四川傳統(tǒng)發(fā)酵肉中乳酸菌的分離及發(fā)酵特性研究

黃　丹，劉有晴，于　華，毛　祥，劉達玉，程　華，汪禮全

(1.四川理工學院 生物工程學院,四川自貢 643000；2.肉類加工四川省重點實驗室,四川成都 610106)

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四川傳統(tǒng)發(fā)酵肉中乳酸菌的分離及發(fā)酵特性研究

黃丹1，劉有晴1，于華1，毛祥1，劉達玉2，程華1，汪禮全1

(1.四川理工學院 生物工程學院,四川自貢 643000；2.肉類加工四川省重點實驗室,四川成都 610106)

對四川傳統(tǒng)發(fā)酵肉中乳酸菌進行分離鑒定,并對其發(fā)酵特性進行研究。以四川臘肉為研究對象,采用平板劃線法對乳酸菌進行分離純化,利用16S rDNA的序列測定技術對其鑒定,并對分離菌株在不同溫度、pH、NaCl濃度、亞硝酸鹽濃度條件下的生長代謝、產(chǎn)酸能力進行研究,并對發(fā)酵產(chǎn)物中游離氨基酸進行測定分析。結果表明:篩選出的一株優(yōu)勢乳酸菌經(jīng)分子生物學鑒定為戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)。分離菌株對數(shù)生長期為6～18 h;最適發(fā)酵溫度30 ℃,發(fā)酵pH5.5;對NaCl及NaNO2耐受能力分別高達10%和150 mg/L;其代謝產(chǎn)物中共測出16種游離氨基酸,共包含5種人體必需氨基酸。

發(fā)酵肉,乳酸菌,鑒定,發(fā)酵特性,游離氨基酸

四川傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品主要包括臘肉、醬肉以及香腸等,雖然其前期生產(chǎn)工藝各不相同,但后熟工藝中微生物的代謝活動對其風味物質(zhì)形成都有同樣重要的貢獻。四川傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品后熟過程中的微生物主要有細菌(包括乳酸菌和球菌等)、霉菌(主要是青霉菌)、酵母菌(主要是漢遜氏德巴利酵母和法馬塔假絲酵母菌)等[1-2],其風味物質(zhì)的形成主要依賴于這些微生物的次級代謝特別是氨基酸代謝過程,如帶甲基分支的醛、次級醇、甲基酮、乙基酯、二甲基三硫化合物等。劉洋[1]在傳統(tǒng)工藝的基礎上,將乳酸菌和酵母菌株作為發(fā)酵劑接種于臘肉加工工藝過程中,發(fā)酵完成后實驗組的pH、水分含量以及NaNO2殘留量較未接種的產(chǎn)品低,產(chǎn)品口感及風味均有所提高。李湘麗[3]等對乳酸菌作為發(fā)酵劑在發(fā)酵香腸生產(chǎn)過程中的應用研究進展做了詳細的綜述,結果發(fā)現(xiàn)乳酸菌株不僅能改善產(chǎn)品風味,還能降低產(chǎn)品酸度,延長保質(zhì)期。乳酸菌作為發(fā)酵肉制品生產(chǎn)的重要功能菌,大多數(shù)研究者只關注其產(chǎn)酸特性,實際上,乳酸菌通過其代謝活動所產(chǎn)生的豐富氨基酸,對促進發(fā)酵肉制品風味物質(zhì)的形成具有重要作用[4]。因此,對該種類乳酸菌進行深入研究,有助于后續(xù)更加全面地對四川傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品風味物質(zhì)合成進行有效控制的探索。

本研究采用稀釋平板法對四川傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中乳酸菌進行分離鑒定,研究溫度、pH、NaCl濃度、亞硝酸鹽對其生長繁殖及產(chǎn)酸能力的影響,分析分離菌株發(fā)酵產(chǎn)物中氨基酸成分,以期為乳酸菌在傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中的應用提供基礎數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

四川農(nóng)家臘肉自制;NaOH,鄰苯二甲酸氫鉀,磺基水楊酸均為分析純,天津市天力化學試劑有限公司;氨基酸標準溶液(Asp、Glu、Ser、His、Gly、Thr、Arg、Ala、Tyr、Cys、Val、Met、Phe、Ile、Leu、Lys)上海西寶生物科技股份有限公司;MRS培養(yǎng)基。

Thermo酶標儀Multiskan FC,北京昊諾斯科技有限公司;日立L8900全自動氨基酸分析儀天美(中國)科學儀器有限公司。

1.2乳酸菌株分離鑒定

1.2.1乳酸菌分離純化采用傾注培養(yǎng)法[5],用已滅菌剪刀剪碎臘肉并對其進行10倍梯度稀釋,取10-4～10-7的稀釋液500 μL于含有2% CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)48 h,挑取有溶鈣圈的單菌落接種于MRS固體培養(yǎng)基中,進行多次劃線分離,挑選革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性的單菌落,并進行保藏。

1.2.2分離菌株DNA提取主要步驟為:取菌液于5 mL離心管中離心,取沉淀,加1.35 mL DNA抽提緩沖液、溶菌酶100 μL(10 mg/mL),于37 ℃搖床225 r/min振蕩30 min;加300 μL 20% SDS,于65 ℃溫浴2 h;加等體積酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1,v/v),于旋渦振蕩器振蕩2 min,靜置10 min,25 ℃ 13000 r/min離心20 min;取上層水相,加0.6倍體積異丙醇,室溫沉淀1～2 h;25 ℃ 13000 r/min,離心20 min,取沉淀;吸除異丙醇,加1 mL 70%乙醇,靜置10 min,4 ℃ 13000 r/min離心15 min,重復1次;棄上清,吹風20 min,除盡乙醇;加50～100 μL雙蒸水,65 ℃水浴1 h,4 ℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳對DNA提取結果進行檢測。

1.2.316S rDNA基因序列PCR擴增PCR擴增正向引物為27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;反向引物為1492R:5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。PCR擴增體系總體積50.0 μL,包括1.0 μL基因組DNA,5.0 μL10×Buffer(含2.5 mmol/L Mg2+),1.0 μL Taq聚合酶(5 U/μL),1.0 μL dNTP(10 mmol/L),1.5 μL正向引物,1.5 μL反向引物,39.0 μL ddH2O。采用超純無菌水替代基因組DNA作為PCR陰性對照[6]。

PCR擴增反應程序:94 ℃預變性3 min;94 ℃ 1 min,55 ℃ 1 min,72 ℃ 1.5 min,30個循環(huán),最后72 ℃延伸10 min。

將PCR擴增結果進行瓊脂糖凝膠電泳,并送往上海杰李生物技術有限公司進行序列測定。

1.2.4菌株同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建將菌株序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST同源性比對分析,運用MEGA6.0軟件的相鄰計算法構建系統(tǒng)發(fā)育樹,判定目的菌株分類地位。

1.3分離菌株發(fā)酵特性研究

1.3.1分離菌株生長曲線及產(chǎn)酸特性將分離菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h,以未接種菌液的MRS培養(yǎng)基做空白對照,每隔2 h取20 μL發(fā)酵液采用酶標儀測定其OD600值,每隔4 h取10 mL發(fā)酵液,采用電位滴定法測定總酸含量,每個樣平行測定三次。

1.3.2溫度對分離菌株生長代謝的影響將分離菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中,分別于20、30、40、50 ℃條件下培養(yǎng)24 h,以未接種菌液的培養(yǎng)基作空白對照,OD值與總酸測定同1.3.1,研究溫度對分離菌株生長代謝的影響。

1.3.3pH對分離菌株生長代謝的影響將分離菌株接種于pH分別為3.5、5.5、7.5、9.5的MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h,以未接種菌液的培養(yǎng)基作空白對照,OD值與總酸測定同1.3.1,研究pH對分離菌株生長代謝的影響。

1.3.4NaCl對分離菌株生長代謝的影響將分離菌株接種于含鹽量分別為0%、2%、4%、6%的MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h,以未接種菌液的培養(yǎng)基作空白對照,OD值與總酸測定同1.3.1,研究NaCl對分離菌株生長代謝的影響。

1.3.5亞硝酸鹽對分離菌株生長代謝的影響將分離菌株接種于含亞硝酸鈉含量分別為0、50、100、150 mg/L的MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h,以未接種菌液的培養(yǎng)基作空白對照,OD值與總酸測定同1.3.1,研究亞硝酸鹽對分離菌株生長代謝的影響。

1.4分離菌株發(fā)酵產(chǎn)物氨基酸成分分析

樣品前處理:取菌株發(fā)酵液500 μL于 25 mL容量瓶中,加入 10 mL 8%磺基水楊酸溶液,定容至刻度線。靜置15 min,取一定量溶液過0.22 μm濾膜。所得濾液進行氨基酸分析。

檢測條件[7-8]:Biochrom Li型陽離子交換樹脂,4.6 μm×200 mm;測定波長570、440 nm;緩沖液流速25.0、31.2 mL/h;柱溫程序:起始溫度為31 ℃,11.5 min后以3 ℃/min,升溫至65 ℃,約35 min后以3 ℃/min升溫至76 ℃,52 min后以3 ℃/min降溫至31 ℃;茚三酮溶液流速20.0 mL/h;分析時間125 min,進樣量20 μL。每個樣品重復進樣2次。

2　結果與分析

2.1乳酸菌的分離鑒定

2.1.1乳酸菌形態(tài)學鑒定通過其產(chǎn)酸量的測定,篩選出一株優(yōu)勢乳酸菌株S8,其菌落形態(tài)為:乳白色,有光澤,邊緣整齊,表面光滑,不透明;其菌體特征為:G(+),球狀。

2.1.2乳酸菌DNA提取及16S rDNA擴增菌株DNA電泳圖見圖1所示,條帶清晰,雖有DNA斷裂的痕跡但仍可用于后續(xù)PCR擴增。對該DNA進行PCR擴增,PCR擴增產(chǎn)物通過凝膠電泳直接檢測,電泳圖見圖2所示。由圖2可知,PCR產(chǎn)物條帶明亮清晰,條帶長度為1400 bp左右,說明PCR擴增很成功,適合用于測序。

圖1　 DNA電泳圖Fig.1　DNA chart

圖2　PCR擴增圖Fig.2　PCR amplification chart

2.1.3乳酸菌同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構建由Mega6.0軟件,繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3所示。由圖3可知,分離菌株S8與戊糖片球菌PediococcuspentosaceusDSM 20336的16S rDNA的同源性高達100%,且系統(tǒng)位置最接近,因此分離菌株鑒定為戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)。

圖3　分離菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3　Phylogenetic tree of isolated strain

2.2分離菌株發(fā)酵特性研究

2.2.1分離菌株生長曲線及產(chǎn)酸特性分離菌株生長曲線如圖4,由圖可知,分離菌株在接種6 h后進入對數(shù)生長期,18 h左右進入平穩(wěn)期。分離菌株產(chǎn)酸特性如圖5所示,菌株在接種4 h后發(fā)酵物中總酸濃度逐漸升高;進入穩(wěn)定期后,菌株發(fā)酵液中總酸仍有上升,說明該分離菌株符合發(fā)酵肉制品發(fā)酵劑的要求,可使環(huán)境pH下降,因此能抑制腐敗菌的生長[9],提高產(chǎn)品的安全性。

圖4　分離菌株生長曲線Fig.4　Growth curve of isolated strain

圖5　分離菌株產(chǎn)酸曲線Fig.5　Production curve of isolated strain

2.2.2發(fā)酵溫度對分離菌株生長代謝的影響溫度對于菌株生長及產(chǎn)酸影響較大,由圖6可知:環(huán)境溫度從20～30 ℃,分離菌株的OD值與總酸逐漸升高,當溫度高于30 ℃時,其OD值開始下降;當溫度繼續(xù)升高,菌株的生長及產(chǎn)酸能力受到極大的抑制,因此該分離菌株最適發(fā)酵溫度為30 ℃。

圖6　溫度對分離菌株生長及產(chǎn)酸影響Fig.6　Temperature effect on growth and acid production of isolated strain

2.2.3發(fā)酵pH對分離菌株生長代謝的影響不同pH對菌株生長及產(chǎn)酸能力的影響程度不同,由圖7可知:分離菌株在過酸或過堿情況下,生長能力受到抑制,其最適作用pH為5.5～6.0左右,而環(huán)境pH的改變對菌株產(chǎn)酸能力的影響不大,但在pH5.5時產(chǎn)酸量達到最大,為1.1958 g/100 mL,因此分離菌株的最適發(fā)酵pH為5.5。

2.2.4NaCl對分離菌株生長代謝的影響對NaCl的耐受能力是選擇發(fā)酵肉制品發(fā)酵劑的一個重要因素,且篩選出的菌株要求能夠至少在6%的食鹽濃度下正常生長[2]。由圖8可知:分離菌株對食鹽有較好的耐受力,在鹽濃度為0%～6%范圍內(nèi)OD值及總酸量變化不大,但在鹽濃度大于6%(8%～10%)時,該菌株生長及產(chǎn)酸能力均有所下降卻仍能生長,說明該分離菌株在肉制品發(fā)酵過程中有較強的競爭力,可作為肉制品的發(fā)酵劑。

表1　分離菌株氨基酸含量Table 1　Contents of free amino acids from strains

圖7　pH對分離菌株生長及產(chǎn)酸的影響Fig.7　pH effect on growth and acid production of isolated strain

圖8　NaCl濃度對分離菌株生長及產(chǎn)酸的影響Fig.8　NaCl concentration effect on growth and acid production of isolated strain

注:“-”表示未檢測出,“*”表示必需氨基酸。

2.2.5亞硝酸鹽對分離菌株生長代謝的影響國家規(guī)定亞硝酸鈉在肉制品中的最大使用量是150 mg/kg,最大殘留量不超過30 mg/kg,詳見國標GB2762-2005和GB2760-2011。一般要求菌株至少在150 mg/kg的亞硝酸鹽濃度下能良好的生長[10]。由圖9可知:隨著培養(yǎng)基中NaNO2濃度的增加分離菌株的生長及產(chǎn)酸能力大幅下降,當NaNO2濃度增加至150 mg/L時,該分離菌株生長能力明顯下降,但該菌在此濃度下仍能生長,表明該分離菌株具有良好的亞硝酸鹽耐受性,符合肉制品發(fā)酵劑的要求。

圖9　NaNO2濃度對分離菌株生長及產(chǎn)酸的影響Fig.9　NaNO2 concentration effect on growth and acid production of isolated strain

2.3分離菌株發(fā)酵產(chǎn)物中氨基酸成分分析

對分離菌株發(fā)酵產(chǎn)物中的氨基酸成分進行測定,其計算結果見表1。由表1可知:菌株的發(fā)酵液中檢測出了多種游離氨基酸,其總氨基酸量為0.95 mg/L,其中共含有5種人體必需氨基酸,占氨基酸總量的23.16%;在發(fā)酵肉制品中,乳酸菌的存在可大大促進蛋白質(zhì)分解為游離氨基酸,分離菌株的代謝產(chǎn)物中必需氨基酸含量占總游離氨基酸量(實驗組減去對照組的含量)較文獻[1]高,因此將該分離菌株作為發(fā)酵肉制品的發(fā)酵劑不僅有利于增加發(fā)酵肉產(chǎn)品中的游離氨基酸含量,而且可使其風味更加濃郁。

3　結論

本文通過從四川傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中分離篩選出一株優(yōu)勢乳酸菌,經(jīng)16S rDNA測序及系統(tǒng)發(fā)育樹構建,確定分離菌株為戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)。通過對分離菌株發(fā)酵特性研究,該分離菌株對數(shù)生長期為6～18 h;最適發(fā)酵溫度30 ℃,發(fā)酵pH5.5;對NaCl及NaNO2耐受能力分別高達10%和150 mg/L;該菌株的代謝產(chǎn)物中含有多種游離氨基酸,其中必需氨基酸含量占氨基酸總量的23.16%。本研究數(shù)據(jù)表明該分離菌株適合作為傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品發(fā)酵劑,可為工業(yè)化實行純菌種生產(chǎn)的發(fā)酵肉制品業(yè)提供菌種支持。

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Study on the isolation of lactic acid bacteria from Sichuan traditional fermented meat and its fermentation characteristics

HUANG Dan1,LIU You-qing1,YU Hua1,MAO Xiang1,LIU Da-yu2,CHENG Hua1,WANG Li-quan1

(1.School of Biotechnology Engineering,Sichuan University of Science and Engineering,Zigong 643000,China；2.Sichuan Province Key Laboratory of meat processing,Chengdu 610106,China)

The dominant lactic acid bacteria was isolated and identified from Sichuan traditional fermented meat products and its fermentation characteristics were investigated. Using Sichuan Bacon as the research object,lactic acid bacteria were isolated and purified by plate marking method,and it was identified by 16S rDNA sequencing technique. Its growth metabolism and acid production capacity on the different temperature,pH,NaCl concentration,nitrite concentration and fermentation products of amino acid were researched. The results showed that the dominant lactic acid bacteria was screened and identifiedPediococcuspentosaceus. The logarithmic growth phase of strain was 6～18 h,the optimum fermentation temperature was 30 ℃,fermentation pH was 5.5,the strain also had good endurance abilities to the salt concentration 10% and the nitrite content 150 mg/L,and it could release 16 kinds of free amino acids,including 5 kinds of essential amino acids.

fermented meat;lactic acid bacteria;identification;fermentation characteristics;free amino acids

2015-07-09

黃丹(1968-),女,本科,教授,主要從事微生物及應用方面的研究,E-mail:huangdan3212006@126.com。

肉類加工四川省重點實驗室重點項目(14-R02)；四川理工學院學科建設工程資助項目(2013TS13)。

TS251.1

A

1002-0306(2016)03-0149-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.023