利用嗎啉代寡核苷酸技術下調早期斑馬魚胚胎lmna基因的初步研究

劉　豐，黃慧敏,3，王志華，吳西軍，何志旭,3，舒莉萍,4

(1. 貴州醫(yī)科大學免疫學教研室，貴陽，貴州　550004；2. 貴州醫(yī)科大學組織工程與干細胞實驗中心，貴陽，貴州　550004；3. 貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院兒科學教研室，貴陽，貴州　550004；4. 貴州醫(yī)科大學實驗動物中心，貴陽，貴州　550004)

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利用嗎啉代寡核苷酸技術下調早期斑馬魚胚胎lmna基因的初步研究

劉豐1,2，黃慧敏1,2,3，王志華1,2，吳西軍2，何志旭1,2,3，舒莉萍1,2,4

(1. 貴州醫(yī)科大學免疫學教研室，貴陽，貴州550004；2. 貴州醫(yī)科大學組織工程與干細胞實驗中心，貴陽，貴州550004；3. 貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院兒科學教研室，貴陽，貴州550004；4. 貴州醫(yī)科大學實驗動物中心，貴陽，貴州550004)

目的利用嗎啉代寡核苷酸技術建立下調斑馬魚lmna基因的技術方法。方法在斑馬魚lmna基因序列中選擇靶點，設計針對斑馬魚lmna基因的嗎啉代寡核苷酸序列(lmna-MO)，構建能特異指示lmna基因表達的lmna-EGFP-pCS2+重組質粒，并通過顯微注射方式將二者共注射入斑馬魚胚胎中，通過觀察胚胎中綠色熒光表達量反應lmna基因表達量，并通過蛋白質印跡法檢測胚胎中l(wèi)amin蛋白表達量。結果蛋白質印跡法檢測斑馬魚體內lamin蛋白的表達，分別有大小為69 KD和62 KD兩種蛋白表達。設計并構建了lmna-MO和重組質粒lmna-EGFP-pCS2+，單獨注射lmna-EGFP-pCS2+質粒后觀察到從6 hpf到96 hpf胚胎均有綠色熒光蛋白表達；二者共注射后觀察到，與對照組相比，實驗組從6 hpf至30 hpf胚胎中綠色熒光蛋白表達量均不同程度下降或消失；蛋白質印跡實驗結果顯示實驗組胚胎內lamin蛋白表達量明顯下降。表明已成功下調了斑馬魚胚胎lmna基因表達。結論 可通過lmna-MO和重組質粒lmna-EGFP-pCS2+共注射方法下調斑馬魚lmna基因表達，并通過綠色熒光蛋白表達量反映下調效果。該方法可為深入研究人核纖層病提供良好的動物模型。

斑馬魚；lmna；基因下調；嗎啉代寡核苷酸技術

核纖層蛋白(lamins)屬于V型中間纖維蛋白家族(intermediate filament, IF)成員，它是細胞骨架的重要組成部分，可維持核膜正常形態(tài)，同時影響DNA復制、DNA損傷修復和轉錄[1,2]。Lamins及其相關蛋白的突變可導致人核纖層蛋白病，由于lamin A/C幾乎表達于所有的細胞和組織，高度組織特異性和在相同基因不同突變位點導致的疾病的廣泛性相對復雜。盡管國內外已進行大量研究，核纖層蛋白病潛在的分子機制仍亟待解釋[3-6]。

斑馬魚是近年新興的重要模式生物體，其具有體外受精，胚胎透明，與人類基因高度同源，繁殖發(fā)育迅速，成熟快，體積小，可用于高通量大規(guī)模篩選突變型，便于建立疾病模型等優(yōu)點[7,8]。目前較前沿的基因下調方法有嗎啉代寡核苷酸技術，該技術穩(wěn)定且應用廣泛，成本較低，不會被核酸酶所降解，水溶性好，對細胞無毒副作用，并且不會和人工合成的RNA一樣，激活細胞干擾素的分泌，激發(fā)免疫應答，特異性好，是如今廣泛應用于斑馬魚的高效基因下調方法之一[9-10]。

本實驗構建有增強綠色熒光蛋白(EGFP)標記的斑馬魚lmna基因的質粒，并設計靶向斑馬魚lmna基因的嗎啉反義寡核苷酸，利用嗎啉代寡核苷酸技術下調斑馬魚lmna基因的表達。以綠色熒光蛋白表達量作為lmna表達下調的標志，從而建立下調lmna基因表達的斑馬魚動物模型，為核纖層病的深入研究提供動物模型。

1　材料和方法

1.1嗎啉代寡核苷酸序列設計

利用嗎啉代寡核苷酸技術抑制內源性lmna基因的表達。嗎啉代寡核苷酸針對基因編碼起始位點ATG設計，作用于mRNA的翻譯起始位點AUG附近或者AUG上游的5’非編碼區(qū)(untranslation region, UTR)區(qū)域，它與mRNA的結合阻礙了核糖體的翻譯起始復合體向翻譯起始位點的移動，從而導致多肽的合成過程無法起始。由于ATG對于lmna基因的起始翻譯有著至關重要的作用，所以設計嗎啉代寡核苷酸時避開ATG起始區(qū)，于其5’UTR區(qū)設計反義的寡核苷酸，使得外源性mRNA翻譯表達不受影響，如圖1。lmna-MO的靶序列位于lmna基因的5 ’UTR端，control-MO的序列由無意的25個堿基序列組成，結構穩(wěn)定卻不與任何基因的mRNA結合，作為實驗對照組。

圖1　嗎啉代寡核苷酸設計示意圖Fig.1　Illustration of the design of morpholino oligonucleotides

1.2構建lmna-pCS2+質粒

本實驗以不含5’UTR端序列的lmna-pCS2+質粒為模板，設計上游引物包括嗎啉代寡核苷酸序列前后各加一個堿基(共27個)，后加ATG起始密碼子后的20個堿基；根據(jù)pCS2+載體及目的基因選取限制性內切酶，上游引物的5’端選擇加BamHI酶切位點，下游引物的5’端選擇加EcoRI酶切位點，通過PCR法克隆兩端含有合適酶切位點的lmna片段，長度為501 bp。將lmna片段連入pCS2+載體中，構建lmna-pCS2+質粒。

1.3構建lmna-EGFP-pCS2+質粒

該質粒用于嗎啉代寡核苷酸的效能測定，雙酶切EGFP-pCS2+質粒，獲取EGFP片段，將EGFP片段連接入lmna-pCS2+重組質粒中，構建lmna-EGFP-pCS2+重組質粒。

2　結果

2.1蛋白質印跡實驗驗證斑馬魚中l(wèi)mna基因編碼蛋白質的表達

收集野生型斑馬魚胚胎，檢測lmna基因表達蛋白，斑馬魚lmna基因表達的蛋白有兩種，大小分別為69 kDa和62 kDa，β-actin為內參基因，大小為43 kDa，如圖2所示。

圖2　斑馬魚中l(wèi)mna、β-actin 基因編碼蛋白質的表達Fig.2　Expression of the protein of lmna and β-actin gene in zebrafish

2.2lmna-MO及l(fā)mna-EGFP-pCS2+重組質粒構建

本實驗針對lmna5′UTR端的序列設計了一條針對lmna 5′UTR的反義寡核苷酸序列，同時用control-MO作為對照。構建lmna-EGFP-pCS2+質粒，用于lmna-MO測效，檢測是否能有效抑制lmna基因的表達。構建重組質粒的lmna片段主要是含有嗎啉代寡核苷酸靶向的5′UTR序列，將克隆的lmna片段與pCS2+載體通過T4連接酶進行粘性末端連接，構建lmna-pCS2+重組質粒。將EGFP片段插入lmna-pCS2+重組質粒中，構建lmna-EGFP-pCS2+重組質粒。利用PCR法克隆lmna片段，約501 bp，如圖3所示。

將克隆的lmna片段與pCS2+載體通過T4連接酶進行粘性末端連接，構建lmna-pCS2+重組質粒，將重組質粒行測序檢測，測序結果顯示重組質粒中含有嗎啉代寡核苷酸靶向的5′UTR序列，如圖4所示。

構建lmna-pCS2+重組質粒成功之后，還需插入EGFP片段。利用EcoRI和XbaI兩個限制性內切酶雙酶切EGFP-pCS2+重組質粒，得到EGFP片段大小約717 bp，如圖5所示。與lmna-pCS2+重組質粒相連，構建lmna-EGFP-pCS2+重組質粒。EGFP片段不含ATG，連于lmna后，使得EGFP特異性表達于lmna片段之后，可通過熒光顯微下觀察綠色熒光蛋白的表達，即lmna基因的表達。

將酶切獲得的EGFP片段插入lmna-pCS2+重組質粒中，T4連接酶進行粘性末端連接，構建lmna-EGFP-pCS2+重組質粒，將重組質粒測序，結果如圖6所示。

(1: DNA marker Ⅲ，2: lmna PCR產物，3: 空白對照)圖3　斑馬魚lmna基因的PCR產物電泳圖(1: DNA marker Ⅲ; 2: lmna PCR product; 3: Blank)Fig.3　Electrophoresis results of zebrafish lmna gene PCR products

圖4　lmna-pCS2+ 重組質粒測序結果Fig.4　The sequencing result of lmna-pCS2+ plasmid

(1：DNA marker Ⅲ；2：EGFP-pCS2+酶切產物；3：pCS2+酶切產物)圖5　雙酶切電泳圖(EcoRI和XbaI)(1: DNA marker III; 2: EGFP-pCS2+; 3: pCS2+)Fig.5　The electrophoresis shows the results of double digestion with EcoRI and XbaI

圖6　lmna-EGFP-pCS2+重組質粒測序結果Fig.6　The sequencing results of lmna-EGFP-pCS2+ plasmid

(A-G圖分別為不同時相胚胎的白場和熒光圖；H-K：lmna-MO、lmna-EGFP-pCS2+質粒混合注射組)圖7　lmna-MO,lmna-EGFP-pCS2+顯微注射后的熒光表達情況(A-G show the white field and fluorescence photos of different phase embryos; H-K: lmna-MO, lmna-EGFP-pCS2+plasmid co-microinjected group)Fig.7　The fluorescent expression of the lmna-EGFP-pCS2+

2.3野生型斑馬魚胚胎lmna-MO及l(fā)mna-EGFP-pCS2+顯微注射

顯微注射lmna-EGFP-pCS2+質粒入野生型斑馬魚單胚胎期胚胎，熒光顯微鏡下觀察胚胎表達綠色熒光蛋白，可見6 hpf(hours post-fertilization，受精后小時數(shù))開始胚胎中有l(wèi)mna基因廣泛表達，直至72 hpf表達量開始下降，如圖7A-G所示。證實該質粒中EGFP能有效示蹤lmna基因的表達，可用于lmna-MO的效能鑒定。單獨注射lmna-EGFP-pCS2+質粒在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光在不同時期胚胎中泛在表達，而將lmna-MO與lmna-EGFP-pCS2+質粒共注射入野生型斑馬魚單胚胎期胚胎后，各時相胚胎中綠色熒光均消失，即位于綠色熒光蛋白之前的lmna基因表達被下調，如圖7H-K所示。

2.4蛋白質印跡實驗檢測顯示實驗組lamin蛋白表達量下降

采用蛋白質印跡實驗檢測發(fā)現(xiàn)對照組野生型斑馬魚胚胎表達兩種lamin蛋白(即lamins A/C)。實驗組斑馬魚lmna基因mRNA翻譯受阻，蛋白合成出現(xiàn)障礙，與對照組相較，lamin蛋白表達水平明顯降低，如圖8所示。

圖8　核纖層蛋白在斑馬魚體內的表達Fig.8　Expression of lamin protein in the zebrafish

3　討論

核纖層普遍存在于高等動物的真核細胞的細胞核中，主要成分是核纖層蛋白，其向外與內層核膜上的蛋白結合，向內與染色質的特定區(qū)段結合[11,12]。核纖層蛋白除了參與細胞核形狀和大小的維持，還參與DNA的復制、有絲分裂中染色體的重組、細胞信號傳導和細胞凋亡等過程[13]。核纖層蛋白病是由于LMNA基因突變所導致的疾病，目前有180多個LMNA突變型被報道，但具體的發(fā)病機制仍不清楚，還需進一步研究與探討[14-16]。模式生物作為基因功能研究常用對象，其生長發(fā)育過程在長期的進化過程中具有高度的保守性，是研究人類發(fā)育、系統(tǒng)功能、疾病發(fā)生發(fā)展等的重要工具。目前常用的模式生物有大小鼠、斑馬魚、果蠅等，本實驗選用斑馬魚為研究對象，斑馬魚具有胚胎透明、體外發(fā)育、體積小、繁殖率高及魚種發(fā)育遺傳背景清晰等優(yōu)點使其成為研究脊椎動物，特別是研究人類發(fā)育和疾病的模式物種之一[17-19]。

本實驗用蛋白質印跡法檢測斑馬魚中l(wèi)amin蛋白的表達，檢測出兩個蛋白條帶，即lamin A/C。成功構建lmna-EGFP-pCS2+質粒用于嗎啉代寡核苷酸測效。lmna-MO序列位于lmna基因5’UTR端，即位于非編碼區(qū)，通過RT-PCR法不可直接克隆針對5’UTR的lmna片段，故將lmna-pCS2+質粒為模板，設計特異性引物，通過PCR法將5’UTR的非編碼區(qū)片段克隆，并與EGFP片段相連，構建lmna-EGFP-pCS2+質粒，該EGFP片段不含ATG，其與lmna基因片段相連，通過lmna基因片段的ATG端編碼翻譯綠色熒光蛋白，并利用綠色熒光蛋白監(jiān)測lmna基因的表達，用于嗎啉代寡核苷酸測效，由于lmna基因和EGFP均由ATG起始密碼子驅動表達，故在注射后其可在胚胎中泛在表達。lmna-EGFP-pCS2+質粒顯微注射入斑馬魚單細胞期胚胎中，于熒光顯微鏡下直接觀察綠色熒光表達情況，熒光表達從6hpf在全胚胎廣泛表達，至30 hpf時逐漸減少以致72 hpf后完全消失，而共注射組從6 hpf至30 hpf均無綠色熒光蛋白表達，與對照組相比表明lmna-MO特異下調了斑馬魚胚胎中l(wèi)mna基因的表達量；而72 hpf之后熒光蛋白表達的減少則可能由于MO的活性與重組質粒表達效應隨胚胎發(fā)育的下降導致，故lmna-MO可特異下調早期斑馬魚胚胎lmna基因的表達量。

顯微注射法是一種應用于基因功能研究的技術，通過顯微注射相關基因的DNA和mRNA實現(xiàn)特定基因的過表達。利用嗎啉代寡核苷酸技術建立特定基因下調模型，嗎啉反義寡核苷酸(phosphorodiamidate morpholino oligomers，PMO)屬于第三代反義寡核苷酸，是逆向遺傳學技術的一種。嗎啉代寡核苷酸技術的原理基于RNA的五元核糖骨架被含有氮和氧的六元環(huán)替代，并相連于A、T、C、G等堿基。RNA-MO進入細胞后，可以和目的基因mRNA結合，形成RNA-RNA雙鏈，抑制細胞內正常mRNA的剪接過程，從而達到抑制基因表達的目的。嗎啡啉有抑制起始翻譯，減少傳統(tǒng)反義寡核苷酸非特異性的效應，是一種新型反義寡核苷酸，具有良好的穩(wěn)定性、溶解度和細胞滲透性，因此這種雙鏈結構能穩(wěn)定存在于生物體內，抵抗多種核酸酶和蛋白酶，不易降解，易溶于水，能在細胞中存留較長的時間。嗎啉代寡核苷酸可以靶向于目的mRNA，編碼的蛋白質是多樣化的，包括配體、跨膜受體、細胞內的蛋白質和轉錄因子。本實驗設計的嗎啉代寡核苷酸序列與目的基因mRNA 5’翻譯起始序列附近大小為25個堿基序列互補，在目的基因mRNA 5’端形成穩(wěn)定的RNA-RNA雙鏈，通過阻礙mRNA和核糖體的結合而阻斷l(xiāng)mna基因的起始翻譯過程。將lmna-EGFP-pCS2+質粒與特異性的嗎啉代寡核苷酸共注射入斑馬魚單細胞期胚胎中，各時相胚胎中綠色熒光均消失，即位于綠色熒光蛋白之前的lmna基因表達被下調，說明lmna-MO可以有效下調lmna基因的表達。蛋白質印跡實驗結果同樣證實了實驗組斑馬魚lmna基因mRNA翻譯受阻，蛋白合成出現(xiàn)障礙，與對照組相較，lmna蛋白表達水平明顯降低。說明實驗組斑馬魚體內lmna蛋白已被下調。

本實驗成功構建了嗎啉代寡核苷酸技術下調斑馬魚lmna基因表達所需的重組質粒lmna-MO及可用于特異性指示lmna基因下調的重組質粒lmna-EGFP-pCS2+。通過顯微注射的方法將兩者共注射入野生型斑馬魚單細胞期胚胎中，通過綠色熒光蛋白表達量反應lmna基因表達量。成功建立了下調lmna基因的斑馬魚模型，該模型為深入研究人核纖層病提供了良好的動物模型。

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Study on the lmna gene knockdown in zebrafish embryo with morpholino oligonucleotides

LIU Feng1,2，HUANG Hui-min1,3，WANG Zhi-hua1,2，WU Xi-jun2，HE Zhi-xu1,3，SHU Li-ping1,2,4

(1. Guizhou Provincial Key Laboratory for Regenerative Medicine, Stem Cell and Tissue Engineering Research Center and Sino-US Joint Laboratory for Medical Sciences, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, China;2. Department of Immunology, 3. Department of Pediatrics, 4.Laboratory Animal Center,Guizhou Medical University, Guiyang 550004)

ObjectiveLamins are the major components of nuclear lamina underneath the inner nuclear membrane (INM). Lamins express in most cells and are involved in the whole process of growth, also play a major role in cell stability and embryonic development. Mutant in human LMNA gene may lead to a series of disorders, which are similar to progeria or other aging-associate syndrome. In this study, we report a newlmnaknockdown animal model generated in our laboratory in order to provide a useful tool for studying laminopathies. Methods Two plasmids tagged to zebrafishlmnagene were designed based on morpholino oligonucleotides technology. Co-microinjected the plasmids into zebrafish embryos to knockdownlmnagene. Imagining and western blot detection were used to identify the mutants. ResultsTwo different proteins, Lamin A/C, were expressed in the zebrafish embryos. Two plasmidslmna-MOandlmna-EGFP-pCS2+were generated and co-microinjected into embryos. The results of imagining and western blot showed that the expression oflmnagene was downregulated in the zebrafish embryos. ConclusionsLamin A/C are expressed in zebrafish.lmnagene can be knocked down by the injection oflmna-MO andlmna-EGFP-pCS2+. This new animal model may be a powerful tool for study on laminopathies.

Zebrafish;lmna; Gene knockdown; Morpholino oligonucleotides; Laminopathy

國家自然科學基金項目資助(NO.31260284)。

劉豐(1989-)，男，碩士研究生，研究方向：兒童血液系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)疾病。

何志旭，男，博士，教授，研究方向：兒童血液系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)疾病；舒莉萍，女，博士，副教授，研究方向：兒童血液系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)疾病，E-mail: gyslp_456@163.com。

研究報告

R-33

A

1671-7856(2016) 08-0085-06

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.08.014

2016-04-18