全反式視黃酸通過(guò)RARα對(duì)鐵調(diào)節(jié)蛋白2的基因表達(dá)的影響

藍(lán)　嵐，梁克紀(jì)，張羽飛，李厚忠

(1 黑龍江省牡丹江市衛(wèi)生局衛(wèi)生監(jiān)督所傳染病監(jiān)督科，黑龍江牡丹江　157000 1；2 牡丹江第一人民醫(yī)院血液科，黑龍江牡丹江　157011；3 牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心，黑龍江牡丹江　157011；4 牡丹江醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥理研究室，黑龍江牡丹江　157011)

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全反式視黃酸通過(guò)RARα對(duì)鐵調(diào)節(jié)蛋白2的基因表達(dá)的影響

藍(lán)嵐1，梁克紀(jì)2，張羽飛3，李厚忠4

(1黑龍江省牡丹江市衛(wèi)生局衛(wèi)生監(jiān)督所傳染病監(jiān)督科，黑龍江牡丹江157000 1；2牡丹江第一人民醫(yī)院血液科，黑龍江牡丹江157011；3牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心，黑龍江牡丹江157011；4牡丹江醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥理研究室，黑龍江牡丹江157011)

目的：通過(guò)體外肝細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)研究全反式視黃酸(atRA)對(duì)鐵調(diào)節(jié)蛋白2(IRP2)的影響。方法：體外實(shí)驗(yàn)將大鼠原代肝細(xì)胞按Seglent法分離后，隨機(jī)分為嚴(yán)重缺乏組A、邊緣性缺乏組B、正常生理組C、治療劑量組D、RARα阻抑組E，分別給予0、0.5、1.0、50μmol/L全反式視黃酸和50μmol/L全反式視黃酸+10μmol/LRO培養(yǎng)96h。用逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR法)檢測(cè)肝臟的IRP2mRNA的表達(dá)。結(jié)果：大鼠全反式視黃酸缺乏時(shí)，肝臟IPR2mRNA表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)，補(bǔ)充全反式視黃酸后，IPR2mRNA表達(dá)減弱，但阻抑RARα后，VA這種作用減弱。結(jié)論：全反式視黃酸可通過(guò)RARα改變IRP2mRNA的轉(zhuǎn)錄來(lái)影響鐵代謝。

全反式視黃酸；視黃酸核受體α；鐵調(diào)節(jié)蛋白2

維生素A缺乏(vitaminAdeficiency，VAD)和鐵缺乏(irondeficiency，ID)兩者作為最常見(jiàn)的微量營(yíng)養(yǎng)素缺乏性疾病，其關(guān)系已越來(lái)越受到關(guān)注。維生素A的水平對(duì)細(xì)胞鐵狀態(tài)的調(diào)節(jié)有明顯影響，維生素A缺乏干擾鐵代謝最終導(dǎo)致貧血，但作為貧血的主要發(fā)生原因之一，其具體的影響機(jī)制還不是十分清楚。近年來(lái)，研究證明，細(xì)胞鐵穩(wěn)態(tài)重要的調(diào)節(jié)機(jī)制是誘導(dǎo)物誘導(dǎo)鐵調(diào)節(jié)蛋白轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平，進(jìn)而影響Fn和TFR水平來(lái)調(diào)節(jié)鐵的代謝[1，2]。為證明維生素A，特別是全反式視黃酸(all-transretinoicacid，atRA)，能夠通過(guò)激活視黃酸細(xì)胞核受體(retinoicacidreceptor，RARα)，從而誘導(dǎo)鐵調(diào)節(jié)蛋白2(ironregulatoryprotein2，IRP2)基因的表達(dá)最終影響鐵代謝，本研究通過(guò)阻抑實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)atRA對(duì)鐵代謝的基因影響是通過(guò)RARα途徑調(diào)節(jié)，為進(jìn)一步證實(shí)維生素A缺乏導(dǎo)致貧血的機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試劑

Ⅳ型膠原酶、Ⅰ型膠原和DMEM培養(yǎng)液等(Dulbecco’smodifiedEaglemedium)培養(yǎng)基，購(gòu)于GibcoBRL；PCR試劑TaKaRaTaqDNAPolymeraseKit，購(gòu)于大連寶生物工程有限公司；Ro41-5253(RARα選擇性拮抗劑，Ro)，購(gòu)于Enzolifescience.Co，引物為上海英駿生物技術(shù)有限公司提供合成等。

1.2肝細(xì)胞培養(yǎng)及處理

SD大鼠24只，禁食12h采用Seglent法分離原代肝細(xì)胞[3]，將活力在90%以上的大鼠肝細(xì)胞(臺(tái)盼蘭)5×105/mL的密度接種于I型膠原凝膠的包被的培養(yǎng)板內(nèi)。等待原代大鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)12h后，將原代肝細(xì)胞隨機(jī)分為5組：A組為VA完全缺乏組：培養(yǎng)液中只含有0.5%DMSO，沒(méi)有atRA；B組為VA邊緣缺乏組：0.5μmol/LatRA；C組為VA正常對(duì)照組：1μmol/LatRA；D組為VA治療組：培養(yǎng)液中含有0.5%DMSO、50μmol/LatRA；E組為培養(yǎng)液中含有50μmol/LatRA、10μmol/LRo。5組培養(yǎng)液共有的成分：10%胎牛血清；表皮生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子各10μg/L；青霉素、鏈霉素、胰島素、地塞米松分別為40萬(wàn)U/L、100mg/L、500U/L、0.4mg/L。培養(yǎng)96h的肝細(xì)胞備用。

1.3肝臟mRNA檢測(cè)

內(nèi)參照(β-actin)，鐵調(diào)節(jié)蛋白2(IRP2)表達(dá)檢測(cè)：β-actin(512bp)：上游：5′-GTGATGGTGGGAATGGGTCAG-3′；下游5′-TTTGATGTCACGCACGATTTCC-3′IRP2(459bp)上游：5′-GTTTGTCTCCAGGCAGTG-3′；下游：5′-ACCGTTTATTTCCCATCT-3′。PCR條件為預(yù)變性94℃4min，變性94℃30s，退火55℃30s，72℃延伸50s，β-actin，IRP2循環(huán)35個(gè)循環(huán)。72℃10min后，4℃儲(chǔ)存。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳計(jì)算IRP2產(chǎn)物的密度值(與β-actin的密度值作為參考)[4]。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，多組整體比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析，兩兩比較采用Q檢驗(yàn)，以α=0.05作為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2　結(jié)果與分析

各組大鼠肝臟IRP2mRNA表達(dá)情況：A、B、C、D組隨著atRA劑量的增加，IRP2mRNA是表達(dá)下降的趨勢(shì)(差異具有顯著性)，但VA缺乏組和邊緣缺乏組之間IRP2mRNA含量差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。D組IRP2mRNA的表達(dá)最低，A組最強(qiáng)，E組介于A、D之間(P<0.05)(圖1、圖2)?？梢?jiàn)，atRA缺乏可以使大鼠原代肝細(xì)胞IRP2mRNA的表達(dá)增強(qiáng)，補(bǔ)充atRA可使其表達(dá)降低，但在加入RO后，這種減弱作用緩解。

圖1　atRA作用后各組IRP2 mRNA的表達(dá)(459bp)

圖2　加入RO后IRP2 mRNA表達(dá)情況比較

3　討論

VA對(duì)細(xì)胞鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)機(jī)制的深入研究，為研究維生素A缺乏對(duì)貧血的影響提供了分子生物學(xué)基礎(chǔ)。VA，特別是全反式視黃酸(后者為前者的天然代謝產(chǎn)物)，通過(guò)視黃酸胞內(nèi)結(jié)合蛋白(cellularretinoicacidbindingprotein，CRABP)、視黃酸核受體(RARs、RXRs)及視黃酸反應(yīng)元件(retinoicacidresponsiveelement，RARE)參與作用激活很多種基因，來(lái)調(diào)節(jié)組織細(xì)胞的特定功能，如生長(zhǎng)因子和受體、激素、細(xì)胞酵素及其效應(yīng)器的基因[5]。另一方面，鐵代謝相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)使人們對(duì)鐵在體內(nèi)代謝的分子機(jī)理認(rèn)識(shí)有了初步的了解。

細(xì)胞鐵的穩(wěn)態(tài)主要被幾種蛋白所調(diào)控，這些蛋白的數(shù)量直接關(guān)系到細(xì)胞鐵代謝的平衡，它們協(xié)作完成鐵在細(xì)胞內(nèi)的利用，確保在細(xì)胞需要時(shí)有足夠的鐵供給，但卻避免鐵毒性。調(diào)控這些蛋白的水平從而調(diào)節(jié)細(xì)胞鐵濃度的中心蛋白-鐵調(diào)節(jié)蛋白(IRP)位于鐵代謝的中心位置。鐵調(diào)節(jié)蛋白是一種調(diào)節(jié)胞漿RNA結(jié)合蛋白，與存在于轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、鐵蛋白mRNA3′端或5′端非翻譯區(qū)(UTR)的鐵效應(yīng)元件IREs結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平控制轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、鐵蛋白的表達(dá)來(lái)調(diào)控哺乳動(dòng)物細(xì)胞的鐵代謝，并且IRP1、IRP2在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。IRP靶向切除的小鼠表明IRP2(而不是IRP1)是哺乳動(dòng)物的鐵穩(wěn)態(tài)起反應(yīng)的主要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)物，故本研究基因表達(dá)的分析選擇了IRP2[6，7]。

本試驗(yàn)證明，維生素A，特別是全反式視黃酸，能夠通過(guò)激活視黃酸細(xì)胞核受體，激活視黃酸反應(yīng)元件，從而誘導(dǎo)IRP2基因的表達(dá)最終影響鐵代謝。當(dāng)機(jī)體維生素A缺乏時(shí)，肝臟IRP2mRNA表達(dá)增多，使肝細(xì)胞從血中攝取、吸收、儲(chǔ)存鐵增多，促進(jìn)機(jī)體肝、脾等實(shí)質(zhì)臟器的網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)鐵儲(chǔ)存增加，動(dòng)員減少、轉(zhuǎn)運(yùn)受阻，進(jìn)而導(dǎo)致紅細(xì)胞內(nèi)鐵含量降低，骨髓的鐵攝取受損，最終導(dǎo)致貧血的發(fā)生，與陳科[8]的研究一致。VA通過(guò)影響鐵儲(chǔ)備和利用產(chǎn)生作用，VA營(yíng)養(yǎng)狀況越好，機(jī)體鐵動(dòng)員效率越高，肝臟儲(chǔ)鐵越少；而VA營(yíng)養(yǎng)狀況越差，機(jī)體鐵動(dòng)員效率越低，鐵在肝臟中儲(chǔ)存，向組織和血液中轉(zhuǎn)運(yùn)受阻，組織和血液、骨髓中缺鐵，造成貧血的發(fā)生。但本研究不排除atRA通過(guò)調(diào)節(jié)其他途徑來(lái)干擾IRP2的調(diào)節(jié)功能，因?yàn)槌思?xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)，還有很多因素可以影響的IRP的活性，例如缺氧和氧化應(yīng)激反應(yīng)等?！?/p>

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(責(zé)任編輯李婷婷)

Effects of atRA on IRP2 mRNA Expression by RARα Pathway

LAN Lan1，LIANG Ke-ji2，ZHANG Yu-fei3，LI Hou-zhong4

(1Health Supervision Institute of Mudanjiang Municipal Health Bureau，Mudangjiang 157000，China；2The First Hospitl of Mudanjiang，Mudanjiang 157011，China；3Medical Research Center，Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011，China；4Department of Pamacy，Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011，China)

all-transretinoicacid(atRA)；retinoicacidreceptor(RARα)；ironregulatoryprotein2(IRP2)

FoodandNutritioninChina

國(guó)家自然科學(xué)基金(項(xiàng)目編號(hào)：30872107)；黑龍江省自然科學(xué)基金(項(xiàng)目編號(hào)：D200641)。

藍(lán)嵐(1981—)，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：傳染病防控。