高效液相色譜法測定馬鈴薯中綠原酸和原兒茶酸

程麗林,張長峰,王慶國

(1.山東省農(nóng)產(chǎn)品貯運(yùn)保鮮技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東濟(jì)南 250103;2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,山東泰安 271018)

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高效液相色譜法測定馬鈴薯中綠原酸和原兒茶酸

程麗林1,2,張長峰1,王慶國2，*

(1.山東省農(nóng)產(chǎn)品貯運(yùn)保鮮技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東濟(jì)南 250103;2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,山東泰安 271018)

目的:建立高效液相色譜法測定馬鈴薯塊莖中綠原酸和原兒茶酸的含量,并測定了兩種馬鈴薯貯藏期間綠原酸、原兒茶酸含量的變化。方法:采用高效液相色譜法梯度洗脫,使用反相C18色譜柱,以1%甲酸水溶液和100%甲醇為流動相,流速為0.8 mL/min,柱溫:40 ℃,在326、280 nm波長處分別對綠原酸和原兒茶酸進(jìn)行測定。結(jié)果:綠原酸、原兒茶酸分別在50～500、200～1000 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性良好,相關(guān)系數(shù)分別為0.9999、0.9992;精密度RSD均小于0.35%,穩(wěn)定性RSD均小于1.68%,綠原酸、原兒茶酸重復(fù)性RSD分別為2.07%、3.58%,綠原酸、原兒茶酸平均加樣回收率分別為98.29%、97.81%,RSD分別為1.46%、1.31%(n=5)。結(jié)論:該方法線性范圍寬,分離效果好,快速、準(zhǔn)確,可用于馬鈴薯塊莖中綠原酸和原兒茶酸含量的測定。

高效液相色譜法,馬鈴薯,綠原酸,原兒茶酸

馬鈴薯,茄科茄屬,是繼水稻、小麥、玉米之后的四大糧食作物之一[1]。馬鈴薯塊莖除含有豐富的淀粉、蛋白質(zhì)、多種維生素和無機(jī)鹽成分外,還含有豐富的酚酸物質(zhì)[2-3]。酚酸物質(zhì)多為對羥基苯甲酸和對羥基肉桂酸的衍生物,是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物,具有一定的抗氧化能力[2]。馬鈴薯塊莖中的酚酸類化合物包括綠原酸、原兒茶酸、咖啡酸、香草酸、芥子酸、沒食子酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、水楊酸、桂皮酸等多種成分[4]。其中綠原酸、原兒茶酸為馬鈴薯酚酸的主要成分[5]。酚酸物質(zhì)其中的一種氧化反應(yīng)就是酶促褐變,馬鈴薯鮮切后易發(fā)生褐變,而馬鈴薯中主要的酚酸物質(zhì)是綠原酸、原兒茶酸,所以綠原酸、原兒茶酸含量的變化可能有褐變相關(guān)[6]。

目前,分析酚酸的方法有紫外分光光度法(UV)[7]、薄層層析法(TCL)[8-9]、高效液相色譜法(HPLC)[10-11]和高效毛細(xì)管法[12]等。應(yīng)用較多的是紫外分光光度法和高效液相色譜法。張建華[13]建立了高效液相色譜法測定馬鈴薯塊莖中綠原酸的含量。Therese M. Work[14]報道了采用高效液相色譜法測定了加工馬鈴薯中總酚的含量。Pirjo Mattila和Jarkko Hellstr?m[15]采用HPLC測定了馬鈴薯、蔬菜中酚酸的含量。

本文建立了高效液相色譜法測定馬鈴薯中綠原酸、原兒茶酸含量。并采用該方法測定了克新4號、克新13號馬鈴薯鮮切后貯藏期間綠原酸、原兒茶酸含量的變化,為以后研究鮮切馬鈴薯綠原酸、原兒茶酸含量變化與褐變之間的關(guān)系提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

供試馬鈴薯由黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)院克山馬鈴薯研究所李慶全助理研究員提供,品種為克新4號、克新13號,于2013年10月收獲,選擇大小均一,無病蟲害,無機(jī)械損傷的馬鈴薯為實(shí)驗(yàn)材料;綠原酸(Chlorogenic Acid)標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC≥98%,批號:20140126)、原兒茶酸(Protocatechuic Acid)標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC≥98%,批號:20140126)上海金穗生物科技有限公司;甲醇(色譜純)、甲酸(色譜純)美國Sigma公司。

Waters e2695高效液相色譜儀(包括四元泵、真空脫氣機(jī)、柱溫箱、自動進(jìn)樣系統(tǒng)、Empower色譜軟件系統(tǒng))美國Waters公司;反相C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),紫外2489檢測器美國Waters公司;KQ-250B型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司;UniversaL 320R臺式離心機(jī)德國Hettich公司;優(yōu)普系列純水制造系統(tǒng)城都超純科技有限公司;EL204-IC電子天平梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品制備選擇大小均一、無機(jī)械損傷、無綠變新鮮馬鈴薯克新4號和克新13號,用水清洗除去表面污物,去皮,切成5 mm的切片,切片后放在保鮮袋中,放置在3～4 ℃環(huán)境下貯藏,分別在0、1/24、2/24、4/24、12/24、2、5、8、11、14 d進(jìn)行取樣,將樣品切碎用液氮進(jìn)行冷凍處理,再放置-70 ℃超低溫冰箱中進(jìn)行凍存。參考Zhou,L-L[16]方法測定,有改動。將冷凍樣品在液氮冷凍多功能粉碎機(jī)中打碎,稱取果肉粉末0.2 g,加入0.8 mL甲醇甲酸混合(80%甲醇水溶液中含有1%甲酸)溶液,置于4 ℃冰箱中過夜浸提,浸提混合物在30 ℃下超聲振蕩提取30 min,然后離心(1000 r/min,30 min),剩余殘渣用0.5 mL甲醇甲酸混合溶液重新提取,再離心。合并兩次浸提液,進(jìn)樣前經(jīng)脫氣處理,再用0.45 μm的濾膜進(jìn)行過濾。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備準(zhǔn)確稱取綠原酸、原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)品各5 mg和10 mg,分別置于10 mL棕色容量瓶中,加入甲醇甲酸混合溶液溶解,并稀釋至刻度,得到綠原酸、原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3色譜條件色譜柱:反相C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),流動相A:1%甲酸水溶液;流動相B:100%甲醇溶液;流速:0.8 mL/min,柱溫:40 ℃;進(jìn)樣體積:10 μL;綠原酸檢測波長為326 nm,原兒茶酸檢測波長為280 nm。流動相梯度表見表1。

表1　梯度洗脫表

1.2.4方法線性關(guān)系實(shí)驗(yàn):將配制好的0.5 mg/mL綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋為50、100、200、300、500 μg/mL,以綠原酸濃度(μg/mL)(X)為橫坐標(biāo),以峰面積(Y)為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸分析。將配制好的1.0 mg/mL原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋為200、500、700、900、1000 μg/mL,以原兒茶酸濃度(μg/mL)(X)為橫坐標(biāo),以峰面積(Y)為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸分析。精密度實(shí)驗(yàn):取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品200 μg/mL溶液10 μL,按照1.2.3項(xiàng)下色譜條件,重復(fù)進(jìn)樣測定5次。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):準(zhǔn)確稱取馬鈴薯樣品,按照1.2.1進(jìn)行樣品制備,將樣品待測液放置4 ℃冰箱中保存,分別在2、4、8、16、24 h時按照1.2.3色譜條件進(jìn)行測定。重復(fù)性實(shí)驗(yàn):準(zhǔn)確稱取1 g馬鈴薯樣品5份,按照1.2.1進(jìn)行樣品制備和1.2.3色譜條件進(jìn)行測定,重復(fù)測定5次。加樣回收率實(shí)驗(yàn):準(zhǔn)確稱取已知綠原酸、原兒茶酸含量的克新13號5 d的樣品6份,按照1.2.1進(jìn)行樣品制備待測液,再分別加入綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(50 μg/mL)、原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)品(50 μg/mL)0.1、0.2、0.3 mL,制成樣品溶液,按照1.2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行綠原酸及原兒茶酸含量測定,重復(fù)5次實(shí)驗(yàn),計算平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.5含量的測定在相同色譜條件下根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品、樣品峰面積與標(biāo)準(zhǔn)品含量,計算出原始樣品中綠原酸、原兒茶酸含量。

2　結(jié)果與分析

2.1線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)

進(jìn)行線性回歸分析,得到線性回歸方程為:Y=4.248×104X-2.443×104(r=0.9999),綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度在50～500 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系(如圖2)。

圖1　50 μg/mL綠原酸標(biāo)品HPLC色譜圖Fig.1　HPLC for 50 μg/mL standard chlorogenic acid

圖2　綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品HPLC的線性關(guān)系Fig.2　HPLC linear relation for standard chlorogenic acid

進(jìn)行線性回歸分析,得到線性回歸方程為:Y=2.062×104X+2.667×105(r=0.9992),原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度在200～1000 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系(如圖4)。

圖3　200 μg/mL原兒茶酸標(biāo)品HPLC色譜圖Fig.3　HPLC for 200 μg/mL standard protocatechuic acid

圖4　原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)品HPLC的線性關(guān)系Fig.4　HPLC linear relation for standard protocatechuic acid

2.2精密度實(shí)驗(yàn)

根據(jù)實(shí)際檢測值得出,綠原酸峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.29%(n=5)。取原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)品700 μg/mL溶液10 μL,重復(fù)進(jìn)樣測定5次,根據(jù)實(shí)際檢測值得出,原兒茶酸RSD為0.34%(n=5),見表2,表明儀器精密度良好。

2.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

測定綠原酸峰面積的RSD為0.67%,原兒茶酸峰面積的RSD為1.67%,綠原酸和原兒茶酸峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較小,表明樣品溶液至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表2　精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

測定綠原酸峰面積RSD為2.07%(n=5),原兒茶酸峰面積的RSD為3.58%(n=5),重復(fù)性RSD較低,說明方法重復(fù)性較好。

2.5加樣回收率實(shí)驗(yàn)

結(jié)果見表3。

表3　回收率測定結(jié)果(n=5)

表3結(jié)果表明,綠原酸平均加樣回收率為98.29%,RSD為1.46%,原兒茶酸平均加樣回收率為97.81%,RSD為1.31%,回收率較高,相對偏差較小。

2.6樣品含量的測定

采用本實(shí)驗(yàn)所建立的HPLC方法測定了馬鈴薯塊莖中綠原酸和原兒茶酸含量。

圖5為空白樣品色譜圖。圖6、圖7是鮮切馬鈴薯0 h時,綠原酸和原兒茶酸含量測定的色譜圖。采用本實(shí)驗(yàn)所建立的HPLC法測定了克新4號、克新13號鮮切貯藏過程中0、1/24、2/24、4/24、12/24、2、5、8、11、14 d綠原酸和原兒茶酸含量的變化。結(jié)果如圖8、圖9。

圖5　空白樣品HPLC色譜圖Fig.5　HPLC chromatogram for blank samples

圖6　綠原酸含量測定的HPLC色譜圖Fig.6　HPLC chromatogram for thecontent determination of chlorogenic acid

圖7　原兒茶酸含量測定的HPLC色譜圖Fig.7　HPLC chromatogram for the contentdetermination of protocatechuic acid

圖8　克新4、克新13綠原酸含量的變化Fig.8　The change of chlorogenic acid contentin Kexin No.4 and Kexin No.13

從圖8中可看出,0～12 h內(nèi),克新4號綠原酸含量為0 μg/g,2 d后克新13號綠原酸含量呈上升趨勢。在整個貯藏期間,克新4號綠原酸含量始終低于克新13號。綠原酸含量在貯藏過程中呈上升趨勢,主要原因是機(jī)械損傷誘發(fā)的主要次生代謝物質(zhì)如各種酚類等通過苯丙烷類代謝途徑生成。

從圖9中可看出,克新4號0～2 h內(nèi)原兒茶酸含量變化不明顯,2 h后呈下降趨勢,克新13號0～12 h內(nèi)原兒茶酸含量變化不明顯,12 h后呈下降趨勢。在整個貯藏過程中,克新4號原兒茶酸含量始終高于克新13號,且整體呈下降趨勢。原兒茶酸含量在貯藏過程中呈下降趨勢,原因可能是原兒茶酸作為褐變底物參與了酶促褐變反應(yīng)。

圖9　克新4、克新13原兒茶酸含量的變化Fig.6　The change of protocatechuic acid contentin Kexin No.4 and Kexin No.13

3　結(jié)論與討論

建立了高效液相色譜法測定馬鈴薯中綠原酸及原兒茶酸含量,測定了貯藏期間兩種鮮切馬鈴薯中綠原酸、原兒茶酸含量的變化。CaoYu[17]也采用此方法測定了荷蘭7號馬鈴薯中綠原酸、原兒茶酸的含量。本實(shí)驗(yàn)綠原酸、原兒茶酸在50～500、200～1000 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性良好,相關(guān)系數(shù)分別為0.9999、0.9992,相關(guān)性較高,符合實(shí)驗(yàn)要求。精密度RSD分別為0.29%、0.34%,表明儀器精密度較高,穩(wěn)定性RSD為0.67%、1.67%,重復(fù)性RSD為2.07%、3.58%,樣品穩(wěn)定性、重復(fù)性較好。

馬玉榮[18]采用高效液相色譜法測定了馬鈴薯中主要的酚類物質(zhì),其采用甲醇提取,再進(jìn)行55 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),制得檢測分析液,再在液相色譜條件下進(jìn)行檢測液的測定。與本文方法相比,其檢測液的制備過程較繁瑣。張建華[13]采用高效液相色譜法測定了馬鈴薯中綠原酸含量,采用甲醇超聲浸提,在液相條件下進(jìn)行檢測分析液的測定。駱成堯[4]采用了反相高效液相色譜法測定了馬鈴薯中的酚酸物質(zhì),采用70%甲醇超聲提取,再以甲醇-水-冰醋酸為流動相進(jìn)行樣品的測定。與本文方法相比,他們所采用的流動相A、B溶液配制起來較為繁瑣。本方法提取較為簡單,選擇的流動相溶液配制方便,進(jìn)行樣品檢測液液相操作簡便,可一同測定綠原酸和原兒茶酸含量。該方法具有簡單快速,線性范圍寬,分離效果好,數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、可靠等優(yōu)點(diǎn),可作為馬鈴薯塊莖中綠原酸和原兒茶酸含量測定的方法。

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Determination of chlorogenic acid and protocatechuic acid in potatoes by HPLC

CHENG Li-lin1,2,ZHANG Chang-feng1,WANG Qing-guo2，*

(1.Shandong Key Laboratory of Storage and Transportation Preservation Technology of Agricultural Products,Ji’nan 250103,China;2.College of Food Science and Engineering,Shandong Agricultural University,Tai’an 271018,China)

Objective:To establish a method of detecting the content of chlorogenic acid and protocatechuic acid in potato tuber by High Performance Liquid Chromatography(HPLC),this method was used to determine the change of chlorogenic acid,protocatechuic acid content in two species potatoes during storage. Methods:Gradient elution HPLC was used to determine chlorogenic acid and protocatechuic acid. The samples were separated by reversed-phase C18chromatographic column using 1%formic acid and 100% methanol as a mixed mobile phase. The detection wavelength was set at 326 nm and 280 nm respectively.The column temperature was set 40 ℃. Results:The calibration curves showed good linear relationship between the peak areas and concentrations was 50～500 μg/mL for chlorogenic acid,200～1000 μg/mL for protocatechuic acid,the related coefficient was 0.9999,0.9992. The RSD of precision were all lower than 0.35%. The RSD of stability were all lower than 1.68%. The RSD of repeatability was 2.07% for chlorogenic acid,3.58% for protocatechuic acid. Standard addition recovery of chlorogenic acid,protocatechuic acid was 98.29%,97.81% with relative standard deviation(RSD)of 1.46%,1.31%(n=5). Conclusion:The method was rapid,accurate with wind linear range and good separation results,which was suitable for the analysis of chlorogenic acid,protocatechuic acid in potato tuber.

HPLC；potato；chlorogenic acid；protocatechuic acid

2015-12-10

程麗林(1987-),女,碩士,研究方向:采后生理及技術(shù),食品加工與安全,E-mail:chengll0816@163.com。

王慶國(1965-),男,碩士,教授,研究方向:采后生理及技術(shù),E-mail:wqgyyy@126.com。

農(nóng)產(chǎn)品品控物流關(guān)鍵技術(shù)裝備研發(fā)與應(yīng)用(2014zzcx02701);山東省科技發(fā)展計劃“馬鈴薯物流保鮮關(guān)鍵技術(shù)及新產(chǎn)品研發(fā)與應(yīng)用”(2014GNC113008);山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系薯類產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)產(chǎn)后貯藏加工崗位專家(SDAIT-10-011-11)建設(shè)任務(wù)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)13-0299-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.053