3　Plackett-Burman experimental design and results

式(3)中X0代表初始菌體濃度,單位g/100 mL。

在發(fā)酵剛開(kāi)始時(shí),X值比Xmax要小很多,所以此時(shí)(X0/Xmax)接近于0可以忽略不計(jì),說(shuō)明菌體呈現(xiàn)指數(shù)生長(zhǎng),但當(dāng)X值比Xmax相當(dāng)?shù)臅r(shí)候,這時(shí)說(shuō)明菌體生長(zhǎng)緩慢或者菌體停止生長(zhǎng)。在對(duì)姬松茸進(jìn)行分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)Logistic方程具有很好的適應(yīng)性。

1.2.5姬松茸胞外多糖生成動(dòng)力學(xué)模型胞外多糖是姬松茸發(fā)酵過(guò)程中分泌到細(xì)胞外的產(chǎn)物,根據(jù)搖瓶實(shí)驗(yàn)和發(fā)酵罐結(jié)果可知,胞外多糖在發(fā)酵初期有少量合成,當(dāng)發(fā)酵進(jìn)入平穩(wěn)期后胞外多糖開(kāi)始大量合成,因此可以將姬松茸胞外多糖合成類(lèi)型歸于部分相關(guān)型。目前對(duì)于此類(lèi)型產(chǎn)物合成的動(dòng)力學(xué)模型廣泛采用Luedeking-Piert模型[12-14]:

dp/dt=α(dx/dt)+βX(a≠0,β≠0)

式(4)

式(4)中α為生長(zhǎng)相關(guān)系數(shù),β為非生長(zhǎng)相關(guān)系數(shù),dP/dt為胞外多糖生成速度,P為胞外多糖濃度g/L。

當(dāng)t=0,P=P0時(shí),將式(2)代如式(4)得:

dp/dt=αμmax(1-X/Xmax)+βX(a≠0,β≠0)

式(5)

對(duì)式(5)積分得:

P(t)=P0+α[X(t)-X0]+β(Xmax/μmax)ln[1-X0/Xmax(1-eμmaxt)]

式(6)

1.2.6底物消耗動(dòng)力學(xué)模型根據(jù)發(fā)酵的搖瓶實(shí)驗(yàn)和發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)結(jié)果,姬松茸對(duì)蔗糖的利用呈現(xiàn)倒S形。培養(yǎng)中蔗糖主要有三個(gè)方面的用途:姬松茸菌體生長(zhǎng)消耗；維持姬松茸正常各項(xiàng)生命活動(dòng)消耗；合成胞外多糖消耗。因此姬松茸底物消耗動(dòng)力學(xué)模型可以表示為:

-dS/dt=(1/YX/S)(dx/dt)+(1/YP/S)(dP/dt)+mX

式(7)

式(7)中YX/S代表姬松茸菌體得率系數(shù),單位g/g;YP/S代表姬松茸胞外多糖得率系數(shù),單位g/g;S為蔗糖濃度,單位g/L;m為姬松茸菌體維持系數(shù)。

將式(2)與式(4)帶入式(7)中得:

-dS/dt=(1/YX/S)[μmax(1-X/Xmax)]+(1/YP/S)[αμmax(1-X/Xmax)+βX]+mX

式(8)

對(duì)式(8)積分得:

S(t)=S0-(1/YX/S+α/YP/S)[X(t)-X0]-(β/YP/S+m)(Xmax/μmax)ln[1-X0/Xmax(1-eμmaxt)]

式(9)

式(9)中S0代表當(dāng)t=0時(shí)蔗糖初始濃度。

1.3測(cè)定方法

1.3.1殘?zhí)堑臏y(cè)定DNS法測(cè)定還原糖[15],Roe比色法測(cè)定蔗糖[16]。

1.3.2生物量的測(cè)定參照周選圍生物量測(cè)定方法[17]。

1.3.3總糖的測(cè)定苯酚-硫酸法[18]。

1.3.4溶氧(DO)消耗的測(cè)定發(fā)酵液溶氧采用溶氧電極進(jìn)行測(cè)定。培養(yǎng)基滅菌結(jié)束循環(huán)水浴降溫至發(fā)酵溫度,向培養(yǎng)基通風(fēng)攪拌至溶解氧達(dá)到飽和,此時(shí)溶氧電極讀數(shù)定義為100.0。

1.3.5發(fā)酵液pH的測(cè)定采用pH電極進(jìn)行測(cè)定測(cè)定。

1.3.6發(fā)酵設(shè)備及培養(yǎng)基的滅菌實(shí)驗(yàn)選用食用油作為消泡劑,滅菌前往發(fā)酵罐內(nèi)滴加幾滴食用油,然后用牛皮紙包住空氣過(guò)濾器,尾氣出口由里到外依次用棉花、紗布、牛皮紙包裹,滅菌前用夾子夾住與罐體相連的硅膠管,然后在0.1MPa蒸汽滅菌20 min。

2　結(jié)果與討論

2.1Plackett-Burman設(shè)計(jì)

2.2因素主次的確定

2.2.1以姬松茸菌體干重為響應(yīng)值影響因素主次的確定利用design-expert 8.0軟件以姬松茸菌體干重為響應(yīng)值對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,分析結(jié)果如下表4。

由表4中的“Prob>F值”可以對(duì)實(shí)驗(yàn)影響因素主次做出排序,因素主次順序依次是A>B>E>C>D,即:溫度>轉(zhuǎn)速>通氣>pH>接種量。由表4中的顯著性檢驗(yàn)(p<0.01),可以看出溫度、轉(zhuǎn)速、通氣、pH,4個(gè)因素對(duì)姬松茸液體發(fā)酵有著極顯著的影響。

表4　偏回歸系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)Table 4　Partial regression coefficients and their significance test

注:“**”表示影響極顯著(p<0.01),表5同。

表5　偏回歸系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)Table 5　Partial regression coefficients and their significance test

2.2.2以姬松茸胞外多糖為響應(yīng)值影響因素主次的確定利用design-expert 8.0軟件以姬松茸胞外多糖為響應(yīng)值對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,分析結(jié)果如下表5。

由表5中的“Prob>F值”可以對(duì)實(shí)驗(yàn)影響因素主次做出排序,因素主次順序依次是A>B>E>C>D,即:溫度>轉(zhuǎn)速>通氣>pH>接種量。由表4中的顯著性檢驗(yàn)(p<0.01),可以看出溫度、轉(zhuǎn)速、通氣、pH,4個(gè)因素對(duì)姬松茸液體發(fā)酵有著極顯著的影響。

經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)無(wú)論是以菌體干重還是以胞外多糖為響應(yīng)值,溫度、轉(zhuǎn)速、通氣、pH,4個(gè)因素都對(duì)實(shí)驗(yàn)有著極顯著的影響。所以在接下來(lái)的研究實(shí)驗(yàn)中對(duì)溫度、轉(zhuǎn)速、通氣、pH,4個(gè)影響因素進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

2.3中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)

表6　中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6　Design and results of Box-Behnken design

續(xù)表

實(shí)驗(yàn)順序?qū)嶒?yàn)號(hào)X1X2X3X4菌體干重(g/100mL)胞外多糖(g/L)122700001.3406.73813230-1010.8736.597142600001.3796.77015500-1-11.1076.536161810-101.0075.513172800001.2956.865181401-101.2416.67719130-1-101.0836.44620700-111.1746.5532121-1000.8075.399222010101.0915.76323411000.8255.4302411-10011.0236.1342517-10-101.1356.0152610100-10.8535.536271601101.1446.778289-100-11.1716.257291210010.9655.638

表7　回歸模型方差分析Table 7　Analysis of variance of regression model

注:“*”表示影響顯著(0.01

2.4擬合模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)姬松茸菌絲生物量和多糖含量變化存在不平行性,生物量的提高不一定使有效成分多糖含量提高,所以姬松茸發(fā)酵條件優(yōu)化將以多糖產(chǎn)量是考慮的最終因素。

利用design-expert 8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,結(jié)果見(jiàn)表6。

數(shù)學(xué)模型經(jīng)二次回歸擬合,得以胞外多糖回歸方程預(yù)測(cè)模型:

Y=-26.4268+1.1408X1+0.0409X2+2.956X3+3.0946X4-2.9167X1X2+0.03X1X3+0.0433X1X4-4.6667X2X3+5.4167X2X4-0.3975X3X4-0.0283X12-2.1694X22-0.3533X32-0.374X42

利用design-expert 8.0軟件對(duì)二次回歸模型進(jìn)行分析,得到溫度、轉(zhuǎn)速、通氣、pH,4個(gè)因素之間的立體分析圖和等高線圖。結(jié)合圖1、圖2及design-expert 8.0軟件綜合分析得到姬松茸液體發(fā)酵胞外多糖最大值點(diǎn):溫度24.6 ℃、轉(zhuǎn)速152 r/min、通氣0.58 m3/h、pH6.4,此時(shí)胞外多糖7.0179 g/L(預(yù)測(cè)值)，菌體干重達(dá)到1.472 g/100 mL(預(yù)測(cè)值)。

圖1　溫度和轉(zhuǎn)速對(duì)胞外多糖響應(yīng)面圖Fig.1　Response surface for alternative effects of temperature and rotational speed on extracellular polysaccharide

圖2　溫度和pH對(duì)胞外多糖響應(yīng)面圖Fig.2　Response surface plots for alternative effects of temperature and pH on extracellular polysaccharide

實(shí)驗(yàn)優(yōu)化出發(fā)酵溫度24.6 ℃,考慮到發(fā)酵過(guò)程溫度的波動(dòng)性以及結(jié)合實(shí)驗(yàn)規(guī)律,最終確定姬松茸液態(tài)發(fā)酵溫度范圍24.6 ℃。為了證實(shí)上述優(yōu)化條件的可靠性,所以對(duì)優(yōu)化條件進(jìn)行3次以上的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明當(dāng)溫度24.6 ℃、轉(zhuǎn)速152 r/min、通氣0.58 m3/h、pH6.4時(shí),胞外多糖含量6.955 g/L,菌體干重1.420 g/100mL,同理論值相比,相對(duì)誤差分別為3.66%和0.904%。因此實(shí)驗(yàn)得到的姬松茸3 L液體發(fā)酵條件具有一定的可靠性和真實(shí)性。

2.5姬松茸3 L發(fā)酵罐發(fā)酵曲線及其動(dòng)力學(xué)分析

為了了解姬松茸液體發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化后對(duì)菌體干重和胞外多糖含量的影響,在發(fā)酵過(guò)程中每隔12 h進(jìn)行取樣,測(cè)定姬松茸發(fā)酵過(guò)程中菌體干重、胞外多糖、殘?zhí)呛康淖兓?并對(duì)姬松茸液體發(fā)酵曲線進(jìn)行簡(jiǎn)單的分析。結(jié)果見(jiàn)圖3～圖8。

圖3　姬松茸分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線Fig.3　The dynamics curve in batch fermentation of Agaricus Blazei Muril

2.5.1姬松茸菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)在發(fā)酵剛開(kāi)始時(shí),X值比Xmax要小很多,所以此時(shí)X0/Xmax接近于0可以忽略不計(jì),說(shuō)明菌體呈現(xiàn)指數(shù)生長(zhǎng),但當(dāng)X值比Xmax相當(dāng)?shù)臅r(shí)候,這時(shí)說(shuō)明菌體生長(zhǎng)緩慢或者菌體停止生長(zhǎng)。在對(duì)姬松茸進(jìn)行分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)Logistic方程具有很好的適應(yīng)性[19]。

式(3)可以表述為ln[X/(Xmax-X)-t]的函數(shù),即:

ln[X/(Xmax-X)]=μt-ln[(Xmax/X0)-1]

式(10)

通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)X0=0.004 g/100 mL,Xmax=1.417 g/100mL,以ln[X/(Xmax-X)]對(duì)t作圖可得μmax=0.0602 h-1,將模型參數(shù)帶入式(3)得姬松茸菌體生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)方程:

X(t)=0.004e0.0602t/1-(0.004/1.417)(1-e0.0602t)

利用origin 8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合得姬松茸菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型非線性擬合曲線,見(jiàn)圖4。

圖4　姬松茸菌體生長(zhǎng)擬合曲線Fig.4　The fitted curve on the growth of mycelium of Agaricus Blazei Murill

擬合方程相關(guān)系數(shù)R2=0.9616(0.01

2.5.2姬松茸胞外多糖生成動(dòng)力學(xué)當(dāng)姬松茸菌體生長(zhǎng)處于穩(wěn)定期時(shí),dX/dt=0,X=Xmax,所以此時(shí)Luedeking-Pirct方程dP/dt=βX,即:

β=(1/Xmax)(dP/dt)

式(11)

圖5　姬松茸分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線Fig.5　The dynamics curve in batch fermentation of Agaricus Blazei Muril

由于μmax、X0、Xmax均為已知,通過(guò)origin 8.0軟件可以計(jì)算出當(dāng)具體生長(zhǎng)趨于穩(wěn)態(tài)時(shí)dP/dt=0.156,帶入式(11),即可得出β=0.1101。

令a(t)=X(t)-X0,b(t)=Xmax/μmaxln[1-(X0/Xmax)(1-eμmaxt)],這時(shí)姬松茸胞外多糖動(dòng)力學(xué)模型可以寫(xiě)成:

P(t)=P0+αa(t)+βb(t)

式(12)

當(dāng)t=0時(shí),根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可得P=P0=0.026,所以:

P(t)=0.026+αa(t)+βb(t)

式(13)

式(13)可以看做P(t)-a(t)的一次函數(shù),對(duì)其作圖,可得直線斜率α=1.118。將模型參數(shù)μmax、X0、Xmax、α、β帶入方程(6)得姬松茸胞外多糖生成的動(dòng)力學(xué)方程:

P(t)=0.026+1.118[X(t)-0.004]+0.1101(1.417/0.0602)ln[1-(0.004/1.417)(1-e0.0602t)]

利用origin 8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合得姬松茸胞外多糖生成的動(dòng)力學(xué)模型非線性擬合曲線,見(jiàn)圖6。

圖6　姬松茸胞外多糖生成擬合曲線Fig.6　The fitted curve on the extracellular polysaccharide of Agaricus Blazei Murill

擬合方程相關(guān)系數(shù)R2=0.9828(0.01

姬松茸基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)

圖7　姬松茸分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線Fig.7　The dynamics curve in batch fermentation of Agaricus Blazei Muril

令α1=1/YX/S+α/YP/S,b1=β/YP/S+m,此時(shí)式(9)可以表述為:

S(t)=S0-α1[X(t)-X0]-b1(Xmax/μmax)ln[1-(X0/Xmax)(1-eμmaxt)]

式(14)

按照2.5.2中求解α、β的方法即可得出a1、b1的數(shù)值,即:a1=3.82、b1=0.087。將模型參數(shù)μmax、X0、Xmax、a1、b1帶入方程(14)得姬松茸基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)方程:

S(t)=57.5-3.82[X(t)-0.004]-0.087(1.417/0.0602)ln[1-(0.004/1.417)(1-e0.0602t)]

利用origin 8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合得姬松茸基質(zhì)消耗的動(dòng)力學(xué)模型非線性擬合曲線,見(jiàn)圖8。

圖8　姬松茸基質(zhì)消耗擬合曲線Fig.8　The fitted curve on the substrate consumption of Agaricus Blazei Murill

擬合方程相關(guān)系數(shù)R2=0.9873(0.01

3　討論

在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)姬松茸菌絲生物量和多糖含量變化存在不平行性,生物量的提高不一定使有效成分多糖含量提高,所以姬松茸發(fā)酵條件優(yōu)化將以多糖產(chǎn)量是考慮的最終因素。

本研究實(shí)在搖瓶發(fā)酵的基礎(chǔ)上進(jìn)行的3L發(fā)酵罐的放大實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不能進(jìn)行全程自動(dòng)化控制,人工抽樣檢測(cè)可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來(lái)一定的影響,需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)對(duì)其深入研究。

4　結(jié)論

在本章節(jié)的研究中確定了3 L發(fā)酵罐最適培養(yǎng)條件:溫度24.6 ℃、轉(zhuǎn)速152 r/min、通氣0.58 m3/h、pH6.4、接種量6%。經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),在此條件下菌體干重1.420 g/100mL,胞外多糖含量6.955 g/L,同理論值相比,相對(duì)誤差分別為3.66%和0.904%。

實(shí)驗(yàn)還對(duì)姬松茸分批發(fā)酵中菌體干重、胞外多糖、殘?zhí)呛康淖兓M(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析并建立數(shù)學(xué)模型,所得擬合方程如下:

姬松茸菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)方程

X(t)=0.004e0.0602t/1-(0.004/1.417)(1-e0.0602t)

姬松茸胞外多糖生成動(dòng)力學(xué)方程

P(t)=0.026+1.118[X(t)-0.004]+0.1101(1.417/0.0602)ln[1-(0.004/1.417)(1-e0.0602t)]

姬松茸基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)方程

S(t)=57.5-3.82[X(t)-0.004]-0.087(1.417/0.0602)ln[1-(0.004/1.417)(1-e0.0602t)]

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Optimization of submerge fermentation conditions ofAgaricusBlazeiMuril and dynamics analysis

CAO Xin-zhi1,ZHAO Ying-qing2,YOU Jian-ming1,LIU Jia1,REN Lin-sheng1

(1.Department of Bioengineering,Sichuan University of Science and Engineering,Zigong 643000,China;2.Shandong Linyi Sike biological technology Co.,LTD,Linyi 276000,China)

The 3 L fermentation tank allocation fermentation research aboutAgaricusBlazeiMuril batch fermentation dynamics was conducted on the basis of shaking flask conditions optimization,the metabolic regulation ofAgaricusBlazeiMurill bacteria growth,extracellular polysaccharide,substrate consumption were described based on Logistic and Luedekingpiret equation. The results showed that the optimum culture conditions were the stirring rate of 152 r/min,ventilation quantity of 0.58 m3/h,inoculation amount of 6%,temperature of 24.6 ℃ and pH at 6.4. Under the optimized conditions,1.420 g/100 mL for dry weight of mycelium,6.955 g/L for the amount of exopolysaccharides were achieved. Bacteria growth and the activity of intracellular polysaccharide generated were synchronous,the dynamic mathematical model and model parameters of describing the batch fermentation process were obtained,at the same time,the validation comparition about experimental data and model parameters were conducted,the model calculation and the experimental results had a good fitting. The active polysaccharide was classified as coupling model and the model could be used to predict the fermentation process.

AgaricusblazeiMurill;submerged cultivation;exopolysaccharides;dynamic analysis

2014-09-02

曹新志(1965-)，男，博士，教授，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail:caoxinzhi@163.com。

TS201.1

A

1002-0306(2016)03-0170-08

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.028