青磚茶提取物不同極性部位對三種細菌的抑制作用研究

楊清華,楊新河,傅本重,覃彩芹,黃明軍,呂幫玉

(1.湖北工程學院生命科學技術(shù)學院,湖北孝感 432000;2. 特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點實驗室,湖北孝感 432000;3.湖北大學生命科學學院,湖北武漢 430062;4.湖北工程學院化學與材料科學學院,湖北孝感 432000)

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青磚茶提取物不同極性部位對三種細菌的抑制作用研究

楊清華1,2,3,楊新河1,2,*,傅本重1,2,覃彩芹4,黃明軍1,2,3,呂幫玉1,2

(1.湖北工程學院生命科學技術(shù)學院,湖北孝感 432000;2. 特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點實驗室,湖北孝感 432000;3.湖北大學生命科學學院,湖北武漢 430062;4.湖北工程學院化學與材料科學學院,湖北孝感 432000)

采用濾紙片法測定青磚茶提取物不同極性部位氯仿層、乙酸乙酯層、正丁醇層及水層對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑制性能,并測定它們的最小抑菌濃度和總酚含量。結(jié)果表明:乙酸乙酯層對三種菌的抑制效果最優(yōu),當其濃度為100 mg/mL時,對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑依次為29.19、27.97、27.35 mm;最小抑菌濃度依次為1.56、3.12、6.25 mg/mL;總酚含量高達81.62%,提示總酚為其抑菌的主要活性成分。

青磚茶,提取物,不同極性部位,抑菌

黑茶,是中國六大茶類之一,是中國特有的一大茶類,屬于后發(fā)酵茶。其生產(chǎn)歷史悠久,主產(chǎn)于湖南、湖北、云南、四川、廣西等地,以制成緊壓茶主要銷往西藏、內(nèi)蒙、新疆、青海、甘肅、寧夏等邊疆地區(qū)。近年來研究表明,黑茶對糖尿病、高血脂、肥胖等糖脂代謝性疾病具有良好的保健效果[1-7],逐漸成為茶葉消費的新熱點,因而內(nèi)銷市場日漸擴大,整個黑茶產(chǎn)業(yè)呈現(xiàn)良好的發(fā)展態(tài)勢。

青磚茶是黑茶的一種,主產(chǎn)于湖北赤壁、咸寧、通山、崇陽、通城等縣及湖南臨湘市,采用老青茶為主要原料,經(jīng)篩分、拼配、蒸汽壓制定型、干燥等特定工藝制成,具有色澤青褐、內(nèi)質(zhì)香氣純正無青氣、滋味純正、湯色深黃紅稍亮、葉底暗褐呈豬肝色等特有品質(zhì)。青磚茶儲藏年份越久,風味品質(zhì)越好。

近年來,關(guān)于茶葉抑菌方面的報道多局限于普通綠茶、紅茶、普洱茶和烏龍茶對口腔致病菌或綠茶、普洱茶對食源性微生物和致病菌的抑制效果研究[8-14],但關(guān)于青磚茶對有害菌的抑制作用未有研究報道。另外,GB/T 9833.9-2013緊壓茶中規(guī)定青磚茶含水量不超過12%[15],其長年室內(nèi)倉庫自然貯藏中不易出現(xiàn)霉變,說明青磚茶可能有較強抑菌作用。本文以青磚茶作為研究材料,采用濾紙片法測定其提取物不同極性部位對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌三種細菌的抑制性能,并測定它們的最小抑菌濃度和茶多酚含量,旨在探明青磚茶對上述三種菌的抑制作用及活性部位,初步探討抑菌效果與多酚類的相關(guān)性,為深入研究明確青磚茶抑菌活性成分并揭示其抑菌機理提供基礎(chǔ),也為將其深度開發(fā)成天然抑菌物質(zhì)提供科學依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

青磚茶赤壁市青磚茶專賣點,2014年趙李橋茶廠生產(chǎn);牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1000 mL、瓊脂15～20 g、pH7.0～pH7.2,121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min,備用;液體培養(yǎng)基不加瓊脂;大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌湖北工程學院生命科學技術(shù)學院菌種保存實驗室。

SW-CJ-2G型雙人凈化工作臺蘇州凈化設(shè)備有限公司;SPX-250B-Ⅲ型生化培養(yǎng)箱上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;LDZX-75KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠;QSB-100型高速多功能粉粹機永康市樂趣工貿(mào)有限公司;RE-52-99型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮有限公司;SHZ-D(III)型循環(huán)水多用真空泵鞏義市科華儀器設(shè)備有限公司;DC-1006型節(jié)能型恒溫槽寧波新芝生物科技有限公司;DZKW-S-4型電熱恒溫水浴鍋北京市永光明醫(yī)療儀器廠;752型紫外可見光分光光度計上海舜宇恒平科學儀器有限公司;ZHWY-211B型恒溫培養(yǎng)振蕩器上海智誠分析儀器制造有限公司。

1.2青磚茶提取物的制備

稱取適量粉碎至60目的青磚茶樣品,按照料液比1∶10(m/v)加入煮沸的蒸餾水,在沸水浴中浸提15 min,過濾,濾渣按照同樣的方法浸提2次,合并3次濾液,濾液濃縮至原有體積的1/3。量取一定體積的濃縮液經(jīng)冷凍干燥制備成水提取物,余下的濾液依次用等體積的氯仿、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次,制得氯仿萃取層、乙酸乙酯萃取層、正丁醇萃取層及水層,分別濃縮凍干得到氯仿層、乙酸乙酯層、正丁醇層和水層部位樣品,密閉保藏,備用。

1.3菌懸液的制備

首先采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基活化供試菌種,接著用液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)活化的菌種12小時,然后在波長600 nm處用無菌的液體培養(yǎng)基調(diào)零后測定含菌培養(yǎng)液的吸光值,再將含菌培養(yǎng)液稀釋至吸光值約0.200,最后進行10倍法稀釋,其中大腸桿菌和枯草芽孢桿菌稀釋至102,金黃色葡萄球菌稀釋至103,得到菌懸液。

1.4濾紙片法測定抑菌作用

將青磚茶提取物不同極性部位凍干品用無菌水配制成100 mg/mL的溶液,把直徑6 mm滅菌濾紙片分別置入各溶液中浸泡24 h,取菌懸液0.1 mL,滴入平皿中倒有固體培養(yǎng)基的表面,用涂布器使其均勻涂布在培養(yǎng)基表面,用無菌鑷子夾取已浸泡的濾紙片置入含菌平皿中,每皿4片,每個菌種重復(fù)做2皿,并用無菌水浸泡的濾紙片做對照。37 ℃培養(yǎng)24 h后用十字交叉法測定抑菌圈直徑。

1.5最小抑菌濃度測定

將青磚茶提取物不同極性部位凍干品用無菌水配制成濃度為100 mg/mL的原液,然后將各原液稀釋配成濃度為75、50、37.5、25、18.75、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39 mg/mL溶液。測定相應(yīng)部位樣品對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度。在無菌培養(yǎng)皿中分別加入1.5 mL不同極性部位各濃度溶液和15 mL熔化的培養(yǎng)基,混勻,待培養(yǎng)基凝固后,取0.1 mL菌懸液于培養(yǎng)基上涂布均勻,不同極性部位各濃度溶液重復(fù)2次,同時以1.5 mL無菌水替代不同極性部位溶液的培養(yǎng)基作為空白對照,將各培養(yǎng)皿放入37 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24 h后觀察,以培養(yǎng)皿中完全無菌生長的最低濃度作為相應(yīng)部位樣品對相應(yīng)菌的最小抑菌濃度。

1.6青磚茶中茶多酚測定

參照GB/T 8313-2008茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法略作改動后進行各樣品中總多酚的測定[16]。取1 mL經(jīng)過處理稀釋后的提取物溶液,加入5 mL福林酚試劑,搖勻,反應(yīng)3～8 min,加入4 mL 7.5%的碳酸鈉溶液,搖勻,室溫放置1 h,用比色皿在765 nm波長下用分光光度計測定吸光值。配制標準品沒食子酸濃度梯度為10、20、30、40、50 μg/mL。按照上述方法測定得到吸光值,根據(jù)沒食子酸濃度(X,μg/mL)和反應(yīng)后的吸光值(Y)做出標準曲線為y=0.0101x+0.0295(R2=0.999),各樣品中總多酚的含量以每克樣品中含有相當于沒食子酸的毫克數(shù)表示后換算成百分含量。

1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

青磚茶提取物不同部位對三種菌的抑菌作用以抑菌圈直徑的平均數(shù)±標準差表示;組間差異用方差分析檢驗。

2　結(jié)果與分析

2.1濾紙片法測定青磚茶提取物不同極性部位的抑菌作用

表1　青磚茶提取物不同極性部位對實驗菌的抑菌圈直徑結(jié)果(mm)Table 1　Result of antimicrobial diameters on inhibiting test bacterias of different polar fractions from Qingzhuan brick tea extract(mm)

注:樣品濃度均為100 mg/mL,空白對照均無抑菌圈,“-”表示無抑菌圈,同列不同大寫字母表示極顯著差異水平(p<0.01),小寫字母表示顯著差異水平(p<0.05)。

當青磚茶提取物不同極性部位的濃度為100 mg/mL時,它們對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑結(jié)果見表1所示,水提物、氯仿層、乙酸乙酯層、正丁醇層和水層對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌均有抑制作用,水提物、氯仿層、乙酸乙酯層、正丁醇層對金黃色葡萄球菌有抑制作用。其中乙酸乙酯層對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑制活性最強,對應(yīng)的抑菌圈直徑為29.19、27.97,27.35 mm,與另外四種樣品的抑菌圈直徑比較,均達到極顯著差異水平(p<0.01)。水提物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑制活性位居第二,抑菌圈直徑分別為18.94、18.66，18.84 mm,均明顯大于正丁醇層、氯仿層和水層對三種菌的抑菌圈。從表1中還可知,正丁醇層對三種菌的抑制活性居乙酸乙酯層和水提物之后,氯仿層和水層對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑制作用相當且較弱,氯仿層對金黃色葡萄球菌有輕微的抑制作用,而水層沒有抑制作用。

2.2最小抑菌濃度的測定

由表2可知,對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度從低到高依次為乙酸乙酯層1.56 mg/mL、正丁醇層 6.25 mg/mL、水提物18.75 mg/mL和氯仿層75 mg/mL,而水層對金黃色葡萄球菌沒有抑制作用,不能求得最小抑菌濃度;對大腸桿菌的最小抑菌濃度從低到高依次為乙酸乙酯層6.25 mg/mL、正丁醇層12.5 mg/mL、水提物18.75 mg/mL、氯仿層37.5 mg/mL和水層37.5 mg/mL;對枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度從低到高依次為乙酸乙酯層3.125 mg/mL、正丁醇層12.5 mg/mL、水提物18.75 mg/mL、氯仿層50 mg/mL和水層50 mg/mL。由上可知,對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度以乙酸乙酯層最低,其次是正丁醇層,然后是水提物,而氯仿層和水層的最小抑菌濃度接近且較高。

表2　青磚茶提取物不同極性部位 對試驗菌的最小抑菌濃度(mg/mL)Table 2　The minimum bacteriostasis concentration of different polar fractions from Qingzhuan brick tea extract(mg/mL)

注:“-”表示抑制作用，不能求得最小抑菌濃度。

2.3青磚茶提取物不同極性部位中總酚含量測定

由表3可知,青磚茶提取物不同極性部位中總酚含量排序為乙酸乙酯層>正丁醇層>水提物>水層>氯仿層,且相互比較達到極顯著差異水平(p<0.01)。結(jié)合它們對三種菌的最小抑菌濃度可知,乙酸乙酯層、正丁醇層、水提物中多酚的含量高低與三者對三種菌的最小抑菌濃度值大小正好相反,而氯仿層與水層中多酚含量遠低于乙酸乙酯層、正丁醇層和水提物,且二者抑菌較弱。這在一定程度上表明多酚對它們的抑菌作用起了至關(guān)重要的作用,尤其是乙酸乙酯層中總多酚含量高達81.62%,意味著總多酚為其抑菌的主要成分。

表3　青磚茶提取物不同極性部位的總酚含量(%)Table 3　Total polyphenol content of different polar fractions of Qingzhuan brick tea extract(%)

注:表中不同字母表示二者比較達極顯著差異水平(p<0.01)。

3　討論

天然抑菌防腐物質(zhì)無毒無害,成為當今世界各國研究的熱點。而茶葉作為一種傳統(tǒng)的純天然植物飲品,富含有茶多酚、茶色素、茶多糖、茶皂素等多種功能性成分,相關(guān)學者通過研究表明其具有廣譜、強效的抑菌作用[10-14,17-18]。本文結(jié)果表明,青磚茶對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌有抑菌效果,與前人研究的茶葉抑菌效果相吻合。因而在一定程度上說明青磚茶含有茶葉抑菌作用的共性成分,也說明青磚茶有開發(fā)成天然抑菌防腐物質(zhì)的潛力。

研究表明,正丁醇層對三種菌的最小抑菌濃度低于水提物,而二者濃度為100 mg/mL時,正丁醇層對三種菌的抑菌圈直徑小于水提物。這可能是二者濃度超過最小抑菌濃度后,它們的濃度與對三種菌的抑菌圈直徑的相關(guān)系數(shù)不同所致,至于具體原因有待進一步研究。

本研究還表明,相同部位對三種菌的抑制作用有所不同,這可能是由于三種細菌在結(jié)構(gòu)上的差異造成的,不同的細菌對相同成分的耐受力不同;不同部位對同一種菌抑制作用強弱不同,這顯然是不同極性部位中所含的抑菌化學成分結(jié)構(gòu)和數(shù)量等差異所致。而關(guān)于茶葉抑菌化學成分研究集中于茶多酚,且其抗菌活性早在100年前就被證實[19],國內(nèi)外學者長期致力于茶多酚對典型食品致病菌及腐敗菌的抑制作用和與多種抗生素的協(xié)同抗菌作用研究,并十分注重茶多酚破壞細胞膜的功能、對細菌特定靶蛋白的抑制作用和氧化抑菌作用等抑菌機制研究[20-29],促使茶多酚成為了目前廣泛應(yīng)用的天然食品保鮮劑,同時為茶多酚有望作為新型的抗菌劑應(yīng)用于治療多種細菌、真菌與病毒引起的感染提供了極其重要的科學依據(jù)?；谇啻u茶提取物乙酸乙酯層的抑菌效果表現(xiàn)突出,茶多酚含量高達80%以上,因而下一步可以將乙酸乙酯層作為研究重點,采用柱層析、制備型液相色譜、高速逆流色譜等方法對其進行分離純化,同時跟蹤進行抑菌活性研究,探明其抑菌活性的主要酚類物質(zhì)結(jié)構(gòu)及抑菌作用機理,進而將其開發(fā)為植物源抑菌劑廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域。

4　結(jié)論

青磚茶提取物不同極性部位氯仿層、乙酸乙酯層、正丁醇層及水層對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑制效果有所不同,其中以乙酸乙酯層的抑制效果最優(yōu),其濃度為100 mg/mL時,對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑依次為29.19、27.97、27.35 mm;最小抑菌濃度依次為1.56、3.12、6.25 mg/mL;總酚為其抑菌的主要活性成分。

[1]Cao Z H,Gu D H,Lin Q Y,et al. Effect of Pu-Erh tea on body fat and lipid profiles in rats with diet-induced obesity[J]. Phytotherapy Research,2011,25(2):234-238.

[2]Yuan H B,Zhong J,Yi J,et al. Effect of Pu-Erh tea on lipogenesis and expression of relative genes in obese rats fed with high fat diet[J]. Acta Nutrimenta Sinica,2009,31(2):167-171.

[3]楊新河. 普洱茶色素提取、分級及生物活性研究[D]. 長沙:湖南農(nóng)業(yè)大學,2011.

[4]熊昌云,屠幼英,歐陽梅,等. 人工接種發(fā)酵茯磚茶降脂減肥作用研究[J]. 菌物學報,201l,30(2):349-354.

[5]陳玉瓊,張偉,程倩,等. 湖北青磚茶減肥作用研究[J]. 茶葉科學,2008,28(5):363-369.

[6]陳玉瓊,張偉,倪德江,等. 湖北青磚茶輔助降血脂作用及其抗氧化效果[J]. 茶葉科學,2010,30(2):124-128.

[7]Li Q,Liu Z H,Huang J A,et al. Anti-obesity and hypo1ipidemic effects of Fuzhuan brick tea water extract in high-fat diet-induced obese rats[J]. Joumal of the Science of Food and Agriculture,2013,93(6):1310-1316.

[8]任蕾,楊圣輝,果梅英. 六種茶葉對口腔常見致病菌的抑菌作用[J]. 北京口腔學,2003,11(2):91-93.

[9]魯曉晴,王斌,閻志勇. 茶葉水浸液對口腔致病菌抑菌效果的研究[J]. 中國消毒學雜志,2009,26(1):25-26.

[10]胡永金,喬金玲,葛長榮. 普洱茶與綠茶提取物體外抑菌效應(yīng)的研究[J]. 食品科學,2009,30(13):56-59.

[11]Wu S C,Yen G C,Wang B S. Antimutagenic and antimicrobial activities of Pu-erh tea[J]. Food Science and Technology,2007,40(3):506-512.

[12]胡永金,韓小溪,薛橋麗,等. 普洱茶不同提取物體外抑菌活性研究[J]. 現(xiàn)代食品科技,2013,29(8):1765-1770.

[13]Hu Y J,Jia J J,Qiao J L,et al. Antimicrobial activity of pu-erh tea extractsinvitroand its effects on the preservation of cooled mutton[J]. Journal of Food Safety,2010,30(1):177-195.

[14]葉兆偉,李洵,李盡哲. 信陽毛尖夏茶鮮葉中茶多酚的微波提取及抑菌活性[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學,2014,42(6):164-167.

[15]GB/T 9833.9-2013,緊壓茶 第9部分:青磚茶[S].

[16]GB/T 8313-2008,茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法[S].

[17]Lee H C,Jenner A M,Low C S,et al. Effect of tea phenolics and their aromatic fecal bacterial metabolites on intestinal microbiota[J]. Research in Microbiology,2006,157(9):876-884.

[18]許靖逸,崔修丹,陳昌輝,等. 六大茶類對部分腸道致病菌抑菌效果的研究[J]. 食品工業(yè)科技,2013,34(16):140-142.

[19]Mcnaught J G. On the action of cold or lukewarm tea on Bacillus typhosus[J]. Journal of the Royal Army Medical Corps,1906,7:372-373.

[20]Gordon N C,Wareham D W. Antimicrobial activity of the green tea polyphenol(-)-epigallocatechin-3-gallate(EGCG)against clinical isolates of Stenotrophomonas maltophilia[J]. International Journal of Antimicrobial Agents,2010,36:129-131.

[21]Reygaert W C. The antimicrobial possibilities of green tea[J].Front Microbiology,2014,5:434.

[22]Cui Y,Oh Y J,Lim J,et al. AFM study of the differential inhibitory effects of the green tea polyphenol(-)-epigallocatechin-3-gallate(EGCG)against Gram-positive and Gram-negative bacteria[J]. Food Microbiology,2012,29(1):80-87.

[23]Yi S,Li J,Zhu J,et al. Effect of tea polyphenols on microbiological and biochemical quality of Collichthys fish ball[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture,2011,91(9):1591-1597.

[24]Araghizadeh A,Kohanteb J,Fani M M. Inhibitory activity of green tea(Camellia sinensis)extract on some clinically isolated cariogenic and periodontopathic bacteria[J]. Medical Principles and Practice,2013,22(4):368-372.

[25]董璐,代增英,韓晴,等.茶多酚對大腸桿菌抑菌機理的研究[J]. 生物學雜志,2015,32(1):72-75.

[26]Sharma A,Gupta S,Sarethy I P,et al.Green tea extract:possible mechanism and antibacterial activity on skin pathogens[J]. Food Chemistry,2012,135(2):672-675.

[27]錢麗紅,陶妍,謝晶. 茶多酚對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抑菌機理[J]. 微生物學通報,2010,37(11):1628-1633.

[28]Lee P,Tan K S. Effects of Epigallocatechin gallate against Enterococcus faecalis biofilm and virulence[J]. Archives of Oral Biology,2015,60(3):393-399.

[29]Yi S,Wang W,Bai F,et al. Antimicrobial effect and membrane-active mechanism of tea polyphenols against Serratia marcescens[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology,2014,30(2):451-460.

Study on the inhibition of three bacterias by different polar fractions from qingzhuan brick tea extract

YANG Qing-hua1,2,3,YANG Xin-he1,2,*,FU Ben-zhong1,2,QIN Cai-qin4,HUANG Ming-jun1,2,3,LV Bang-yu1,2

(1.College of Life Science and Technology,Hubei Engineering University,Xiaogan 432000,China;(2.Hubei Key Laboratory of Quality Control of Characeristic Fruits and Vegetables,Xiaogan 432000,China;3.School of Life Science,Hubei University,Wuhan 430062,China;4.College of chemistry and materials science,Hubei Engineering University,Xiaogan 432000,China)

Agar diffusion method was used to investigate the inhibiting effect ofStaphylococcusaureus,EscherichiacoliandBacillussubtilisby different polar fractions inculding chloroform fraction,ethyl acetate fraction,n-butyl alcohol fraction and water layer fraction from the Qingzhuan brick tea extract,and their minimum bacteriostatic concentration and total polyphenol content were determined. The results showed that the antimicrobial activity of ethyl acetate fraction among different polar fractions was the best and the antimicrobial diameters on inhibitingStaphylococcusaureus,EscherichiacoliandBacillussubtilisarewere respectively 29.19,27.97,27.35 mm when its concentration was 100 mg/mL. The minimum inhibitory concentrations forStaphylococcusaureus,EscherichiacoliandBacillussubtiliswere,3.12,6.25 mg/mL,respectively. The total polyphenol content in ethyl acetate fraction was as high as 81.62% and the total polyphenol may be the main active ingredients on its bacteriostasis.

qingzhuan brick tea;extract;different polar fractions;antibacterial effect

2015-06-05

楊清華(1991-)，女，碩士，主要從事茶葉品質(zhì)形成機理研究，E-mail:245804504@qq.com。

楊新河(1974-)，男，博士，副教授，主要從事茶及功能食品研究，E-mail:hbxhyang@163.com。

國家自然科學基金面上項目(31370692)；湖北省自然科學基金面上項目(2014CFB573)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)03-0123-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.017