鄱陽湖7個河口水體中細菌多樣性和組成特征

圣平，于一尊，田曉娟，黃江麗，張志紅，2，丁建南*

（1.江西省科學院生物資源研究所，江西 南昌330096；2. 江西省鄱陽湖重點實驗室，江西 南昌 330096）

鄱陽湖7個河口水體中細菌多樣性和組成特征

圣平1，于一尊1，田曉娟1，黃江麗1，張志紅1，2，丁建南1*

（1.江西省科學院生物資源研究所，江西 南昌330096；2. 江西省鄱陽湖重點實驗室，江西 南昌 330096）

本文對鄱陽湖7個河口（贛江、撫河、信江、樂安河、昌江、饒河和修河）水體的理化特性進行了分析，并采用細菌16S rRNA基因MiSeq測序的方法對其多樣性和組成進行了研究。結(jié)果表明，樂安河水體總氮含量最高，信江水體總磷含量最高。樂安河、修河和饒河水體細菌豐度高于其它河口，而修河、昌江和饒河水體細菌多樣性則相對較高。水體細菌群落組成分析結(jié)果表明，在7個河口水體中變形菌門細菌均占優(yōu)勢，其次為放線菌門和擬桿菌門細菌。而在綱水平，在7個河口水體中β-變形菌綱細菌占優(yōu)勢，其次為α-變形菌綱細菌和放線菌綱細菌。相關性分析結(jié)果表明，水體pH和細菌群落多樣性呈顯著負相關關系，而總氮和氨態(tài)氮含量和細菌群落多樣性呈顯著正相關性。

鄱陽湖；7大河口；不同河口水樣；細菌多樣性；細菌群落組成

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河口地段是鄱陽湖的生態(tài)敏感部位，一些重要的污染參數(shù)會在河口部位得到集中體現(xiàn)，對河口地段進行監(jiān)控，可以為湖區(qū)水環(huán)境狀況的預測預報提供重要依據(jù)。本研究旨在通過研究鄱陽湖七大河口水樣中微生物的組成和多樣性，并研究不同河口水樣環(huán)境因子對微生物種類組成和多樣性的影響，以期為準確、快速地評價和預測鄱陽湖整體環(huán)境狀況提供重要依據(jù)，為鄱陽湖生態(tài)功能的維護提供指導。

1 材料與方法

1.1 樣地選擇、樣品采集和處理

本試驗選擇贛江（116°02′E，29°19′N）、撫河（116°09′E，28°46′N）、信江（116°43′E，28°72′N）、樂 安 河（116°69′E，28°97′N）、 昌 江（116°70′E，28°97′N）、饒河（116°46′E，29°01′N）和修河（116°02′E，29°19′N）七大河口進行研究，采樣時間為2014年10月底，處于幾大河口和鄱陽湖的枯水期，樣品采集點如圖1，采用GPS進行定位。采集水樣后，分成兩部分，一部分用于理化性質(zhì)測定，另一部分用于細菌基因組DNA提取和分析。

圖1 鄱陽湖7個河口水樣取樣點Fig. 1 Collection sites of seven estuarine water samples of Poyang Lake

1.2 水樣理化性質(zhì)測定

水樣的溫度采用便攜式溫度計進行測定，pH值采用校準的pH計（Sartorius PB-10）測定。水樣的總氮和總磷采用過硫酸鉀氧化法測定［12］。氨態(tài)氮采用奈氏比色法測定，硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮含量分別采用紫外分光光度法和重氮偶合分光光度法測定［13］。全部測定均進行三次重復。

1.3 樣品細菌收集及其基因組DNA提取

將部分水樣先用8 μm孔徑的定性濾紙過濾以去除顆粒物以及真核生物，然后通過聚碳酸酯膜（0.2 μm，Whatman）真空抽濾［10］，然后用無菌水沖洗2次，將濾膜取出剪成碎片，裝入1.5 ml的離心管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

樣品細菌基因組DNA的提取采用細菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）完成，具體步驟參照試劑盒說明書，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的基因組DNA。Nanodrop 1000測定所提取DNA的濃度以及純度。DNA于-80 ℃保存?zhèn)溆?，符合要求的DNA樣本進行后續(xù)MiSeq測序。

1.4 樣本PCR擴增

以稀釋后的DNA為模板，采用帶有Barcode的通用引物515F和806R對細菌16S rRNA基因的V4區(qū)域進行擴增，引物序列為515F：5'-GTTTCGGTGC CAGCMGCCGCGGTAA-3'，806R：5'-GTGAAAGG ACTACHVGGGTWTCTAAT -3'。PCR擴增條件為：98 ℃預變性1 min，98 ℃變性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃復性60 s，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸l0 min，4 ℃保存。每個樣品3個重復，將同一樣品的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用北京天根生化科技有限公司瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（DP209）切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCL洗脫。

1.5 文庫構(gòu)建及測序

測序文庫的構(gòu)建采用NEB Next? Ultra? DNA Library Prep kit for Illumina（NEB，美國）建庫試劑盒完成，具體步驟參照試劑盒說明書。構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測，合格后，使用MiSeq進行上機測序。

1.6 生物信息學分析

采用FLASH軟件進行DNA片段的雙末端序列拼接［14］。序列分析采用UPARSE軟件包進行（Uparse v7.0.1001，http://drive5.com/uparse/）［15］，算法采用UPARSE-OTU和UPARSE- OTUref。

OTU（Operational Taxonomic Units，操作分類單元）聚類分析：在97%的相似水平下，應用QIIME軟件中Usearch對所有序列進行OTU劃分。具體分析方法：1）使用Uparse（version 7.1 http:// drive5.com/uparse/）方法進行OTU聚類，OTU中序列相似性設為97%，得到OTU的代表序列［16］；2）使用Uchime（version 4.2.40 http://drive5.com/usearch/ manual/uchime_algo.html）檢測PCR擴增中產(chǎn)生的嵌合體序列并從OTU中去除［15］；3）使用Usearch_ global方法將優(yōu)化序列map比對回OTU代表序列，得到OTU各樣品序列豐度統(tǒng)計表。

分類學分析：為了得到每個OTU對應的物種分類信息，采用RDP classifer貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，選用Silva（Release115 http://www.arb-silva.de）數(shù)據(jù)庫進行比對。軟件及算法：Qiime平臺（http://qiime.org/ scripts/assign_taxonomy.html），RDP Classifer （version 2.2 http: //sourceforge.net/projects/rdp-classifer/），置信度閾值為0.7［17］?；诜诸悓W分析結(jié)果，在Excel中編輯作群落結(jié)構(gòu)組分圖。

多樣性指數(shù)（Alpha-diversity）計算：在97%（0.97）的相似水平下，采用Mothur軟件（version v.1.30.1 http://www.mothur. org/wiki/Schloss_ SOP#Alpha_ diversity），計算菌群豐度指數(shù)Chao1以及菌群多樣性指數(shù)Shannon指數(shù)［18］。

群落聚類分析：采用Qiime軟件計算群落間非加權的UniFrac距離，采用的是非加權配對算術平均法。

1.7 統(tǒng)計分析

不同河口水樣環(huán)境因子和微生物多樣性之間的相關性分析采用SPSS 16.0軟件進行。同時，采用Canoco軟件分析環(huán)境因子對不同類群細菌分布的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 鄱陽湖7個河口水樣理化性質(zhì)

鄱陽湖不同河口水體溫度、pH、總氮、氨態(tài)氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮、總磷含量如表1所示。從表1可以看出，樂安河水樣pH最低，偏酸性，為6.19，其余河口水樣pH均在6.41-6.86間波動，樂安河水樣偏酸性，可能與德興銅礦廢水的排放有關。從總氮和氨態(tài)氮含量結(jié)果可以看出，樂安河水樣中含量最高，分別為8.08 mg/L和6.06 mg/L，饒河含量次之，分別為5.74 mg/L和4.12 mg/L，污染較為嚴重。其原因可能是由于樂安河下游鄱陽縣大量的水產(chǎn)養(yǎng)殖以及生活污水的排放，從而導致水體中總氮和氨態(tài)氮含量偏高［19］，且樂安河匯入饒河，其水質(zhì)在一定程度上會影響?zhàn)埡拥乃|(zhì)。信江水樣中總磷含量最高，為0.51 mg/L，這可能受到上饒市朝陽磷礦生產(chǎn)廢水的影響，從而導致信江下游總磷含量偏高［20］。

表1 鄱陽湖7個河口水樣理化特性Table 1 Physicochemical properties of seven estuarine water columns of Poyang Lake and local meteorological conditions at their sampling sites

2.2 鄱陽湖7個河口水樣中微生物多樣性和組成

2.2.1 水樣樣本α多樣性 在所研究的7組樣本中，修河水樣的操作分類單元（OTU）數(shù)目最多（為851個），饒河及昌江樣本所含的操作分類單元數(shù)目次之，分別為825和772個，撫河水樣樣本所含的操作分類單元數(shù)目則相對較少，為698個（表2）。進一步通過種群豐富度指數(shù)（Chao1）對各樣本微生物豐度進行了評估，研究發(fā)現(xiàn)樂安河樣本種群豐富度指數(shù)最高（為1069.50），其次是修河（為998.02）、饒河（為982.13），信江樣本種群豐富度指數(shù)最低（為782.03）（表2）。該結(jié)果說明樂安河、修河和饒河河水微生物物種豐度較高，信江河水中微生物物種豐度低。相比較而言，樂安河、修河和饒河的水質(zhì)較其它河口差，氮含量相對較高，且三者微生物豐度較高，表明其水體中可能含有大量的參與氮循環(huán)的微生物。此外，樂安河匯入饒河，其水質(zhì)會對饒河的水質(zhì)造成一定影響。

本研究同時通過香農(nóng)指數(shù)（Shannon index）對微生物的多樣性進行了評估，研究發(fā)現(xiàn)7大河口河水樣本均有著較高的生物多樣性，其中，修河河水樣本香農(nóng)指數(shù)（9.06）最高，其次為昌江（6.88）和饒河（6.79），信江樣本（6.32）香農(nóng)指數(shù)最?。ū?）。該實驗結(jié)果表明，修河、昌江、饒河水樣中細菌群落多樣性較其他河口高，信江水樣中細菌群落多樣性最低。

表 2 河口水樣樣本α多樣性Table 2 Alpha diversity of all samples

2.2.2 水樣細菌群落組成 進一步對各樣本細菌群落組成進行分析，由圖2可知，7大河口樣本中，變形菌門為主要的細菌類群（各樣本所占比例為62.65%-79.03%），放線菌門（2.11%-18.32%）和擬桿菌門（5.05%-9.08%）細菌所占比例次之。其中樂安河、信江和饒河樣本中放線菌門細菌含量要顯著低于其它河口。贛江樣本中放線菌門細菌含量（18.32%）最高。之前研究結(jié)果也表明，變形菌門、放線菌門和擬桿菌門為湖泊生態(tài)系統(tǒng)的優(yōu)勢菌門，它們參與了環(huán)境中污染物的生物降解［21-23］。該結(jié)果與其他研究人員對其他淡水湖泊水體細菌多樣性研究結(jié)果相似。吳蘭［10］通過對鄱陽湖水體微生物群落組成進行研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門為優(yōu)勢菌群，擬桿菌門和放線菌門有少量分布。Wu等［7］研究了太湖梅梁湖區(qū)的水體細菌群落遺傳組成，結(jié)果顯示，梅梁湖區(qū)水體細菌群落組成隨季節(jié)而變化，其主要以變形菌門、擬桿菌門和放線菌門為主。

圖2 7個河口水樣細菌群落組成（門水平）Fig. 2 Bacterial composition of these communities in seven estuarine water samples（Phylum level）

從綱水平來看，7大河口水樣中β-變形菌綱細菌占據(jù)絕對優(yōu)勢（33.8%-50.4%），α-變形菌綱（11.9%-33.3%）和放線菌綱（1.7%-16.2%）細菌所占比例次之。其中，樂安河水樣中β-變形菌綱細菌相對其他河口最高（50.4%），α-變形菌綱細菌含量則相對較低（16.4%），而撫河樣本中β-變形菌綱細菌含量最低（33.8%），α-變形菌綱細菌則含量最高（33.3%）（圖3）。根據(jù)以前關于β-變形菌綱的報道指出，在大部分淡水系統(tǒng)中，其都有著大量的分布，它們的新陳代謝活動在淡水湖泊生態(tài)系統(tǒng)中可能起重要作用，其參與淡水系統(tǒng)的氮代謝，具有降解復雜有機大分子的能力，其豐富度與低分子量的營養(yǎng)物含量相關。α-變形菌則主要存在于相對寡營養(yǎng)的環(huán)境中，擬桿菌的豐富度與水體的水華程度密切相關［24］。因此，該研究結(jié)果進一步揭示了樂安河水體的主要營養(yǎng)物可能以低分子量物質(zhì)居多，而撫河含沙量大，相對提供給微生物的營養(yǎng)偏少，α-變形菌綱細菌所占比例較高。此外，各大河口中高豐度的β-變形菌綱細菌可能在各自生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的功能。

除此之外，我們還發(fā)現(xiàn)贛江樣本中放線菌綱細菌含量（16.2%）要顯著高于其它樣本（圖3）。在淡水系統(tǒng)中放線菌綱細菌是一類獨立的微生物種群，水體中溶解有機碳含量與放線菌綱細菌的含量呈負相關關系［25］。但是我們的研究中由于缺少溶解有機碳含量的數(shù)據(jù)，因此無法解釋贛江中放線菌綱細菌含量顯著高于其它幾個河口的原因。

圖3 7個河口河水樣本細菌群落組成（綱水平）Fig. 3 Bacterial composition of these communities in seven estuarine water samples（Class level）

2.3 細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性比較分析

采用加權UniFrac距離來衡量兩兩樣本之間的相異系數(shù)，值越小，表示這兩個樣品在物種多樣性方面存在的差異越小。由圖4可知，修河和贛江河水樣本之間的相異系數(shù)最小（0.136），樂安河和撫河樣本之間的相異系數(shù)最大（0.351），修河和撫河的相異系數(shù)（0.306）次之，該結(jié)果與河口水體環(huán)境因子聚類結(jié)果相一致，表明水體環(huán)境因子對于其中微生物多樣性存在影響。

對這7個河口河水樣本細菌群落組成進行聚類分析，結(jié)果表明，贛江、修河和樂安河樣本的微生物組成相似，聚在一起，其中贛江和修河樣本微生物組成更相似，昌江和撫河樣本微生物群落組成相似，聚在一起，信江和饒河樣本細菌組成相似，兩者聚在一起（圖5）。

圖4 Beta多樣性指數(shù)熱圖Fig. 4 Heatmap analysis based on the dissimilaritycoefficient between sets of two samples

圖5 鄱陽湖7個河口河水樣本微生物群落組成聚類圖Fig. 5 UPGMA cluster analysis of these bacterial community compositions in seven estuarine water samples of Poyang Lake（Weighted UniFrac distance）

2.4 環(huán)境因子對細菌群落組成和多樣性的影響

采用SPSS 16.0軟件分析河口水樣微生物多樣性和水樣理化性質(zhì)及氣候因子的相關性。結(jié)果顯示，水樣中pH、總氮和氨態(tài)氮含量與河口水樣中細菌種群豐富度存在顯著的相關性（表3），其中pH和細菌群落豐度呈顯著的負相關性（rs=-0.786），總氮和氨態(tài)氮含量和細菌群落豐度呈顯著的正相關性（rs=0.786和0.829）。此外，我們也分析了不同河口水樣微生物群落組成與水樣理化性質(zhì)及氣候因子的相關性，研究結(jié)果表明，溫度、總氮以及亞硝態(tài)氮在一定程度上影響著環(huán)境中微生物的群落組成。放線菌門細菌與溫度呈顯著的正相關性（rs=0.883），浮霉菌門與氨態(tài)氮呈顯著的負相關性（rs=-0.757），藍細菌與總氮、氨態(tài)氮和亞硝態(tài)氮呈顯著的正相關性（rs=0.893，0.847和0.929），Thermi門細菌與溫度呈顯著的正相關性（rs=0.883），綠菌門細菌與亞硝態(tài)氮呈顯著的負相關性（rs=-0.829），綠彎菌門細菌與總氮和氨態(tài)氮呈顯著的負相關性（rs=-0.857，-0.829）（表3）。

之前大量研究也表明，生境中環(huán)境因子顯著影響該生境中微生物種類組成和多樣性。Zhang等［26］在高原淡水湖微生物種類組成和多樣性的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。生境中氮、氨態(tài)氮等含量可以直接影響微生物的種類組成，例如，藍細菌含量與環(huán)境中氮含量呈顯著的正相關性，藍細菌含量越高，環(huán)境富營養(yǎng)化程度越嚴重［27］，此外，環(huán)境中的營養(yǎng)成分也可通過影響其它浮游生物從而間接影響微生物的組成［28］，當環(huán)境中營養(yǎng)成分增加，浮游植物、藻類和細菌種類也會相應增加，他們之間存在著互利共生的關系［29］。我們的研究結(jié)果似乎支持了以前的研究報告，細菌群落組成和多樣性一定程度上取決于環(huán)境因素［30］，此外也進一步證明了可以通過檢測特定功能性微生物的組成和多樣性從而間接的反映相應的環(huán)境變化。

3 結(jié)論

通過對鄱陽湖不同河口水體環(huán)境因子進行分析，發(fā)現(xiàn)樂安河水體中總氮、氨態(tài)氮含量均最高，其次為饒河，表明兩者污染較嚴重。從總磷含量來看，信江水體含量最高，其次為樂安河。

7大河口水體微生物多樣性和豐度均有著一定的差異，樂安河、修河、昌江和饒河水體中微生物群落多樣性和豐度較其他河口高。水體細菌群落組成分析結(jié)果表明，變形菌門、放線菌門和擬桿菌門細菌為所有河口水體中的優(yōu)勢菌群。其中，β-變形菌綱、α-變形菌綱和放線菌綱細菌為所有河口水體中的優(yōu)勢菌綱。該研究結(jié)果表明這些細菌可能在河口水生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的功能。此外，河口水體微生物種群豐富度指數(shù)和水體環(huán)境因子的相關性研究結(jié)果顯示，水體pH、總氮和氨態(tài)氮含量與細菌種群豐富度存在顯著的相關性，其中pH和細菌種群豐富度呈顯著的負相關性，總氮和氨態(tài)氮含量和細菌種群豐富度呈顯著的正相關性。該研究結(jié)果進一步證明了環(huán)境因子的改變是影響環(huán)境微生物群落組成的因素之一。

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（責任編輯：王育花）

Bacterial diversities and compositions in seven different estuarine water columns of Poyang Lake

SHENG Ping1， YU Yi-zun1， TIAN Xiao-juan1， HUANG Jiang-li1， ZHANG Zhi-hong1， 2， DING Jian-nan1*
（1. Institute of Biological Resources， Jiangxi Academy of Sciences， Nanchang， Jiangxi 330096， China； 2. Poyang Lake Key Laboratory of Jiangxi， Nanchang， Jiangxi 330096， China）

In this study， we analyzed environmental factors of seven different estuarine water columns of Poyang Lake （Gan， Fu， Xin， Le'an， Chang， Rao， and Xiu River）， and the bacterial community compositions in these different estuarine sediments were analyzed using the 16S rRNA gene targeted metagenomic approach. Our results showed that Le'an River had the highest total nitrogen content， and Xin River had the highest total phosphorus content. For the bacterial richness and diversity in these seven different estuaries， we found that Le'an， Xiu and Rao rivers showed the higher bacterial richness than other estuarines. Xiu， Chang and Rao rivers showed higher bacterial diversities than others. Bacterial composition analysis indicated that Proteobacteria phylum was dominant in all water samples， followed by Actinobacteria and Bacteroidetes. At the class level， all samples were numerically dominated by members of the Betaproteobacteria， Alphaproteobacteria and Actinobacteria. Furthermore， according to the Spearman's correlation analysis， we found that there were signifcant negative relationships between the Chao1 species richness index and pH. Besides， total nitrogen and ammonia concentrations showed signifcant positive effect on bacterial community richness. Key words： Poyang Lake； seven estuaries； different estuarine water columns； bacterial diversity； bacterial community composition

鄱陽湖是我國最大的淡水湖，地處長江中下游南岸。其上承贛、撫、信、饒、修五河之水，下接長江，其中樂安河和昌江匯入饒河，流入鄱陽湖。鄱陽湖濕地生態(tài)環(huán)境好，是世界上最大的鳥類保護區(qū)［1］。但是，近年來，由于工業(yè)、農(nóng)業(yè)和城市污水的大量排放，加上降水逐年減少，導致入湖河流以及湖泊的自凈能力下降，使得湖泊氮磷濃度持續(xù)升高、湖泊富營養(yǎng)化程度不斷加深［2-4］，對湖泊周邊環(huán)境造成嚴重的威脅。

在湖泊生態(tài)系統(tǒng)中，微生物在湖泊物質(zhì)循環(huán)和能量循環(huán)中起著重要的作用，同時也是各種新型生物活性物質(zhì)的潛在來源［5］。由于湖泊水體生境類型不同，使得生境中微生物的多樣性也不同。研究表明，湖泊鹽度、湖水深度、湖水和底泥pH、營養(yǎng)成分、有機質(zhì)等均會影響生境中微生物的組成［6］。因此，由于自然和人類活動引起自然環(huán)境的改變最終也會引起環(huán)境微生物種類組成的改變［7-8］。我國是個湖泊眾多的國家，約有兩萬多個湖泊，其中約三分之一為淡水湖泊，其水資源占中國城鎮(zhèn)飲用水的50%以上［9-10］。但是隨著資源的破壞性開發(fā)，環(huán)境的惡化，世界各地湖泊富營養(yǎng)化進程加速，水質(zhì)日趨惡化［11］，湖泊生物資源包括湖泊微生物種類與多樣性研究己成為各國科學家共同關注的熱點。

The special funds of National Academy Alliance for Academy Construction （2012-1）， Science and Technology Plan of Jiangxi Province （2008BB26100）， The Special Funds of Jiangxi Academy of Sciences （2013-19-01）.

DING Jian-nan， E-mail: jiannanding@aliyun.com.

26 June， 2015；Accepted 24 February， 2016.

X172

A

1000-0275（2016）03-0606-07

10.13872/j.1000-0275.2016.0050

全國科學院聯(lián)盟專項重點項目（2012-1）；江西省科技支撐計劃項目（2008BB26100）；江西省科學院專項項目（2013-19-01）。

圣平（1987-），女，湖北荊州人，博士，助理研究員，主要從事微生物學與分析生物學研究，E-mail：shengping_1014@163. com；通訊作者：丁建南（1955-），男，湖南衡陽人，博士，研究員，主要從事微生物生態(tài)學研究，E-mail: jiannanding@aliyun.com。

2015-06-26，接受日期：2016-02-24